米 婷 馮 艷 苑本玲 王 婷 李雪莉 張曉娟，2*

（1.成都師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，四川 成都 611130；2.成都師范學(xué)院食品發(fā)酵研究所，四川 成都 611130）

食品防腐劑主要通過對微生物細(xì)胞亞結(jié)構(gòu)產(chǎn)生不利影響來達(dá)到抑制其生長的目的，可被分為化學(xué)合成防腐劑與天然防腐劑，前者作用效果佳 ，但大多具有富集作用以及潛在的致畸致癌性。天然香辛料是一類芳香植物的根、莖、葉、果實或花蕾等，不僅具有提香、賦味、增進(jìn)食欲的功能，且在食品抑菌防腐方面，具低毒副作用、抗菌譜廣、易獲取、無污染、不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點。

本文選用8 種食用香辛料，對抑菌活性進(jìn)行比較，并進(jìn)行抑菌機理分析，為天然香辛料在食品防腐保鮮中的開發(fā)利用提供理論支持。

1.材料與方法

1.1 材料與儀器

香辛料：大蒜、丁香、花椒、肉桂均購于四川省成都市溫江區(qū)紅旗連鎖超市；白芍購于四川省成都市箐山地道無硫食材店；千佛竹根姜購于四川省閬中市菜市場。

主要培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、LB 培養(yǎng)基。

實驗試劑：堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）測定試劑盒，北京索萊寶科技有限公司。

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-52 上海亞榮生化儀器廠；循環(huán)水式多用真空泵SHB-III 型 蘇州江東精密儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 香辛料提取物的制備

香辛料提取物制備流程如下：

粉碎→浸泡→超聲波提取→離心→真空抽濾→旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮→原液

減壓抽濾后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行濃縮，密封后保存于4℃冰箱中備用。

1.2.2 香辛料的抑菌活性比較

將已活化的菌種用生理鹽水稀釋制成 1×106 CFU/mL 菌懸液。牛津杯內(nèi)加入200 μL 不同香辛料提取物，放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，以無菌水作陰性對照，以30%H2O2作陽性對照。

1.2.3 最小抑菌濃度（MIC）的測定

以大腸桿菌為指示菌，按文獻(xiàn)方法進(jìn)行MIC 的測定。

1.2.4 丁香提取物對大腸桿菌細(xì)胞膜通透性的影響

1.2.4.1 丁香提取物對大腸桿菌培養(yǎng)液總漏出率的影響

將大腸桿菌懸浮于 5 %葡萄糖溶液中，取 8.44 mL，加入丁香提取原液1.56mL，置于恒溫?fù)u床中培養(yǎng)7.5 h，每隔1.5 h，取菌懸液，3000 r/min 下離心8 min，用紫外分光光度計在600 nm 波長下測上清液的吸光值，試驗重復(fù)3 次。對照組不加丁香提取液。

1.2.4.2 丁香提取物對大腸桿菌細(xì)胞膜的損害程度

取 大 腸 桿 菌 LB 培 養(yǎng) 液20 ml，4800 rpm 下 離 心10 min，棄去LB 培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖液洗滌一次，再懸浮于0.02 mol/L、pH 6.6 磷酸鹽緩沖液中，使重懸液在600 nm 下吸光度約為0.65。丁香提取液加入大腸桿菌重懸液中，使丁香提取物的終濃度為5 MIC。置于37℃搖床中培養(yǎng)，間隔45 min 取菌懸液測定260 nm處的吸光度。陰性對照為不添加丁香提取物的磷酸緩沖重懸液，試驗重復(fù)3次。

式中:為含有丁香提取液的試驗組在各取樣時間點的OD 值;為含有丁香提取液的試驗組在0 h 時的OD 值;為陰性對照組在各取樣時間點的OD 值。

1.2.5 丁香提取物對大腸桿菌細(xì)胞壁的影響

每隔1.5 h，4800 r/min 離心10 min 收集上清液。 根據(jù)堿性磷酸酶(AKP) 測定試劑盒的方法步驟測定胞外AKP活性。

2.結(jié)果與分析

2.1 8 種香辛料的抑菌效果比較

由表1 所示，大蒜、丁香、白芍、肉桂的抑菌效果較優(yōu)：丁香對大腸桿菌的抑制作用最強，DIZ 達(dá)23.33±0.29 mm；白胡椒、竹根姜、花椒和辣椒的抑菌強度相對較弱。

