賀 鑫 陳芳芳 龔鵬舉 宋文靜 楊 燕 錢 晨 何浩東 張京偉

1武漢大學(xué)中南醫(yī)院甲乳外科/湖北省腫瘤生物學(xué)行為重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/湖北省腫瘤醫(yī)學(xué)臨床研究中心 湖北 武漢 430071；

2武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室 湖北 武漢 430071

乳腺癌是全世界最常見(jiàn)的女性惡性腫瘤之一，嚴(yán)重影響女性的生命健康。最新統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，2020 年全世界新發(fā)乳腺癌病例約226 萬(wàn)，約占全世界新發(fā)癌癥病例的11.7%，死亡病例約68 萬(wàn)例，同時(shí)乳腺癌首次取代肺癌（220 萬(wàn)，11.4%）成為全世界最常見(jiàn)的惡性腫瘤［1］。

乳腺癌是一種高度異質(zhì)性的腫瘤，其中三陰性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）的侵襲性最高，易出現(xiàn)復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移［2］。由于三陰性乳腺癌中雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）、人表皮生長(zhǎng)因子受體-2（HER-2）均為陰性，患者無(wú)法從內(nèi)分泌治療及抗HER-2 靶向治療中獲益，目前仍以化療為主。高侵襲性及治療藥物的受限導(dǎo)致三陰性乳腺癌患者的5 年死亡率較高，成為了乳腺癌治療的難點(diǎn)。

microRNA 是近年來(lái)被廣泛研究的內(nèi)源性非編碼RNA，長(zhǎng)約21～23 nt，可以通過(guò)完全或不完全結(jié)合靶基因mRNA 的3'UTR 區(qū)來(lái)抑制靶基因的表達(dá)，從而在生物的生長(zhǎng)發(fā)育及疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用［3］。在乳腺癌中，已有多個(gè)microRNA被報(bào)道為增殖、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)、預(yù)后或治療反應(yīng)的潛在生 物 標(biāo) 志 物［4］。miR-483-3p 能 通 過(guò) 靶 向 癌 基 因HDAC8 抑制人類三陰性乳腺癌細(xì)胞的增殖轉(zhuǎn)移［5］。miR-25-3p 在三陰性乳腺癌組織和細(xì)胞系中被上調(diào)并能通過(guò)靶向BTG2 促進(jìn)腫瘤增殖，可能作為TNBC 新的診斷和治療靶標(biāo)［6］。這些研究提示microRNA 在TNBC 的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要調(diào)控作用，并成為新型診療分子標(biāo)志物。

本研究通過(guò)對(duì)腫瘤基因組計(jì)劃（The cancer genome atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫(kù)中乳腺癌microRNA 測(cè)序數(shù)據(jù)的分析，篩選出與TNBC 預(yù)后相關(guān)的特異性差異表達(dá)上調(diào)microRNA，選取miR-17-5p 作為研究對(duì)象，通過(guò)相應(yīng)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，并結(jié)合多個(gè)生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)探索miR-17-5p 下游相關(guān)靶基因及相關(guān)分子機(jī)制，從而初步闡釋miR-17-5p 在TNBC 發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的生物學(xué)作用。

1 材料與方法

1.1 生物信息學(xué)分析方法

1.1.1數(shù)據(jù)來(lái)源 在UCSC Xena 網(wǎng)站（https：//xena.ucsc.edu/）下載TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中乳腺癌microRNA IlluminaHiseq 測(cè)序數(shù)據(jù)及對(duì)應(yīng)臨床信息數(shù)據(jù)。

1.1.2篩選TNBC 預(yù)后相關(guān)的特異性差異表達(dá)microRNA 排除臨床信息不完整及miRNA 測(cè)序數(shù)據(jù)有缺失的病例，按照分子分型篩選出TNBC 及非TNBC 數(shù)據(jù)，使用R 語(yǔ)言（3.6.2）limma 包分析TNBC 及非TNBC 中癌組織相對(duì)癌旁組織的差異表達(dá)microRNA，使用Venn 圖篩選出TNBC 的特異性差異表達(dá)microRNA，當(dāng)|log2FC）|＞1 且P＜0.05時(shí)認(rèn)為該microRNA 表達(dá)具有顯著性差異。利用在線生存分析網(wǎng)站Kaplan Meier Plotter（https：//kmplot.com/analysis/）采用Kaplan-Meier 方法經(jīng)Logrank 檢驗(yàn)，通過(guò)計(jì)算上四分位數(shù)和下四分位數(shù)之間所有可能的分界值，選取其中最佳的閾值作為分界點(diǎn)，將患者分為高及低表達(dá)兩組，并分析其生存情況，進(jìn)而篩選出與TNBC 預(yù)后相關(guān)的差異表達(dá)microRNA。

