李潤根, 曾慧蘭, 李興杰, 曹雨晴

連作龍牙百合與鐵炮百合根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的差異分析

李潤根, 曾慧蘭, 李興杰, 曹雨晴

宜春學(xué)院生命科學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院園藝系, 江西省作物生長發(fā)育調(diào)控重點實驗室, 江西宜春 336000

對連作龍牙百合(Long)與鐵炮百合(Tie)根際土壤真菌ITS區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增, 并利用Miseq ITS測序分析龍牙百合與鐵炮百合根際土壤真菌群落的結(jié)構(gòu)差異。結(jié)果表明: 測序百合根際土壤共得到69158條Clean Reads, 將其注釋為277個操作分類單元(OTUs), 涵蓋了5門、12綱、23目、25科、34屬、36種; 在Alpha多樣性指數(shù)上, Long的多樣性指數(shù)高于Tie, 但均勻度低于Tie。在Beta多樣性上, 兩種百合間真菌群落結(jié)構(gòu)差異較大; 在門水平子囊菌門、未知菌門、擔(dān)子菌門為百合的優(yōu)勢菌群, 壺菌門為Tie特有。在屬水平青霉菌屬、炭疽菌屬和未知菌屬為兩種百合真菌群落的優(yōu)勢菌屬, 盤菌屬僅出現(xiàn)在忌連作龍牙百合中, 青霉菌屬和炭疽菌屬在耐連作鐵炮百合中含量增加, 未知菌屬含量下降。研究表明, 連作狀態(tài)下不同耐、忌連作百合根際土壤真菌群落存在差異, 且均有特異性的菌群, 研究結(jié)果為減輕或克服百合連作障礙提供一定的理論基礎(chǔ)。

連作; 龍牙百合; 鐵炮百合; 真菌群落結(jié)構(gòu)

0 前言

百合(spp)是百合科百合屬, 具有地下鱗莖的多年生草本植物[1]。中國百合共有48個小種和18個變種。其中鐵炮百合()原產(chǎn)于中國臺灣, 是一種重要的切花材料, 鐵炮百合花朵極香, 富含芳香油, 可用于制作香料, 具有很高的觀賞和經(jīng)濟(jì)價值[2]。龍牙百合(var)鱗莖淀粉含量高達(dá)33%—38%[3], 能夠制成百合粉和百合面[4], 其鱗莖富含蛋白質(zhì)、糖類和礦物質(zhì)[5], 具有很好的食用和藥用價值。近些年來, 隨著人們對百合在食用、藥用和觀賞等方面的價值的認(rèn)識[6], 對百合的需求量也不斷的增加, 百合種植面積不斷擴(kuò)大和模式化的生產(chǎn), 導(dǎo)致百合連作現(xiàn)象非常普遍, 嚴(yán)重制約了百合產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。根據(jù)馬少蘭[7]、陳丹梅[8]、袁龍剛[9]等研究發(fā)現(xiàn), 長期的連作會導(dǎo)致土壤質(zhì)量、產(chǎn)品產(chǎn)量以及病蟲害嚴(yán)重等問題。筆者自2013年開始進(jìn)行食用百合抗病育種和病害防治試驗, 先后在江西萬載百合基地和我校實驗基地發(fā)現(xiàn), 鐵炮百合一次播種, 可連續(xù)生長2—3年, 土傳病害輕且生長良好,表現(xiàn)出耐連作特性, 而龍牙百合連作則枯萎病等土傳病害嚴(yán)重發(fā)生, 連作障礙嚴(yán)重。

真菌作為根際土壤微生物的重要成員, 根際土壤中的真菌與其他微生物共同參與土壤生態(tài)系統(tǒng)中物質(zhì)的循環(huán)和能量的流動[10]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn), 土壤微生物群落受到連作的影響, 特別是隨著連作年限的增加, 真菌病原體增加和有益真菌群落的簡化很可能是造成作物生長和單產(chǎn)下降的因素[11]。因此研究根際土壤真菌群落多樣性及變化規(guī)律, 對于研究土壤可持續(xù)利用措施和保持土壤健康極其重要。本研究利用高通量測序技術(shù)對不同耐、忌連作百合品種間的真菌群落進(jìn)行差異分析, 為利用生物防治來減輕百合連作障礙提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2019年7月, 從江西省宜春市宜春學(xué)院蔬菜基地內(nèi)連作相同年限的百合根際土壤中取樣。按照五點取樣法采集, 采集后置于無菌帶內(nèi)帶回實驗室于-80 ℃保存?zhèn)溆谩Ｔ囼灥氐耐寥罓顩r, 田間管理方式一致。百合品種分別為忌連作龍牙百合與耐連作鐵炮百合, 分別標(biāo)記為Long、Tie。