表1 8種香辛料對E．coli的抑菌圈（DIZ）大小

2.2 最小抑菌濃度（MIC）的測定

選取抑菌效果較好的丁香、肉桂、大蒜、白芍進(jìn)行MIC 的測定。由圖1 可得，4 種供試香辛料中，丁香對大腸桿菌的抑制效果最好，MIC 為3.125 mg/ml。

圖1 香辛料對大腸桿菌的最小抑制濃度

2.3 丁香提取物對大腸桿菌細(xì)胞膜通透性的影響

2.3.1 丁香提取物對大腸桿菌培養(yǎng)液總漏出率的影響

如圖2 所示，對照組大腸桿菌總漏出率隨時間延長有增加趨勢，但幅度較??；而丁香提取物處理的對照組，大腸桿菌總漏出率與時間呈正相關(guān)，且增幅較對照組顯著，丁香醇提物可破壞細(xì)胞膜的通透性，表現(xiàn)為胞內(nèi)在600 nm 有特征吸收的小分子物質(zhì)外漏。

圖2 丁香提取物對E．coli總漏出率的影響

2.3.2 丁香提取物對大腸桿菌細(xì)胞膜的損害程度

胞內(nèi)的核酸物質(zhì)在260 nm 下有特征吸收，通過測定上清液在260 nm 下的吸光度，運用式ξ 計算得到的比值越大，表明核酸物質(zhì)泄漏量越大，即細(xì)胞膜的損傷程度越大。由圖3 可得，丁香提取物對大腸桿菌細(xì)胞膜有一定程度的損害，且其損害程度隨時間延長而增加，但總體而言，損害性較輕微。

圖3 丁香提取物對E．coli細(xì)胞膜的損害程度

如表2 所示，經(jīng)丁香提取液處理7.5h 后，大腸桿菌總漏出率與對照組的差異顯著，其為對照組的5.54 倍；經(jīng)丁香提取液處理3h 后， 大腸桿菌核酸大分子溶出量是對照組的1.27倍，對照組與處理組之間具有差異的顯著性。

表2 丁香提取液處理后對大腸桿菌胞內(nèi)物的影響

丁香提取物處理后，大腸桿菌菌體細(xì)胞膜受到了一定程度的破壞，細(xì)胞膜通透性增加，進(jìn)而導(dǎo)致部分內(nèi)含物流出、菌體細(xì)胞的生長代謝紊亂，最終抑制細(xì)胞生長。

2.4 丁香提取物對大腸桿菌細(xì)胞壁的影響

從表3 可得，經(jīng)丁香提取液處理7.5 h 后，胞外AKP活力是對照組的8.11 倍，具差異的顯著性；如圖4 所示，試驗組的胞外AKP 活力與時間正相關(guān)，伴隨時間的延長，AKP 活力增強；未經(jīng)過丁香提取物處理的對照組，其上清液AKP 活性較低且趨于穩(wěn)定。由此推之，丁香提取物處理后，大腸桿菌的細(xì)胞壁受到了破壞。

圖4 E．coli胞外AKP酶活力的變化

表3 丁香提取液處理后對E．coli 胞外AKP活力的影響

3.結(jié)論

8 種四川香辛料對大腸桿菌均有不同程度抑制活性，其中大蒜、丁香、白芍、肉桂的抑菌效果更明顯：丁香對E.coli 的抑制作用最強，DIZ 達(dá)23.33±0.29 mm；肉桂和大蒜次之，其DIZ 分別達(dá)21.67±0.29 mm、21.33±0.29 mm；白芍對大腸桿菌的DIZ 為15.73±0.25 mm。白胡椒、竹根姜、花椒和辣椒的抑菌強度相對較弱，抑菌直徑為9.17±0.17 ～13.17±0.29 mm。

經(jīng)5 MIC丁香提取液處理7.5 h后，大腸桿菌總漏出率、胞外AKP 活力與對照組相比均有顯著差異，分別增加了5.54 倍、8.11 倍；經(jīng)5 MIC 丁香提取液處理3 h 后， 大腸桿菌核酸大分子溶出量是對照組的1.27 倍，對照組與處理組之間具有差異的顯著性，丁香提取物能破壞大腸桿菌細(xì)胞膜。