王雪嬌，田東梅，廖海霞，李亨利，尹欣，朱明輝

(1.成都中醫(yī)藥大學醫(yī)學與生命科學學院/附屬生殖婦幼醫(yī)院，四川 成都 611137；2.成都西囡婦科醫(yī)院， 四川 成都 611137)

0 引言

京尼平是中藥杜仲分離出的一種重要成分，既往研究表明，其作用有：保肝利膽、抗炎、抗氧化，抗血栓、抗腫瘤以及抗抑郁等作用，同時也可以用于治療糖尿病、癌癥以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病等作用[1-3]。Tao Zuo[4]等研究表明京尼平可以通過有效的抑制大部分白細胞介素(IL-6，IL-8，IL-10，IL-1?)的產(chǎn)生，從而達到減少KGN 細胞株凋亡以及減輕氧化應激造成的損傷的作用，同時也可減少多囊卵巢綜合征患者的炎癥損傷。

在婦產(chǎn)科領(lǐng)域，氧化應激對人類的生殖過程有負面影響，隨著女性年齡的增加，卵母細胞逐漸衰老加快，其抗氧化的能力也隨之下降，易導致卵母細胞減數(shù)分裂過程發(fā)生異常，如染色體分離障礙，這導致形成非整倍體胚胎，從兒發(fā)生反復種植失敗及反復流產(chǎn)。目前臨床上能使用的抗氧化劑較少，既往大部分研究均在模擬氧化應激狀態(tài)下探討京尼平的抗炎及抗氧化作用，在非氧化應激模型下，京尼平是否也有較好的抗炎癥因子分泌功能尚不明確，故本實驗討論了在非氧化應激狀態(tài)下京尼平對KGN 細胞的分泌功能的影響及可能的調(diào)節(jié)通路，以期為臨床使用京尼平提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

KGN細胞株、京尼平 (Cayman)、胎牛血清(gibco)、DMEM/F12 培養(yǎng)基(gibco)、胰酶(gibco)、雙抗(碧云天)、DMSO(Sigma)、BCA 蛋白濃度測定試劑盒(碧云天)、HSD17B2 抗體(affinity)、CYP19A1 抗體(affinity)、CYP17A1 抗體(proteintech)、UCP2 抗體(proteintech)、生物素化山羊抗兔IgG(H+L)(英國abcam--艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司)；Human IL-1βELISA KIT、Human IL-6 ELISA KIT、Human E ELISA KIT、Human IL-4 ELISA KIT、Human IL-5 ELISA KIT、Human P ELISA KIT(上海茁彩生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 KGN 細胞株的培養(yǎng)

培養(yǎng)液使用10%胎牛血清+1%雙抗的DMEM/F-12，將KGN 細胞常規(guī)培養(yǎng)在37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中。

1.2.2 實驗分組及干預方式

分為實驗組和空白對照組，實驗組分別加入濃度為0.05μmol/L, 0.1μmol/L, 0.2μmol/L, 0.3μmol/L的京尼平干預，對照組為5/1000DMSO。

1.2.3 ELISA 檢 測 上 清 液 中IL-6,IL-1β、IL-4、IL-5、E2、P 含量

根據(jù)酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)試劑盒說明書方法測定各組細胞上清液中的IL-1β、IL-6 和IL-4、IL-5、E2、P 因子含量。

1.2.4 Western blot 檢測蛋白表達

復蘇后的KGN 細胞被接種到培養(yǎng)皿中，常規(guī)培養(yǎng)24 h 后，顯微鏡下觀察細胞密度達到70%~80%，進行分組實驗，收集各組細胞獲得總蛋白，BCA 蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，每孔以40μg 樣品上樣進行SDS-PAGE，采用濕法進行Western blot 轉(zhuǎn)膜 (PVDF 膜) 1 h，5%脫脂奶粉封閉2 h，加入I 抗 (HSD17B2、CYP19A1、CYP17A1、UCP2 濃度為1 ∶500~1 ∶1 000，β-actin 濃度為1 ∶5 000)，4℃孵育過夜，Ⅱ抗37℃孵育1 h, ECL化學顯色，image J 軟件分析蛋白表達水平。