1.2 土壤根際DNA提取、擴(kuò)增

龍牙百合和鐵炮百合根際土壤土樣微生物DNA的提取按照MP公司土壤微生物DNA提取試劑盒(Fast DNA SPIN Kit for soil)(MP, California, USA)的使用說明加以改進(jìn)后提取[12]。提取DNA后, 用真菌ITS引物ITS1F(CTTGGTCATTTAGAGGAA GTAA)和ITSR2(GCTGCGTTCTTCATCGATGC)進(jìn)行擴(kuò)增, PCR正式試驗采用TransGen AP221-02: TransStartFastpfu。擴(kuò)增體系為20 μL, 擴(kuò)增后取3 μL利用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。

1.3 數(shù)據(jù)處理

根際土壤真菌多樣性由上海伯豪生物技術(shù)有限公司測定。利用Illumina (Miseq)平臺對Long和Tie進(jìn)行ITS測序及分析.優(yōu)化序列分析對Illumina平臺測序所得到數(shù)據(jù)進(jìn)行reads拼接, 質(zhì)控過濾后, 根據(jù)序列首尾兩端的barcode和引物序列區(qū)分樣本得到有效序列, 然后校正序列方向, 并對測序結(jié)果進(jìn)行歸類操作, 采用RDP classifer葉貝斯算法在97%相似水平下將不同樣本的優(yōu)化序列分類, 進(jìn)行OUT生物信息統(tǒng)計分析。稀釋曲線、venn圖、heatmap圖等分析結(jié)果在R軟件和Excel中繪制和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 連作龍牙百合與鐵炮百合根際土壤真菌群落OUT組成及結(jié)構(gòu)

如表1所示, 在Long、Tie處理的土壤中, 共得到69158 條有效序列, 序列平均長度為295.6 bp, 其中Long和Tie真菌ITS有效序列數(shù)分別為25995、43163。本實驗將相似性大于97%的Clean reads歸為一個操作分類單元, 得到277 個操作分類單元(OTUs)。如圖1所示,分別代表145和132種真菌(OTUs), 其中共有的0TUs數(shù)為36, Long和Tie特有的OTUs分別為109和96。說明連作龍牙百合真菌群落物種豐富度高于鐵炮百合。經(jīng)Silva(Release123: http://www.arb-silva.de)數(shù)據(jù)庫比對, 共得到5 門、12 綱、23 目、25 科、34 屬、36 種。

隨機(jī)選取測序樣本中的ITS讀數(shù)(reads), 以真菌屬(種)數(shù)(OTUs)為縱坐標(biāo), ITS讀數(shù)為橫坐標(biāo), 獲得稀釋曲線。如圖2所示, 抽樣讀數(shù)在10000以下時, 真菌屬(種)數(shù)迅速增加; 讀數(shù)10000—20000之間, 真菌屬(種)數(shù)緩慢增加; 讀數(shù)在20000之后, 真菌屬(種)數(shù)趨于平緩, 說明不同土壤樣品所測的序列數(shù)能夠較好地反映真菌群落種類數(shù)量, 測序數(shù)據(jù)合理。

表1 結(jié)果統(tǒng)計

注: 1、2代表樣品重復(fù)的次數(shù)。

2.2 連作龍牙百合與鐵炮百合根際土壤真菌Alpha多樣性分析

真菌群落的豐富度用Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)表示, 其值越高則說明群落物種豐富度越高, 真菌群落的多樣性指數(shù)用Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)表示, Shaonnon指數(shù)越高表明群落物種的多樣性越高, Simpson指數(shù)反映了物種的優(yōu)勢度.根據(jù)ITS測序結(jié)果, 統(tǒng)計兩個樣品中真菌群落多樣性的各項指數(shù)(表2), 結(jié)果表明, 所建立真菌文庫的覆蓋率均達(dá)0.99以上, 因此此結(jié)果可以真實有效地反映樣本中真菌多樣性。Long根際土壤中真菌Shannon、Chao高于Tie; Simpson低于Tie; Ace指數(shù)無明顯差異?？梢? 耐連作鐵炮百合能夠提高根際土壤真菌群落的優(yōu)勢度, 而使群落的物種豐富度降低。