1.1.3分析TNBC 預(yù)后相關(guān)microRNA 的下游基因 使 用Starbase 數(shù) 據(jù) 庫(kù)（http：//starbase. sysu.edu.cn/index.php）結(jié)合多種方法（miRanda：http：//www. microrna. org/microrna/getMicroRNAForm.do，PicTar：https：//pictar.mdc-berlin.de/，miRmap：https：//mirmap. ezlab. org/，Targetscan7.2：http：//www. targetscan. org/vert_72/，PITA：http：/genie.weizmann. ac. il/pubs/mir07/）預(yù)測(cè)miR-17-5p 的下游靶基因，篩選5 個(gè)工具預(yù)測(cè)結(jié)果中的交集靶基因。通過(guò)Metascape 及STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)靶基因進(jìn)行功能及信號(hào)通路聚類分析，并構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)。結(jié)合在線生存分析網(wǎng)站Kaplan Meier Plotter 對(duì)關(guān)鍵基因進(jìn)行生存分析。通過(guò)在線網(wǎng)站UALCAN 分析TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)不同類型乳腺癌組織樣本中FBXL5 的表達(dá)水平。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 乳腺上皮細(xì)胞系MCF-10A 及人乳腺癌細(xì)胞系（MCF-7 及MDA-MB-231細(xì)胞）購(gòu)買于中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。細(xì)胞使用含10% 胎牛血清（Gibco，美國(guó)）及1% 青霉素-鏈霉素（Invitrogen，美國(guó)）的DMEM（Gibco，美國(guó)）完全培養(yǎng)基，在37 ℃，5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。定期換液，待細(xì)胞密度為60%～70%時(shí)選取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。miR-17-5p 的mimics、inhibitor 及 相 應(yīng)NC 訂 購(gòu) 于 吉瑪基因，嚴(yán)格按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后MDAMB-231 細(xì)胞分為：①M(fèi)imics-NC 組；②Mimics 組；③Inhibitor-NC 組；④Inhibitor 組。

1.2.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR 收集各組待測(cè)細(xì)胞，根據(jù)RNA 提取試劑盒（北京莊盟生物）說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞總RNA。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Thermo，美國(guó)）說(shuō)明書(shū)，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。qPCR 使用20 μL 反應(yīng)體系，包括cDNA 1 μL，2×SYBR Green Mix（Bio-Rad，美國(guó)）10 μL，引物0.4 μL，滅菌蒸餾水9 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃3 min、95 ℃12 s、58 ℃15 s、72 ℃30 s，40 個(gè) 循 環(huán)。以U6 為 內(nèi) 參，采 用2-ΔΔCT法 計(jì) 算miR-17-5p 相對(duì)表達(dá)量。引物訂購(gòu)于華大基因：miR17 - 5p：（forward） 5' - AACAGTGCAAAGTGCTTACAGT - 3'，（reverse） 5' - GTCGTATCCAGTGCAGGGT - 3'；U6：（forward） 5' - CTCGCTTCGGCAGCACA - 3'；（reverse） 5' - AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。

1.2.3CCK-8 實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞轉(zhuǎn)染12 h 后，按照2×103/孔的密度接種于96 孔板，每組6 個(gè)復(fù)孔。完全DMEM 培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)24、48、72 h 后，向每孔中加入10 μL CCK-8 試劑（北京莊盟生物），培養(yǎng)箱靜置2 h 后檢測(cè)各組細(xì)胞的OD450nm值。

