任旻，鄒挺，朱云祥

(1.揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225000；2.揚(yáng)州大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇 揚(yáng)州 225000)

0 引言

近些年來(lái)，隨著國(guó)人生活方式、飲食、環(huán)境的多方面的變化，結(jié)直腸癌的發(fā)病率和致死率在逐年升高[1]?，F(xiàn)在已經(jīng)是除胃癌外最常見的消化道腫瘤，根據(jù)研究中國(guó)惡性腫瘤相關(guān)粗發(fā)病率和死亡率，結(jié)直腸癌可位于前5 位，且出現(xiàn)年輕化趨勢(shì)[2]。發(fā)病隱匿是早期結(jié)直腸癌的發(fā)病特點(diǎn)，使很多患者錯(cuò)過了最佳手術(shù)期，導(dǎo)致結(jié)直腸癌患者的5 年生存率低、預(yù)后差[3]。目前證明CEA、CA19-9、CA242 及CA125 等腫瘤標(biāo)記物與結(jié)直腸腫瘤預(yù)后相關(guān)，但仍有相關(guān)局限性[4]。因此需要尋找新的、有意義的、和預(yù)后相關(guān)更直接的預(yù)后腫瘤標(biāo)記物。

1976 年首次在類病毒中首次發(fā)現(xiàn)環(huán)狀RNA (circRNAs)，但當(dāng)時(shí)只是被認(rèn)為是實(shí)驗(yàn)的錯(cuò)誤產(chǎn)物[5]。目前發(fā)現(xiàn)circRNA 是一類非編碼RNA，該種RNA特點(diǎn)是以共價(jià)閉合的環(huán)狀結(jié)構(gòu)替代5’帽子和3’尾端的多聚腺苷酸尾結(jié)構(gòu)，并且結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，不易被核酸外切酶降解[6]。近年來(lái)通過研究發(fā)現(xiàn)circRNA 作為分子標(biāo)記物在許多腫瘤發(fā)生、進(jìn)展及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要調(diào)控作用[7,8]。且多項(xiàng)研究表明circRNA 的高表達(dá)與結(jié)直腸癌預(yù)后不良有相關(guān)性，但缺乏相應(yīng)循證學(xué)證據(jù)，本研究通過采用 Meta 分析的方式對(duì)現(xiàn)已發(fā)表的結(jié)直腸癌患者circRNA 的表達(dá)水平與患者臨床特征及預(yù)后關(guān)系的研究進(jìn)行分析。

1 資料與方法

1.1 檢索策略

通過計(jì)算機(jī)檢索中國(guó)知網(wǎng)(CNKI)、萬(wàn)方數(shù)據(jù)庫(kù)、維普數(shù)據(jù)庫(kù)以及外文相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)：PubMed、Embase、The Cochrane Library、Web of Science。檢索時(shí)間截止為2021 年10 月。采用主題詞和自由詞結(jié)合的方法作為本次檢索策略，中文檢索詞為：結(jié)直腸癌、環(huán)狀RNA 等。外文檢索詞為：“RNA, Circular”、circRNAs、“Closed Circular RNA”“CircularRNA”“Circular Intronic RNA”“Colorectal Neoplasms”“Colorectal Tumor”“Neoplasm, Colorectal”“Colorectal Cancer”“Colorectal Carcinoma”等。以PubMed 為例，搜索策略見框1。

框1 PubMed 搜索策略

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn)

①經(jīng)過病理學(xué)確診的結(jié)直腸癌；②涉及circRNA 與結(jié)直腸癌患者術(shù)后總生存率(overall survival OS)的相關(guān)性，并且可以通過直接或間接方法提取風(fēng)險(xiǎn)比值(hazardratio HR)和95%可信區(qū)間(95%CI)的研究；③預(yù)后觀察指標(biāo)采用OS 描述；④文獻(xiàn)中包括相關(guān)臨床病理特征(比如樣本數(shù)、姓名、性別、臨床分期、分化程度、是否發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等)資料；⑤文獻(xiàn)語(yǔ)言為中、英文。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn)