1.3 統(tǒng)計學處理

運用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件進行分析。數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示。在方差齊性檢驗的基礎(chǔ)上行方差分析，并用SNK-q 檢驗行各組均數(shù)間的兩兩比較。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

1.4 結(jié)果

1.4.1 添加京尼平對KGN 細胞培養(yǎng)上清液中IL-6，IL-1β、IL-4、IL-5、E2、P 含量的影響

1.4.1.1 與對照組相比，添加京尼平后，隨著京尼平濃度的增加，上清液中雌激素、孕激素分泌量逐漸減少，且差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，具體如圖1。

圖1

表1 不同濃度京尼平干預KGN 細胞株后IL-6,IL-1β、IL-4、IL-5、E2、P 分泌(±s)

表1 不同濃度京尼平干預KGN 細胞株后IL-6,IL-1β、IL-4、IL-5、E2、P 分泌(±s)

注：Ctrl 組為對照組，0.05 為京尼平0.05mmol/L，0.1 為京尼平0.1mmol/L，0.2 為京尼平0.2mmol/L，0.3 為京尼平0.3mmol/L 。

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1.4.1.2 添加京尼平后，培養(yǎng)基上清液中的IL-6,IL-1β 較對照組相比均無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)，IL-4、IL-5 含量隨著京尼平濃度的上升，其分泌量逐漸減少，其中IL-4 的分泌量每組均較對照組差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01),IL-5 的分泌量僅高濃度組(京尼平濃度≥0.2mmol/L)差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。具體如圖2 所示。

圖2

1.4.2 京尼平對KGN 細胞HSD17B2、CYP19A1、CYP17A1、UCP2 蛋白水平的影響

不同濃度京尼平(0、0.05mmol/L、0.1mmol/L、0.2mmol/L、0.3mmol/L)加入培養(yǎng)基中，對KGN 細胞株干預24 小時后提取細胞總蛋白，檢測CYP17A1、CYP19A1、HSD17B2、UCP2 蛋白表達，結(jié)果如下：隨著京尼平濃度的增加，CYP17A1 及HSD17B2 的表達量與對照組比較呈逐步上升趨勢，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；CYP19A1 及UCP2 蛋白的表達實驗組與對照組相比在京尼平濃度為0.2mmol/L 時表達量最高(P＜0.01)。

2 討論

哺乳動物卵巢中最大的細胞群是顆粒細胞群，其在卵巢激素的合成、以及卵泡液的產(chǎn)生、甚至是在卵母細胞間的信息交換、卵母細胞的生長發(fā)育和成熟等方面都起著極其重要的作用，臨床上取卵后收集的顆粒細胞均已黃素化，本身培養(yǎng)極其困難，且不能傳代，而KGN 細胞株具有易培養(yǎng)，易傳代等好處，且能模擬正常人顆粒細胞的大部分生理活性，比如激素合成、凋亡調(diào)節(jié)、表達FSHR 等，被認為是研究人顆粒細胞最佳模型[5]，故本實驗采用KGN 細胞株進行相關(guān)研究。

圖3 不濃度京尼平干預KGN 細胞株24h 后CYP17A1、CYP19A1、17β-HSD2、UCP2 蛋白表達

2.1 京尼平對KGN 細胞株分泌雌孕激素功能的影響

本實驗結(jié)果提示添加京尼平干預KGN 細胞株后，其E2 及P 分泌量的多少與京尼平濃度呈反比。既往較多研究均認為在輔助生殖中添加雌孕激素對患者有較大的益處，陳某的研究顯示[6]ART 患者在接受GnRH-ant 方案時，補充E2 可提高胚胎植入率，張某等[7]文獻總結(jié)提示經(jīng)口服避孕藥和E2 預處理后可改善輔助生殖中促排卵的效果。呂某某等認為[8]促排卵過程中，高水平孕激素的添加能有效抑制LH 峰，且卵子的成熟數(shù)量和質(zhì)量并不會受高水平孕激素影響，因此，認為此種誘導排卵方式或許可以降低卵巢過度刺激綜合征的發(fā)生率，高孕激素狀態(tài)下促排卵方案不失為一種輔助生殖的新方案和新選擇，對于需要生殖力保存患者有重要意義。筆者認為，目前京尼平對雌孕激素分泌機制影響的研究甚少，故在臨床中針對無明顯氧化應激的患者，京尼平的療效還有待進一步研究。