1.2.4劃痕實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞轉(zhuǎn)染12 h 后，按照1×105/孔的密度接種于6 孔板，完全DMEM 培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞密度100%時(shí)劃線，分別于0、24、48 h 后低倍顯微鏡下拍照記錄。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 24.0 及Graph Pad Prism 7 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，研究結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用t檢驗(yàn)和方差分析比較各組間差異，P＜0.05 時(shí)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TNBC 預(yù)后相關(guān)的特異性高表達(dá)microRNA經(jīng)篩選后共納入67 例TNBC 樣本、334 例非TNBC 樣本及76 例正常乳腺組織樣本。如圖1 所示，經(jīng)生物信息學(xué)分析，共篩選出98 個(gè)TNBC 特異性高表達(dá)microRNA 及11 個(gè)TNBC 特異性低表達(dá)microRNA。

圖1 TNBC 中特異性差異表達(dá)的microRNA（TCGA）

在98 個(gè)TNBC 特異性高表達(dá)microRNA 中，進(jìn)一步篩選出9 個(gè)log2FC＞2 的microRNA（表1），并選擇miR-17-5p 做后續(xù)分析與研究。通過(guò)Kaplan-Meier 方法分析microRNA 與TNBC 總生存期（OS）的相關(guān)性。結(jié)果表明（圖2）miR-17-5p（HR=1.56，95%CI：1～2.43）高表達(dá)與TNBC 患者預(yù)后不良顯著相關(guān)（P＜0.05）。

圖2 miR-17-5p 在TNBC 中特異性高表達(dá)且與不良預(yù)后相關(guān)

表1 三陰性乳腺癌中特異性高表達(dá)的9 個(gè)log2FC＞2 的microRNA

2.2 miR-17-5p 在TNBC 細(xì)胞中表達(dá)特異性升高首先分析了CCLE（cancer cell line encyclopedia）數(shù)據(jù)庫(kù)里不同乳腺癌細(xì)胞系中miR-17-5p 的表達(dá)水平。結(jié)果表明（圖3A），與非TNBC 細(xì)胞系相比，TNBC 細(xì)胞系中miR-17-5p 的表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）。我們進(jìn)一步檢測(cè)了MCF-10A、MCF-7及MDA-MB-231 細(xì)胞中miR-17-5p 的表達(dá)水平。如圖3B 所示，與正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A 相比，TNBC 細(xì) 胞 系MDA-MB-231 中miR-17-5p 表 達(dá)顯著升高（P＜0.001），而Luminal A 型乳腺癌細(xì)胞系MCF - 7 中miR - 17 - 5p 表達(dá)未顯著升高（P＞0.05）。結(jié)果表明，miR-17-5p 在TNBC 細(xì)胞中表達(dá)特異性升高。

在TNBC 細(xì)胞系MDA-MB-231 中轉(zhuǎn)染miR-17-5p mimics 及inhibitor 后，我們通過(guò)RT-qPCR 檢測(cè)各組細(xì)胞中miR-17-5p 表達(dá)水平。如圖3C 和3D 所示，與對(duì)照組相比，mimics 組細(xì)胞中miR-17-5p 表達(dá)水平顯著升高（P＜0.001），而inhibitor 組細(xì)胞中miR-17-5p 表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01）。

圖3 miR-17-5p 在不同類型乳腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平

2.3 miR-17-5p 促進(jìn)TNBC 細(xì)胞增殖及遷移能力為了檢測(cè)miR-17-5p 對(duì)TNBC 細(xì)胞增殖及遷移能力的影響，我們分別在TNBC 細(xì)胞系MDA-MB-231 中 轉(zhuǎn) 染miR-17-5p mimics 及inhibitor，通 過(guò)CCK-8 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同時(shí)間各組細(xì)胞的存活情況，劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞劃痕愈合情況。結(jié)果表明（圖4），與對(duì)照組相比，過(guò)表達(dá)miR-17-5p 后細(xì)胞增殖及遷移能力顯著增強(qiáng)，而抑制miR-17-5p 表達(dá)后細(xì)胞增殖及遷移能力顯著減弱（P＜0.05）。

