陳 哲 肖 偉 劉萌芷 彭 濤 葉林峰

武漢大學(xué)中南醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科 湖北 武漢 430071

加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析（weighted gene co-expression network analysis，WGCNA）是一種分析多個(gè)樣本的基因表達(dá)模式的方法。主要采用將表達(dá)模式類(lèi)似的基因進(jìn)行聚類(lèi)，形成一系列模塊（module），隨后將模塊與特定性狀或表型間的關(guān)聯(lián)進(jìn)行進(jìn)一步分析得到有生物學(xué)意義的數(shù)據(jù)。該分析方法通過(guò)尋找協(xié)同表達(dá)的基因模塊，計(jì)算基因網(wǎng)絡(luò)與關(guān)注的表型之間的相關(guān)度，發(fā)現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)中的與其他基因連接度最高且與相應(yīng)的臨床特征關(guān)系最為密切的核心基因（Hub genes）。本研究擬結(jié)合WGCNA 方法計(jì)算并篩選出慢性鼻竇炎伴鼻息肉發(fā)病過(guò)程中的關(guān)鍵模塊，挖掘核心基因。對(duì)核心基因進(jìn)行基因本體分類(lèi)（gene ontology，GO）分析和京都基因與基因組百科全書(shū)（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析，了解其分子功能和生物學(xué)過(guò)程。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)收集從美國(guó)國(guó)立生物信息技術(shù)中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）的基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(kù)（Gene Expression Omnibus，GEO）網(wǎng)站下載表達(dá)譜數(shù)據(jù)GSE36830，數(shù)據(jù)集在Affymetrix 人類(lèi)基因組U133 Plus 2.0 陣列平臺(tái)上執(zhí)行。其中包含24 個(gè)樣本，正常對(duì)照組鉤突，慢性鼻竇炎不伴息肉組鉤突，慢性鼻竇炎伴息肉組鉤突及息肉各6 例樣本。

1.2 構(gòu)建加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)主要采用R 包“WGCNA”，依據(jù)使用要求并結(jié)合GSE36830 樣本基因表達(dá)及樣本分組相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.2.1查看樣本數(shù)據(jù)的完整性，剔除離群值 為了避免離群值對(duì)后續(xù)計(jì)算的影響，在構(gòu)建加權(quán)共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)前需保證樣本數(shù)據(jù)的一致性，當(dāng)樣本中存在顯著的離群值時(shí)將其剔除。采用WGCNA 包自帶函數(shù)驗(yàn)證樣本的完整性，剔除存在過(guò)多缺失值和顯著脫離其他樣本的離群樣本。

1.2.2確定軟閾值、構(gòu)建共表達(dá)矩陣及模塊識(shí)別WGCNA 算法采用相關(guān)系數(shù)加權(quán)值，使得網(wǎng)絡(luò)中的基因之間的連接服從無(wú)尺度網(wǎng)絡(luò)分布（scale-free networks）。利用“WGCNA”包中pickSoftThreshold函數(shù)來(lái)進(jìn)行軟閾值（soft threshold power）的確定，本研究中將相關(guān)系數(shù)R2＞0.9 作為確定軟閾值β的標(biāo)準(zhǔn)。采用一步法構(gòu)建共表達(dá)矩陣，得到表達(dá)模式相似的模塊，并將其可視化。

1.2.3識(shí)別與臨床分組相關(guān)的模塊，核心基因篩選 分別計(jì)算不同模塊與各臨床分組間的相關(guān)性，從中篩選與相關(guān)疾病相關(guān)性高的模塊。計(jì)算被選中的模塊中的基因與臨床疾病的相關(guān)性，并依據(jù)模塊身份（module membership，MM）與基因顯著性（gene significance，GS）進(jìn)一步篩選核心基因。以|MM|＞0.8 且|GS|＞0.2 作為標(biāo)準(zhǔn)篩選核心基因。

1.3 核心基因GO 分析對(duì)進(jìn)一步篩選出的核心基因進(jìn)行功能注釋?zhuān)碐O 分析。分別從生物學(xué)過(guò)程（biological process，BP）、細(xì)胞成分（cellular component，CC）及分子功能（molecular function，MF）三個(gè)層面來(lái)分析核心基因的作用。本研究中采用R軟件中的“cluster Profiler”包對(duì)篩選的所有核心基因進(jìn)行GO 富集分析。

1.4 核心基因KEGG 分析KEGG 是從分子水平，特別是以基因組測(cè)序以及其他高通量測(cè)序技術(shù)的結(jié)果建立的數(shù)據(jù)庫(kù)資源。KEGG 通路分析對(duì)分子間相互作用的網(wǎng)絡(luò)通路有較好的呈現(xiàn)。對(duì)上述篩選的模塊中的核心基因，利用R 軟件中的“Cluster Profiler”包進(jìn)行KEGG 通路分析。