圖1 連作龍牙百合與鐵炮百合根際土壤真菌群落VENN圖

Figure 1 Venn diagram of rhizosphere soil fungal community in continuous croppingandvar

圖2 連作龍牙百合與鐵炮百合根際真菌群落稀釋曲線

Figure 2 The dilution curve of continuous croppingandvar

2.3 連作龍牙百合與鐵炮百合根際土壤真菌不同分類水平上組分分析

2.3.1 樣本中菌群數(shù)在門水平上的比較

根據(jù)兩種不同耐、忌連作百合根際土壤樣品中的真菌群落分析發(fā)現(xiàn), 在門水平上的真菌群落主要為子囊菌門(Ascomycota)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota)、接合菌門(Zygomycota)和未知菌門(Other), 其中子囊菌門在門水平上是主要的優(yōu)勢群落, 其占比為73.04%—90.54%。如圖3所示, 龍牙百合中的優(yōu)勢菌屬(相對豐度大于1%)為子囊菌門、未知菌門; 鐵炮百合的優(yōu)勢菌屬(相對豐度大于1%)為子囊菌門、擔(dān)子菌門?？梢缘贸? 耐連作鐵炮百合提高了根際土壤中子囊菌門、擔(dān)子菌門和接合菌門的相對豐度, 降低了根際土壤中未知菌屬的相對豐度, 且出現(xiàn)了一個新的門類: 壺菌門(Chytri-diomycota)。

2.3.2 樣本中菌群數(shù)在屬水平的比較

在屬水平上為更直接地顯示Long和Tie樣本中真菌類群的相似性和差異, 根據(jù)所有樣本在屬水平的物種注釋及豐度信息, 繪制成熱圖(圖4)。結(jié)果表明, 龍牙百合與鐵炮百合有34 屬, 共有11 屬, Long和Tie分別有26 屬、19 屬。真菌群落主要集中在青霉屬、未知菌屬。

表2 連作龍牙百合與鐵炮百合根際土壤真菌多樣性指數(shù)

圖3 連作龍牙百合與鐵炮百合根際土壤真菌群落在門水平上的相對豐度圖

Figure 3 The relative abundances of rhizosphere soil fungal community in continuous croppingandvar at phylum level

將占比大于0.01%的歸為優(yōu)勢菌群, 百合根際真菌群落在屬水平上的優(yōu)勢群落為: 青霉屬()、其他、盤菌屬()、炭疽菌()、被孢霉屬()、曲霉屬()、未辨別菌屬(uni-dentified)、、毛殼菌屬()、杯梗孢屬()、嗜熱真菌屬()、、節(jié)枝孢屬()、嗜熱鏈球菌屬()、彎孢屬()、、葡萄穗霉屬()、鬼傘屬()、小囊菌屬()。然而在不同抗性百合中各優(yōu)勢菌豐度不盡相同, 其中節(jié)枝孢屬(0.0288%)和(0.0144%)、小囊菌屬(0.0144%)在樣本間變化明顯, 只在連作鐵炮百合中出現(xiàn), 說明耐連作鐵炮百合更有利于其生長。而盤菌屬(19.46%)、(0.0192%)、毛殼菌屬(0.1631%)、嗜熱真菌屬(0.0815%)、彎孢屬(0.0336%)、葡萄穗霉屬(0.0144%)只出現(xiàn)在龍牙百合中。耐連作鐵炮百合提高了根際土壤青霉菌屬和炭疽菌屬、、被孢霉屬的相對豐度, 降低了其他、曲霉屬、肉座菌屬、未辨別菌屬、杯梗孢屬、嗜熱鏈球菌屬的相對豐度.通過分析發(fā)現(xiàn), 在屬水平上的主要優(yōu)勢菌落的分布于綱水平基本一致, 最為重要的菌群是青霉菌屬(48.94%—86.43%)、未知菌屬(11.34%—29.02%)、盤菌屬(19.46%)和炭疽菌屬(1.669%—1.837%)。此外, 引起百合病害中最普遍、最嚴(yán)重的枯萎病病原菌鐮刀菌屬也在龍牙百合中檢出, 但其相對豐度較低(<0.01%)。