圖4 miR-17-5p 對(duì)三陰性乳腺癌細(xì)胞增殖及遷移能力的影響

2.4 miR-17-5p 靶基因預(yù)測(cè)及相關(guān)調(diào)控機(jī)制分析使用Starbase 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)miR-17-5p 下游靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，共篩選出407 個(gè)交集靶基因。功能及信號(hào)通路聚類分析結(jié)果表明（圖5A），miR-17-5p 的靶基因涉及到眾多腫瘤相關(guān)功能及信號(hào)通路，如細(xì)胞蛋白降解、蛋白泛素化、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、TGF-β 信號(hào)通路等。此外，對(duì)構(gòu)建的靶基因PPI 網(wǎng)絡(luò)篩選關(guān)鍵子模塊（圖5B），結(jié)果主要涉及到5 個(gè)子網(wǎng)絡(luò)：泛素化及蛋白酶體降解（Ubiquitination & Proteasome degradation）、mRNA 剪接（mRNA Splicing）、受體酪氨酸激酶通路（Signaling by Receptor Tyrosine Kinases）、細(xì)胞投射組件（cell projection assembly）及G1中 與Cyclin D 相 關(guān) 的 事 件（Cyclin D associated events in G1）。

圖5 miR-17-5p 下游靶基因預(yù)測(cè)及PPI 網(wǎng)絡(luò)

泛素-蛋白酶體途徑在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，我們選擇此子網(wǎng)絡(luò)（模塊1）中的關(guān)鍵基因作進(jìn)一步分析。為了探究泛素-蛋白酶體途徑中關(guān)鍵基因?qū)NBC 患者總生存期的影響，我們使用Kaplan-Meier 方法及Log-rank 檢驗(yàn)進(jìn)行生存分析。結(jié)果表明（圖6A），F(xiàn)BXL5（F-box and leucine rich repeat protein 5）的低表達(dá)與TNBC 患者預(yù)后不良密切相關(guān)（P＜0.05）。進(jìn)一步通過(guò)UALCAN 在線分析TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)不同類型乳腺癌患者樣本中FBXL5 的表達(dá)水平，結(jié)果表明（圖6B），與正常乳腺組織相比，TNBC 組織中FBXL5 的表達(dá)水平顯著降低。通過(guò)Starbase 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)一步分析乳腺癌中miR-17-5p 與FBXL5 表達(dá)水平相關(guān)性，結(jié)果，miR-17-5p 與FBXL5 的mRNA 表達(dá)水平顯著負(fù)相關(guān)（y=-0.244 4x+6.661 9，r=-0.498，P＜0.001）（圖6C）。

圖6 miR-17-5p 下游關(guān)鍵靶基因的篩選

由此我們推測(cè)，miR-17-5p 可通過(guò)抑制泛素-蛋白酶體途徑中關(guān)鍵基因如FBXL5 的mRNA 表達(dá)水平，促進(jìn)TNBC 的發(fā)生發(fā)展，從而影響TNBC 患者的預(yù)后。

3 討論

乳腺癌現(xiàn)已超越肺癌成為全世界最常見(jiàn)的惡性腫瘤。而由于具有高侵襲性、治療方案受限等特點(diǎn)，目前三陰性乳腺癌患者的預(yù)后依然較差。近年來(lái)越來(lái)越多的研究表明分子靶向治療在三陰性乳腺癌的治療中可發(fā)揮重要的作用，因此對(duì)三陰性乳腺癌治療靶點(diǎn)的進(jìn)一步探索具有重要意義。

將TNBC 組和非三陰性乳腺癌（Non-TNBC）組microRNA IlluminaHiseq 測(cè)序數(shù)據(jù)分別與正常乳腺組織比較后，經(jīng)韋恩圖分析，篩選出98 個(gè)在TNBC 中特異上調(diào)的microRNA，選取其中9 個(gè)log2FC＞2 的microRNA 進(jìn)行生存分析，結(jié)果表明，miR-17-5p 高表達(dá)與三陰性乳腺癌患者預(yù)后不良顯著相關(guān)。

越來(lái)越多的研究表明，microRNA 在癌癥發(fā)生的發(fā)展中發(fā)揮重要作用，成為腫瘤早期診斷、治療和預(yù)后評(píng)估的重要標(biāo)志物。在已有研究中，miR-17-5p 在多種腫瘤中具有促癌的作用。如miR-17-5p 可通過(guò)靶向下游基因如RUNX3、PDCD4 等促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖和侵襲［7，8］。在鼻咽癌中，miR-17-5p 通過(guò)靶向BAMBI 促進(jìn)腫瘤血管生成［9］。而miR-17-5p在三陰性乳腺癌中的作用并不明確，因此本研究中，我們對(duì)miR-17-5p 做進(jìn)一步探究。