①研究目的與結(jié)直腸癌患者預(yù)后不相關(guān)的文章，且取材為非組織、血漿、外周血中circRNA，；②重復(fù)發(fā)表的文獻(xiàn)；③摘要、綜述、病例報(bào)道、薈萃分析；④結(jié)局指標(biāo)與納入不同或無(wú)法從文中提取結(jié)局指標(biāo)的文獻(xiàn)；⑤無(wú)法獲得全文的文獻(xiàn)。

1.3 文獻(xiàn)篩選及數(shù)據(jù)提取

文獻(xiàn)篩選及數(shù)據(jù)提?。簝擅芯繂T按照規(guī)定流程獨(dú)立對(duì)文獻(xiàn)進(jìn)行篩選并提取相關(guān)數(shù)據(jù)，若過程中的分歧則通過求助第三方解決。資料數(shù)據(jù)提取內(nèi)容包括：① 納入研究的基本信息，包括研究題目、發(fā)表年份、第一作者姓名、病例來(lái)源地區(qū)、患者性別、腫瘤 TNM 分期樣本總量、淋巴結(jié)浸潤(rùn)情況、circ 名稱及表達(dá)水平、相應(yīng)檢測(cè)方法等；②結(jié)局指標(biāo)：從文中直接提取總生存率，或采用Engauge Digitizer 4.1軟件提取數(shù)據(jù)，通過相關(guān)計(jì)算間接獲得OS 值[9]。

1.4 納入研究的偏倚風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)

采用Hayden 等2006 年發(fā)表的預(yù)后研究質(zhì)量評(píng)價(jià)工具，評(píng)價(jià)納入研究的偏倚風(fēng)險(xiǎn)[10]。T 通過對(duì)研究對(duì)象、減員偏倚、預(yù)后因素測(cè)量、結(jié)果測(cè)量、混雜因素測(cè)量和分析這六個(gè)方面進(jìn)行考量，質(zhì)量評(píng)價(jià)的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)為：“是”“否”“部分”和“不確定”。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采 用 Review Manager 5.4 軟 件 進(jìn) 行Meta 分析。采用比值比(OR)和風(fēng)險(xiǎn)比(HR)為效應(yīng)分析統(tǒng)計(jì)量，各效應(yīng)量均提供其95%CI。其中，根據(jù)I2大小評(píng)價(jià)所納入文獻(xiàn)異質(zhì)性大小。若I2＜50%，提示研究存在同質(zhì)性，使用固定效應(yīng)模型分析；如果 P＜0.05 或者 I2＞50%，提示研究間存在異質(zhì)性，使用隨機(jī)效應(yīng)模型分析。若異質(zhì)性存在時(shí)，可通過亞組分析、Meta 回歸分析、敏感性分析等方法探討該因素是否為分析的異質(zhì)性來(lái)源。采用漏斗圖檢查方法，檢測(cè)發(fā)表偏倚。P＜0.05 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 文獻(xiàn)檢索結(jié)果

根據(jù)既定文獻(xiàn)檢索方法，初步檢索獲得文獻(xiàn)1506 篇。根據(jù)指定納入及排除標(biāo)準(zhǔn)篩查后，最終納入9 篇[11-19]進(jìn)入本次meta 分析，具體篩選過程見圖1。

圖1 文獻(xiàn)篩選過程及結(jié)果

2.2 納入研究基本病理特征

本次研究納入的9 篇文獻(xiàn)，樣本量共1194 例，均為病理學(xué)確診的結(jié)直腸癌，發(fā)表時(shí)間為2019-2021 年，樣本均來(lái)自中國(guó)。檢測(cè)方法均為定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative reverse transcriptionpolymerase chain reaction，qRT-PCR)。結(jié) 局 指 標(biāo)均為總生存率OS。其中兩篇文獻(xiàn)[11,14]從循環(huán)層面測(cè)得circRNA 表達(dá)量，其余文獻(xiàn)[12,13,15-19]均從結(jié)直腸癌組織層面測(cè)得circRNA 表達(dá)量。具體基本特征見表1。

表1 納入研究的基本特征

2.3 納入研究質(zhì)量評(píng)價(jià)

評(píng)價(jià)納入研究的偏倚風(fēng)險(xiǎn)工具：Hayden等[10]2006 年發(fā)表的預(yù)后研究質(zhì)量評(píng)價(jià)。具體評(píng)價(jià)見表2。