1.5 核心基因差異表達(dá)分析對(duì)篩選出的核心基因的表達(dá)量進(jìn)行差異分析，采用R 軟件中l(wèi)imma 包篩選核心基因中差異表達(dá)的基因［1］。比較慢性鼻竇炎伴鼻息肉中息肉組織與其他各組鉤突組織的基因表達(dá)量。其中以表達(dá)量倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）為上 調(diào) 或 下 調(diào) 2 倍 即 |log2FC| ≥1，調(diào) 整 后P（adj.P）＜0.05 作為存在差異表達(dá)的核心基因。

2 結(jié)果

2.1 構(gòu)建無(wú)尺度網(wǎng)絡(luò)及模塊分類(lèi)計(jì)算任意兩個(gè)基因間的相關(guān)系數(shù)，設(shè)置閾值進(jìn)行篩選，使得基因之間的連接符合無(wú)尺度網(wǎng)絡(luò)分布。隨后將基因按表達(dá)模式進(jìn)行模塊分類(lèi)。以相關(guān)系數(shù)R2＞0.9 為標(biāo)準(zhǔn)，選擇合適的軟閾值，本研究中的軟閾值β=3（圖1A、1B），并依據(jù)此值建立臨近矩陣及拓?fù)渚仃?。?dāng)β=3 時(shí)，計(jì)算每個(gè)基因的連接度。在無(wú)尺度網(wǎng)絡(luò)中的連接度存在冪律分布，本研究中k 與p（k）之間存在負(fù)相關(guān)，因此構(gòu)建的網(wǎng)絡(luò)符合無(wú)尺度網(wǎng)絡(luò)分布（圖1C、1D）。構(gòu)建共表達(dá)矩陣后，可以發(fā)現(xiàn)所有基因依據(jù)其表達(dá)類(lèi)型的相似性被歸為不同的模塊，共27 個(gè)模塊（圖1E）。

圖1 構(gòu)建無(wú)尺度網(wǎng)絡(luò)及模塊分類(lèi)

2.2 慢性鼻竇炎伴鼻息肉相關(guān)模塊的篩選依據(jù)模塊的特征向量，計(jì)算模塊與慢性鼻竇炎伴鼻息肉的關(guān)系，與之相關(guān)性最大的模塊為棕色模塊，共包含392 個(gè)基因，相關(guān)性為0.68（P＜0.01）（圖2A）。同時(shí)將不同模塊基因特性與性狀進(jìn)行聚類(lèi)分析后，并進(jìn)行熱圖可視化，也可發(fā)現(xiàn)慢性鼻竇炎伴鼻息肉與棕色模塊高度相關(guān)（圖2B）。隨后分別對(duì)所有模塊包含的基因與該模塊進(jìn)行相關(guān)性分析，其中棕色的相關(guān)性仍為最高（圖2C）。以|MM|＞0.8 及|GS|＞0.2 作為棕色模塊中核心基因的篩選條件，共篩選出24 個(gè)基因（圖2D，右上象限）。

圖2 慢性鼻竇炎伴鼻息肉相關(guān)模塊的篩選

2.3 核心基因GO 分析對(duì)篩選出的核心基因進(jìn)行GO 分析。其中BP 與細(xì)胞免疫關(guān)系密切，CC 顯示核心基因主要作用于細(xì)胞膜，MF 分析可看出核心基因與細(xì)胞因子、趨化因子的活性及相關(guān)受體等密切相關(guān)（圖3）。

圖3 GO 分析結(jié)果

2.4 核心基因KEGG 分析從KEGG 分析結(jié)果來(lái)看，核心基因主要作用于造血細(xì)胞譜系、病毒蛋白與細(xì)胞因子和細(xì)胞因子受體的相互作用、阿米巴病、細(xì)胞因子與細(xì)胞因子受體的相互作用、Th1 和Th2 細(xì)胞分化、緊密連接、JAK-STAT 信號(hào)通路、趨化因子信號(hào)傳導(dǎo)途徑等（圖4）。

圖4 KEGG 分析結(jié)果

2.5 核心基因的表達(dá)量差異分析通過(guò)R 軟件“l(fā)imma”包對(duì)核心基因進(jìn)行表達(dá)量差異分析后，以表達(dá)量差異倍數(shù)為2，調(diào)整后P＜0.05（|log2FC|≥1，adj.P＜0.05），共篩選出15 個(gè)差異表達(dá)的基因（CCL22、GFI1B、ITGAM、FCER2、CLEC4GP1、CD1E、ALPK2、VSTM1、AOC1、MGARP、IL2RA、COL6A5、CD1A、CLC、SIGLEC8）（圖5）。