2.4 連作龍牙百合與鐵炮百合根際土壤真菌群落Beta多樣性分析

基于OUT的連作龍牙百合與鐵炮百合根際土壤真菌群落主成分分析(Principal Component Analysis, PCA)如圖5所示, PC1和PC2分別表示不同群落間55.97%和28.23%的變異差異度, 兩者累計貢獻(xiàn)率達(dá)84.2%, 解釋了大部分變量, 比較具有代表性.PC1和PC2將Long和Tie明顯區(qū)分開來, 位于圖5中的不同位置并且兩者的距離較遠(yuǎn), Long位于第三象限, Tie位于第二象限, 說明不同耐、忌連作百合對根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)影響較大。

圖4 連作龍牙百合與鐵炮百合根際土壤真菌群落在屬水平上的HEATMAP圖

Figure 4 Heatmap of rhizosphere soil fungal community in continuous croppingandvar at genus level

圖5 連作龍牙百合與鐵炮百合根際土壤真菌群落PCA分析圖

Figure 5 PCA analysis of rhizosphere soil fungal community in continuous croppingandvar

3 討論與結(jié)論

大量研究顯示, 相同植物的不同品種間根際微生物在數(shù)量和組成上存在著一定的差異[13-14]。本研究結(jié)果表明, 鐵炮百合降低了根際土壤真菌群落的多樣性提高了特異性物種的優(yōu)勢度, 這一結(jié)果與田晴[15]、楊光柱[16]、周陽[17]等研究結(jié)果相似, 在有利于作物生長條件下能使真菌總數(shù)量和多樣性指數(shù)降低。

基于高通量測序技術(shù)分析發(fā)現(xiàn), 在門水平上, 百合根際土壤中的優(yōu)勢菌群為子囊菌門、擔(dān)子菌門和未知菌門, 其中子囊菌門在根際真菌群落中占絕對優(yōu)勢, 且在耐連作鐵炮百合中出現(xiàn)了特異性真菌群落: 壺菌門, 這與前人研究西瓜[15]、蘋果[16]、水稻[17]、柑橘[18]研究結(jié)果一致。

在屬水平上, 連作鐵炮百合提高了青霉菌屬、炭疽菌屬和被孢霉屬的含量, 而降低了曲霉屬的含量。青霉屬在龍牙百合和鐵炮百合中占比為48.94%、86.43%, 是連作百合中的最優(yōu)菌屬, 而對百合影響最嚴(yán)重的鐮刀屬的相對豐度較低, 且在耐連作鐵炮百合中未檢測出, 這可能與青霉屬能抑制鐮刀屬的生長有關(guān)[19], 也可能與試驗地長期使用農(nóng)藥有關(guān), 這一結(jié)果也與StraathofT P[20]和李潤根[21]等研究表明鐵炮百合比龍牙百合更抗枯萎病的結(jié)果一致。但青霉屬中擴(kuò)展青霉也能引起百合青霉病, 仇碩[22]通過SA、JA等生長調(diào)節(jié)物質(zhì)提高了龍牙百合抵抗青霉病的能力。另一種優(yōu)勢菌屬為炭疽菌屬, 能引起百合炭疽病且在江西各產(chǎn)地均有發(fā)生[23], 本研究中, 耐連作鐵炮百合炭疽菌屬的相對豐度比龍牙百合高0.17%, 這一結(jié)果與唐祥寧[24]研究一致。根據(jù)木霉菌可寄生炭疽菌屬這一生物學(xué)特性[25], 可選取木霉菌作為生防菌來減輕百合的連作障礙, 但如何通過木霉菌來防制百合病害還需要進(jìn)一步研究。鐵炮百合中曲霉屬的含量比龍牙百合降低了0.024%, 使鐵炮百合在百合曲霉病方面抗性比龍牙百合強(qiáng)[24]。被孢霉屬屬于接合菌門被孢霉科, 它能利用土壤中的糖分以及通過利用多糖物質(zhì)生長代謝分解纖維素、半纖維素, 提高土壤中含碳養(yǎng)分和有機(jī)質(zhì)的含量, 還具有分解土壤中磷的功能, 因此它被認(rèn)為是土壤中的有益微生物, 被孢霉屬在兩種百合中都存在, 但在鐵炮百合中含量較高。