表2 納入研究的偏倚風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估結(jié)果

2.4 Meta 分析結(jié)果

2.4.1 circRNA 表達(dá)水平與臨床特征的分析

將患者年齡、患者性別、腫瘤大小、腫瘤位置、病理分化程度、腫瘤浸潤(rùn)深度、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與circRNA 表達(dá)水平進(jìn)行系統(tǒng)性評(píng)價(jià)。Meta 分析結(jié)果提示：與circRNA 低表達(dá)的患者相比，circRNA 高表達(dá)結(jié)直腸癌患者出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移發(fā)生可能更高[OR=2.89，95%CI(1.72，4.86)，P 值＜0.0001]，腫 瘤 更 大[OR=2.72，95%CI(1.40，5.28),P 值=0.003]，區(qū)域淋巴結(jié)浸潤(rùn)發(fā)生可能更高[OR=2.87，95%CI(1.41，6.23),P 值=0.004]，三組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而circRNA 表達(dá)水平和年齡、性別、腫瘤位置、TNM 分期、腫瘤浸潤(rùn)深度無(wú)相關(guān)關(guān)系，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。具體見表3。

表3 circRNA 表達(dá)水平與臨床特征的分析

2.4.2 circRNA 表達(dá)水平和結(jié)直腸癌患者OS 的Meta 分析

本研究所納入的9 篇文獻(xiàn)，10 種circRNA 表達(dá)量以及HR、95%CI 等數(shù)據(jù)。根據(jù)Q 檢驗(yàn)和I2結(jié)果(I2=0%，P=0.91)，提示各研究之間不存在相關(guān)異質(zhì)性，故采用固定效應(yīng)模型進(jìn)行Meta 分析。結(jié)果顯示circRNA 高表達(dá)組患者OS 更短，總體生存情況較差，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[HR=2.23，95%CI(1.87，2.65)，P＜0.00001]。具體見圖2。

圖2 circRNA 表達(dá)水平和結(jié)直腸癌患者OS 的Meta 分析

2.4.3 敏感性分析

對(duì)于circRNA 表達(dá)與結(jié)直腸癌患者OS 關(guān)系的研究，逐一剔除各項(xiàng)研究后，并未發(fā)現(xiàn)HR 有明顯的改變，說(shuō)明敏感性較低，結(jié)果較為穩(wěn)定可信。具體見表4。

表4 circRNA 表達(dá)與結(jié)直腸癌患者OS 敏感性分析結(jié)果

2.4.4 發(fā)表偏倚分析

評(píng)價(jià)發(fā)表偏倚：根據(jù)納入研究的9 篇文獻(xiàn)中OS 繪制漏斗圖，結(jié)果顯示集中趨勢(shì)明顯，不存在發(fā)表偏倚。具體見圖3。

圖3 circRNA 表達(dá)與結(jié)直腸癌OS 關(guān)系的漏斗圖

3 討論

目前因癌癥死亡的第二大原因現(xiàn)在仍是結(jié)直腸癌，約占癌癥總死亡人數(shù)的9.2%，也是全球第三常見的癌癥[20]。中晚期的結(jié)直腸癌患者給國(guó)家的公共衛(wèi)生帶來(lái)了極大的挑戰(zhàn)。缺乏鍛煉、飲酒、肥胖等不良習(xí)慣都跟結(jié)直腸癌的發(fā)病有關(guān)[21]。目前根據(jù)患者的病理分型、TNM 分期來(lái)定制對(duì)應(yīng)的診療方案，是綜合治療結(jié)直腸癌的基本原則[22]。若能在發(fā)現(xiàn)一些基因改變和結(jié)直腸癌的病理分型、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、TNM 分期等病理特征相關(guān)，那將會(huì)大大提升對(duì)結(jié)直腸癌診療方案的完善，并對(duì)判斷病人的預(yù)后情況有很大幫助?；虻母淖儠?huì)導(dǎo)致腫瘤截然不同的特征，因此可以通過研究結(jié)直腸癌患者與正常人基因表達(dá)的差異，探究基因改變和腫瘤特性改變的聯(lián)系，這樣對(duì)未來(lái)結(jié)直腸癌診療和判斷預(yù)后提供更精準(zhǔn)的依據(jù)。