我們首先檢測(cè)了正常乳腺上皮細(xì)胞及不同類型乳腺癌細(xì)胞中miR-17-5p 的表達(dá)情況。結(jié)果表明，與正常乳腺上皮細(xì)胞相比，miR-17-5p 在三陰性乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)特異性升高。為了進(jìn)一步探究miR-17-5p 對(duì)三陰性乳腺癌細(xì)胞的影響，我們?cè)贛DA-MB-231 中分別轉(zhuǎn)染miR-17-5p mimics 及inhibitor 后，通過(guò)CCK-8、劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖及遷移能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)miR-17-5p后細(xì)胞增殖及遷移能力顯著增強(qiáng)，而抑制miR-17-5p 表達(dá)后細(xì)胞增殖及遷移能力顯著減弱（P＜0.05）。綜上，miR-17-5p 在三陰性乳腺癌中表達(dá)升高，且促進(jìn)三陰性乳腺癌細(xì)胞增殖及遷移能力。

為了進(jìn)一步探究miR-17-5p 促進(jìn)三陰性乳腺癌細(xì)胞增殖及遷移的機(jī)制，我們通過(guò)多工具對(duì)miR-17-5p 下游靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，并篩選出在泛素-蛋白酶體途徑中發(fā)揮重要作用的基因FBXL5。FBXL5 是F-BOX 蛋白家族的成員之一，參與E3 泛素連接酶SCF（SKP1 - CUL1 - F box）復(fù) 合 物 的 組 成［10］。FBXL5 可通過(guò)影響基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞周期、鐵代謝、DNA 損傷修復(fù)、EMT 等過(guò)程，影響多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展及耐藥等。在肝癌中，F(xiàn)BXL5 的缺乏可通過(guò)影響細(xì)胞鐵穩(wěn)態(tài)促進(jìn)腫瘤的發(fā)生［11］。而在結(jié)腸癌中，F(xiàn)BXL5 可通過(guò)調(diào)節(jié)PTEN/PI3K/AKT 信號(hào)通路促進(jìn)腫瘤的發(fā)展［12］。FBXL5 在乳腺癌中的作用尚不明確。本研究中，生存分析結(jié)果表明FBXL5 的低表達(dá)與三陰性乳腺癌患者預(yù)后不良顯著相關(guān)（P＜0.05）。同時(shí)，與正常乳腺組織相比，F(xiàn)BXL5在三陰性乳腺癌組織中表達(dá)水平顯著降低。在乳腺癌中，miR-17-5p 與FBXL5 的mRNA 表達(dá)水平顯著負(fù)相關(guān)。由此我們推測(cè)，miR-17-5p 可通過(guò)抑制泛素-蛋白酶體途徑中關(guān)鍵基因如FBXL5 的mRNA表達(dá)水平，促進(jìn)三陰性乳腺癌的發(fā)生發(fā)展，從而影響三陰性乳腺癌患者的預(yù)后。

近年來(lái)，越來(lái)越多的研究對(duì)microRNA 在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制進(jìn)行探索。本研究通過(guò)生物信息學(xué)及實(shí)驗(yàn)對(duì)miR-17-5p 在三陰性乳腺癌中的作用進(jìn)行了分析，初步推測(cè)miR-17-5p 可通過(guò)下調(diào)泛素-蛋白酶體途徑中關(guān)鍵基因如FBXL5 的表達(dá)來(lái)促進(jìn)三陰性乳腺癌的發(fā)生發(fā)展，為尋找新的三陰性乳腺癌診斷標(biāo)志物、治療靶點(diǎn)等提供了理論基礎(chǔ)。在后續(xù)研究中，我們將進(jìn)一步探索泛素-蛋白酶體途徑關(guān)鍵基因?qū)θ幮匀橄侔┑挠绊?，從而明確miR-17-5p 調(diào)控三陰性乳腺癌的具體機(jī)制。