圖5 棕色模塊核心基因中差異表達(dá)基因的表達(dá)量熱圖

3 討論

慢性鼻竇炎（chronic rhinosinusitis，CRS）是耳鼻咽喉頭頸外科臨床常見(jiàn)疾病之一。流行病學(xué)調(diào)查顯示我國(guó)慢性鼻竇炎總體患病率約為8.0%，影響了約1.07 億人，帶來(lái)了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)及社會(huì)負(fù)擔(dān)［2］。慢性鼻竇炎伴鼻息肉（chronic rhinosinusitis with nasal polyps，CRSwNP）是慢性鼻竇炎的一種常見(jiàn)類(lèi)型，患者臨床癥狀一般較重，相較于不伴鼻息肉的慢性鼻竇炎患者，術(shù)后復(fù)發(fā)相對(duì)較高。由此可以推斷慢性鼻竇炎不同的臨床分型其內(nèi)在的分子生物學(xué)機(jī)制可能存在差異。針對(duì)不同疾病類(lèi)型的患者進(jìn)行個(gè)體化的醫(yī)療過(guò)程的精準(zhǔn)醫(yī)療將會(huì)成為疾病治療的趨勢(shì)。精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的發(fā)展離不開(kāi)基因測(cè)序技術(shù)快速進(jìn)步以及生物信息與大數(shù)據(jù)科學(xué)的交叉應(yīng)用。生物信息學(xué)技術(shù)可以從數(shù)量巨大的測(cè)序數(shù)據(jù)中對(duì)有效數(shù)據(jù)進(jìn)行整合及分析，計(jì)算出可能在生理和病理過(guò)程中發(fā)揮重要生物學(xué)功能的數(shù)據(jù)。

采用生物信息學(xué)方法挖掘慢性鼻竇炎伴鼻息肉的關(guān)鍵基因能為疾病的發(fā)病機(jī)制的研究提供新的思路。WGCNA 算法被應(yīng)用在多種疾病中應(yīng)用廣泛，如肺癌［3］、乳腺癌［4］及變應(yīng)性鼻炎［5］等。本文通過(guò)WGCNA 方法分析出在慢性鼻竇炎伴鼻息肉中存在顯著生物學(xué)意義的基因，篩選出在該疾病表型中表達(dá)模式類(lèi)似的基因模塊，并通過(guò)進(jìn)一步的篩選，找出模塊中的核心基因。通過(guò)對(duì)核心基因進(jìn)行GO 分析，可以看出核心基因主要作用于細(xì)胞膜，與細(xì)胞免疫關(guān)系密切，通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞因子、趨化因子的活性及相關(guān)受體等發(fā)揮生物學(xué)作用。KEGG 分析則可以預(yù)測(cè)慢性鼻竇炎伴鼻息肉的發(fā)生可能與細(xì)胞因子與細(xì)胞因子受體的相互作用、Th1 和Th2細(xì)胞分化、緊密連接、JAK-STAT 信號(hào)通路、趨化因子信號(hào)傳導(dǎo)途徑密切相關(guān)。

對(duì)核心基因進(jìn)行更進(jìn)一步表達(dá)量分析，發(fā)現(xiàn)15個(gè)在慢性鼻竇炎伴鼻息肉組與其他組間存在顯著表達(dá)差異的基因。其中CCL22、ITGAM、CD1A、CLC、SIGLEC8 參與了慢性鼻竇炎的發(fā)病過(guò)程［6-9］。而尚未發(fā)現(xiàn)GFI1B、FCER2、CLEC4GP1、CD1E、ALPK2、 VSTM1、 AOC1、 MGARP、 IL2RA、COL6A5 在該疾病中的相關(guān)研究。進(jìn)一步的文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)GFI1B 是造血系統(tǒng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子［10］；FCER2 編碼IgE 受體亞單位，可影響血清總IgE 水平［11］；ALPK2 與心肌細(xì)胞及某些腫瘤關(guān)系密切［12］；VSTM1 與白血病等有關(guān)［13］；IL2RA 作用于T 細(xì)胞活化過(guò)程［14］；MGARP 在類(lèi)固醇生成組織和視覺(jué)系統(tǒng)中高度豐富；AOC1（ABP1）與組胺的產(chǎn)生及降解等 相 關(guān)［15］；COL6A5 與 特 應(yīng) 性 皮 炎 關(guān) 系 密 切［16］。CLEC4GP1 目前研究較少，可能與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤相關(guān)［17］。從相關(guān)基因在其他疾病中的研究可以推測(cè)大部分基因與造血細(xì)胞及免疫系統(tǒng)密切相關(guān)，與KEGG 預(yù)測(cè)的結(jié)果有較好的一致性。

綜上，可以推測(cè)加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析可以通過(guò)相關(guān)計(jì)算，挖掘出在慢性鼻竇炎伴鼻息肉發(fā)病機(jī)制中可能存在重要生物學(xué)意義的新基因，并可以初步推斷出相關(guān)基因可能的作用機(jī)制，并從其他學(xué)者的研究中證實(shí)了相關(guān)基因的功能。在后續(xù)的工作中需進(jìn)一步對(duì)上述未在慢性鼻竇炎伴鼻息肉中得到充分研究的相關(guān)基因進(jìn)行探索。