2.2 京尼平對KGN 細胞株分泌雌孕激素相關(guān)蛋白的影響

17β-HSDs 是一種氧化還原酶，在雌、孕激素合成中發(fā)揮重要作用，在生殖系統(tǒng)中擁有重要調(diào)節(jié)功能，同時還具有氧化和還原活性，對類固醇激素含量也有一定的影響[9]。17β-HSD2 是17β-HSDs 的一種亞型，主要存在于人體的肝臟、乳腺、以及分泌期子宮內(nèi)膜、胎盤、腎臟中[10]；活性的17β-HSDs 可被其轉(zhuǎn)化成低活性酮類固醇，17β-HSD2 還可降低E2 和雄激素活性[11,12]。孕激素經(jīng)可轉(zhuǎn)化成雌激素，而KGN 細胞株不分泌雌激素，本實驗中雌激素水平下降后孕激素分泌也隨之下降，與17β-HSD 逐步增加結(jié)果一致。

CYP17A1 是一種多功能酶，具有裂解酶和羥化酶兩種活性，催化生成所有內(nèi)源性雄激素。在本實驗中，隨著京尼平濃度的增加，CYP17A1 的蛋白表達量也同步增加，與左濤[13]等研究高濃度京尼 平0.05mmol/L) 促 進17β-HSDs 和CYP17A1 表達增加實驗結(jié)果較一致。而本實驗CYP19A1 的表達量與京尼平濃度無明顯相關(guān)性，僅提示在較高濃度(0.2mmol/L)時表達量增加，CYP19A1 是激素轉(zhuǎn)化和合成的關(guān)鍵酶之一，睪酮和雄烯二酮轉(zhuǎn)變成雌二醇，以及排卵前卵巢合成類固醇激素的關(guān)鍵酶均是CYP19A1，因此關(guān)于雌孕激素的分泌與CYP19A1 的關(guān)系可進行進一步探究。

UCP2 能調(diào)節(jié)線粒體膜電位和能量代謝。主要分布在肝臟、腎臟、免疫細胞、腦、中樞神經(jīng)系統(tǒng)和脂肪細胞等組織中；線粒體代謝在人卵巢功能中有重要意義，研究發(fā)現(xiàn)人卵巢顆粒細胞有UCP2 蛋白的表達[18]，認為UCP2 也可參與調(diào)節(jié)卵細胞生長、發(fā)育及成熟[19]。Ge H[20]等研究表明UCP2 被抑制后卵泡細胞合成孕激素下降。本研究中UCP2 的表達與京尼平的濃度改變呈拋物線型改變，在濃度為0.2mmol/L 時表達量最高，與孕激素的改變無明顯相關(guān)性，故筆者認為UCP2 的表達是否與孕激素分泌調(diào)劑有關(guān)還存在爭議，可進一步探究。

2.3 京尼平對炎癥因子的影響

本實驗的結(jié)果顯示，IL-6，IL-1β 較對照組相比差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，但隨著京尼平濃度增加，炎癥因子IL-4 及IL-5 的濃度逐漸降低，且差異有統(tǒng)計學意義，進一步證明了京尼平的抗炎作用。不同的輔助性T 細胞和細胞因子可以由輔助性T 淋巴細胞分化而來。Th2 可分泌IL-4、IL-5、IL-6 等細胞因子，其中IL-4 具有免疫調(diào)節(jié)多效性，IL-5 具有促進炎癥反應的作用[14]。有研究表明IL-4 能促進B 細胞增殖，抑制Th1 細胞因子的分泌，提高機體免疫耐受能力，對維持妊娠有著重要意義[15,16]。而不良妊娠結(jié)局常常與Th1 細胞因子增多(IL-2、IFN-γ)和Th2 細胞因子(IL-4、IL-5、IL-6)的降低有關(guān)[17]。

3 結(jié)論

在非炎性狀態(tài)下，京尼平可以明顯降低炎癥因子IL-4，IL-5 的分泌，但對IL-6，IL-1β 分泌無明顯影響，進一步證實了其抗炎作用。但隨著京尼平濃度的增加，對雌孕激素的分泌有一定的抑制作用。