目前對(duì)circRNA 的研究成為了一個(gè)新的熱點(diǎn)。這類RNA 的首次發(fā)現(xiàn)是在1970 年代的RNA病毒中[5]，后來(lái)隨著越來(lái)越多的研究提示這類RNA 在真核生物中也廣泛存在[23]。目前研究發(fā)現(xiàn)circRNA 在比如動(dòng)脈粥樣硬化、神經(jīng)功能紊亂等疾病的發(fā)展中也有參與[24,25]。最主要的是隨著研究的深入發(fā)現(xiàn)circRNA 與許多惡性腫瘤的預(yù)后有著明顯的關(guān)聯(lián)，比如肝癌[26]、肺癌[27]、乳腺癌[28]等。

LiXiangnan 等[29]發(fā) 現(xiàn)circddx17 在 結(jié) 直 腸癌組織中明顯下調(diào)，并且與不良臨床病理特征有關(guān)，發(fā)現(xiàn)抑制circddx17 可促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增值、遷移、侵襲和抑制凋亡。Jin Y 等[30]發(fā)現(xiàn)circ_0000523 可間接調(diào)節(jié)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo) 通 路Wnt/β-catenin 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，參與結(jié)直腸癌的進(jìn)展。HsiaoKueiYang 等[31]發(fā)現(xiàn)circCCDC66 在結(jié)直腸癌和息肉患者中表達(dá)升高，并且提示與不良有關(guān)。由此可見各種類型的circRNA 在結(jié)直腸癌中作用機(jī)制各異，但是在結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及預(yù)后等方面都扮演者重要的角色。

根據(jù)本次meta 分析結(jié)果顯示，在臨床病理特征方面，結(jié)直腸癌的大小、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和區(qū)域淋巴結(jié)浸潤(rùn)與circRNA 的高表達(dá)成相關(guān)性，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。并且circRNA 高表達(dá)的結(jié)直腸癌患者OS 與circRNA 低表達(dá)的結(jié)直腸癌的患者更短，并且各研究間無(wú)明顯差異性，敏感性分析也顯示結(jié)果穩(wěn)定，提示circRNA 高表達(dá)是結(jié)直腸癌不良預(yù)后的危險(xiǎn)因素。

本研究更精準(zhǔn)的關(guān)注高表達(dá)circRNA 與結(jié)直腸癌患者預(yù)后的關(guān)系，并且對(duì)circRNA 與結(jié)直腸癌的臨床病理特征之間的關(guān)系做了相關(guān)分析，提示高表達(dá)circRNA 可能通過影響結(jié)直腸癌生長(zhǎng)、遷移和對(duì)周圍組織的浸潤(rùn)等能力造成結(jié)直腸癌患者預(yù)后不良。

本研究仍然存在局限和不足：(1)納入的研究相對(duì)較少，納入研究均為回顧性分析，可能存在回憶、測(cè)量和報(bào)告偏倚的風(fēng)險(xiǎn)；(2) 由于結(jié)直腸癌在不同地域的病因、病理學(xué)特征和預(yù)后相關(guān)有較大差異，本次研究納入的病例全部來(lái)自中國(guó)，故本次研究的結(jié)果無(wú)法為其他地區(qū)及人種提供更好的參考；(3)納入本次meta 分析的患者數(shù)量相對(duì)不多，因此還需要更大規(guī)模的研究來(lái)驗(yàn)證本次結(jié)果；(4)部分納入文章中無(wú)法直接提供HR 和95%CI 數(shù)據(jù)，需要從生存曲線中自行提取和計(jì)算，因此HR 和95%CI 的準(zhǔn)確性欠佳。

綜上所述，根據(jù)分析結(jié)果提示高表達(dá)circRNA可以作為結(jié)直腸癌患者判斷預(yù)后的重要因素，可以成為評(píng)估結(jié)直腸癌患者生存結(jié)局的輔助指標(biāo)之一。但受限于納入研究數(shù)量，本研究結(jié)果仍需要更多高質(zhì)量的臨床試驗(yàn)驗(yàn)證，為臨床實(shí)踐工作提供更有意義的參考。