另外, 節(jié)枝孢屬、小囊菌屬和角擔(dān)菌屬為鐵炮百合特有菌屬。根據(jù)閆凝星等[26]對節(jié)枝孢屬的次級代謝產(chǎn)物分析發(fā)現(xiàn)它能夠抑制稻瘟霉并且有較好地細(xì)胞毒活性和較強(qiáng)的抗氧化活性; 小囊菌屬是一種粘細(xì)菌, 它具有抗真菌的特性[27]; 角擔(dān)菌屬中含有藍(lán)莓[28]、蘭花[29]的菌根真菌和植物土傳病害的生防菌[30], 菌根可以提高植物吸收水分和養(yǎng)分的能力[31], 它不僅提高了植物的抗病性和土壤適應(yīng)性促進(jìn)植物的生長, 而且還改善了土壤的理化性質(zhì)[32]。以上分析結(jié)果都顯示, 鐵炮百合耐連作而龍牙百合忌連作。

忌連作龍牙百合中存在一些特有的病原菌屬, 如彎孢屬[33]、葡萄穗霉屬[34], 但同時也含有一些特有的生防菌, 如毛殼菌屬[35], 毛殼菌屬具有降解纖維素的能力, 被廣泛應(yīng)用于植物病原體的生物防治, 這可能與土壤微生態(tài)系統(tǒng)應(yīng)答病原菌有關(guān), 更多的病原菌刺激了更多的青霉屬和毛殼菌屬的出現(xiàn), 然而這些生防菌對克服百合病害病原菌的效果還需要進(jìn)一步研究。

總之, 在連作相同年限的情況下, 耐連作鐵炮百合與忌連作龍牙百合根際土壤真菌群落存在差異, 與耐連作鐵炮百合相比, 忌連作龍牙百合的根際土壤真菌群落多樣性提高, 一些病原菌微小的變化可能也會使真菌種群失去平衡, 進(jìn)而導(dǎo)致龍牙百合易感染病害。此外, 連作百合根際土壤中也存在青霉屬、毛殼菌屬等具有生防潛能的真菌, 但是如何利用這些生防菌來解決百合的連作障礙還需要進(jìn)一步的研究。

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Differences of rhizosphere soil fungi betweenvar andin continuous cropping

LI Rungen, ZENG Huilan, LI Xingjie, CAO Yuqing

Jiangxi Key Laboratory of Crop Growth Regulation/College of Life Science Environment and Resource, Yichun University, Yichun 336000, Jiangxi, China

The ITS regions of rhizosphere soil fungi in the continuous crops ofvar(Long) and(Tie) were amplified, and Miseq ITS sequencing was used to analyze the structural differences of the rhizosphere soil fungal communities invarand. The results show that a total of 69158 clean reads are obtained by sequencing lily rhizosphere soil and annotated as 277 operational taxonomic units (OTUs), covering 5 phylums, 12 classes, 23 orders, 25 families, 34 genus, 36 species. In the Alpha diversity index, Long diversity index is higher than Tie, but the uniformity is lower than Tie. In Beta diversity, the fungal community structure between the two lilies is quite different. At the phylum level, the predominant flora of lily is Ascomycota, Unknown and Basidiomycota, Chytridiomycota is unique to Tie. At the genus level, Penicillium, Colletotrichum and Unknown fungi are the dominant genus of two lilies, and Peziza only appears in botanicvar, the content of Penicillium and Colletotrichum is increased in resistant to the, and the content of unknown fungal declines.There are differences in rhizosphere soil fungal communities of different tolerant, bogey continuous lilies under continuous cropping, and all of them have specific flora. The results provide a theoretical basis for reducing or overcoming the obstacles of lily continuous cropping.

continuous cropping;var;; fungal community structure

10.14108/j.cnki.1008-8873.2022.04.022

S154.36

A

1008-8873(2022)04-189-07

2020-06-18;

2020-09-02

江西省科技計劃項目(20161BBF60040); 江西省教育廳科技計劃項目(160132)

李潤根(1966—), 男, 江西新余人, 教授, 主要從事蔬菜栽培及克服連作障礙技術(shù)研究, E-mail: 13507058200@163.com

李潤根, 曾慧蘭, 李興杰, 等. 連作龍牙百合與鐵炮百合根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的差異分析[J]. 生態(tài)科學(xué), 2022, 41(4): 189–195.

LI Rungen, ZENG Huilan, LI Xingjie, et al. Differences of rhizosphere soil fungi betweenandin continuous cropping[J]. Ecological Science, 2022, 41(4): 189–195.