田 甜,宋秀紅,孔 琰,王靈芝,劉翔宇,楊 晶,崔竹梅

(青島大學(xué)附屬醫(yī)院婦科，青島 266061)

子宮內(nèi)膜癌是婦科常見(jiàn)惡性腫瘤。多種因素可導(dǎo)致子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展，但是具體機(jī)制尚不明確。S100蛋白作為EF手相鈣結(jié)合蛋白家族中的最大成員，具有調(diào)控細(xì)胞增殖、遷移、轉(zhuǎn)錄因子等多種生物學(xué)功能[1]，與腫瘤關(guān)系密切[2]。S100A1與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，但是其在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)和作用尚不明確。本研究通過(guò)免疫組化法檢測(cè)子宮內(nèi)膜癌組織中S100A1表達(dá)水平，通過(guò)慢病毒載體轉(zhuǎn)染構(gòu)建過(guò)表達(dá)S100A1的子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系，通過(guò)細(xì)胞外功能實(shí)驗(yàn)明確S100A1對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期調(diào)控、遷移和侵襲的影響，探討S100A1在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 資料來(lái)源

1.1.1 組織標(biāo)本 收集2003年1月至2005年12月在青島大學(xué)附屬醫(yī)院接受手術(shù)治療的74例子宮內(nèi)膜癌、14例子宮內(nèi)膜不典型增生和26例良性子宮內(nèi)膜增生患者的臨床資料和石蠟標(biāo)本。子宮內(nèi)膜癌患者的年齡為(53.48±9.14)歲；臨床分期：Ⅰ期59例，Ⅱ～Ⅳ期15例；病理分化程度：高分化者24例，中分化者33例，低分化者10例，7例非子宮內(nèi)膜樣腺癌被排除。子宮內(nèi)膜癌患者術(shù)前均未接受放化療。子宮內(nèi)膜良性增生包括單純性增生和復(fù)雜性增生。手術(shù)分期依據(jù)2009年FIGO分期標(biāo)準(zhǔn)。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)的討論并獲得同意。

1.1.2 細(xì)胞與試劑 人腎上皮細(xì)胞系293細(xì)胞、子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系HEC-1A和HEC-1B細(xì)胞均源自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，由課題組實(shí)驗(yàn)室保存。PV-9000免疫組化試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋。慢病毒質(zhì)粒pLVX-IRES-Neo和慢病毒包裝質(zhì)粒pCMVΔ8.9、VSVG和PLP2為課題實(shí)驗(yàn)組保存。轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司；逆轉(zhuǎn)錄檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)ABI公司；實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒購(gòu)自日本Takara公司；蛋白印跡(Western blot)法檢測(cè)試劑購(gòu)自美國(guó)Pierce公司；活細(xì)胞計(jì)數(shù)(CCK-8)法檢測(cè)試劑盒購(gòu)自日本同仁化學(xué)研究所。單克隆鼠抗S100A1、β-actin抗體購(gòu)自Santa Cruz公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化方法 組織切片脫蠟，用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗。3%過(guò)氧化氫室溫孵育，檸檬酸鹽緩沖液的修復(fù)盒中進(jìn)行高壓抗原修復(fù)。冷卻，血清封閉。一抗過(guò)夜孵育，辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗工作液室溫孵育30min。二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色和蘇木素復(fù)染，脫水并封片。陰性對(duì)照用PBS緩沖液替換一抗。數(shù)字圖像掃描儀Scanscope XT獲取圖像，使用Aperio Image Scope軟件(美國(guó)Aperio公司)進(jìn)行染色定量評(píng)分。軟件自動(dòng)計(jì)數(shù)每個(gè)視野中弱陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(Nwp)、陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(Np)、強(qiáng)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(Nsp)及總細(xì)胞數(shù)(Ntotal)。每份標(biāo)本采用半定量方法，按不同染色強(qiáng)度細(xì)胞所占百分比分別賦值之和進(jìn)行計(jì)算，計(jì)算公式為(Nwp/Ntotal)×(100)+(Np/Ntotal)×(200)+(Nsp/Ntotal)×(300)[3]。

1.2.2 過(guò)表達(dá)S100A1子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的構(gòu)建及鑒定 (1)細(xì)胞系構(gòu)建和篩選：將擴(kuò)增的S100A1 cDNA克隆到pLVX-IRES-Neo的XhoI/BamHI酶切位點(diǎn)，構(gòu)建慢病毒載體。按Lipofectamine 2000說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行轉(zhuǎn)染。5μg pLVX-IRES-Neo-S100A1或pLVX-IRES-Neo、1.25μg VSVG、3.75μg pCMVΔ8.91和1.25μg PLP2轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。收集病毒上清，-80℃保存。病毒感染子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞HEC-1A和HEC-1B。400μg/mL G418進(jìn)行穩(wěn)定細(xì)胞的篩選。(2)鑒定：①Western blot法檢測(cè)HEC-1A和HEC-1B細(xì)胞中S100A1表達(dá)：裂解細(xì)胞,BCA法測(cè)定蛋白濃度。取定量蛋白進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳、PVDF轉(zhuǎn)膜、一抗4℃孵育過(guò)夜、二抗孵育1h，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL)液顯色，凝膠成像儀采集成像。應(yīng)用Image J軟件進(jìn)行分析。②熒光實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)S100A1 mRNA表達(dá):TRIzol試劑(Invitrogen)提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA。采用SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems)和StepOne Plus實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行檢測(cè)。PCR反應(yīng)體系20μL，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30s；90℃ 5s，55℃ 35s，共40個(gè)循環(huán)。按公式2-△△Ct分析S100A1 mRNA表達(dá)水平。S100A1基因引物序列，上游：5'-CCGCTCGAGAGCAGCCACATTTGCAACCT-3'，下游：5'-CGCGGATCCGCTGGTGAGAGAGAAGCCTTTA-3'。

1.2.3 CCK-8法檢測(cè)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖能力 將子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞按3×103細(xì)胞/孔接種于96孔板，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。于24、48、72h去除培養(yǎng)液，加稀釋的CCK-8 10μL，37℃溫箱作用1h，酶標(biāo)儀檢測(cè)450nm吸光度(A)值。根據(jù)A值繪制細(xì)胞增殖曲線。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞周期比例 0.25%胰蛋白酶收集細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液。PBS洗滌，冰冷70%乙醇4℃固定過(guò)夜。PBS洗滌細(xì)胞2次，500μL碘化丙啶(PI)染色液37℃避光放置30min。使用FACSCalibur流式細(xì)胞儀檢測(cè)染色細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 Transwell小室和劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲能力 Transwell小室實(shí)驗(yàn)：提前制備平鋪matrigel的小室。無(wú)血清培養(yǎng)基制備單細(xì)胞懸液，200μL細(xì)胞懸液加入平鋪和未平鋪matrigel的Transwell上室，600μL含10%胎牛血清細(xì)胞液加入下室，溫箱培養(yǎng)24h。去除上室表面細(xì)胞，4%多聚甲醛固定，0.3%結(jié)晶紫染色。顯微鏡拍照，統(tǒng)計(jì)穿膜細(xì)胞數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。劃痕實(shí)驗(yàn)：將相同數(shù)量的子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞接種于6孔板，用相同型號(hào)的移液管刮取細(xì)胞層。PBS清洗去除細(xì)胞碎片，于0h和24～48h拍攝圖像，測(cè)量劃痕距離。

2 結(jié) 果

2.1 子宮內(nèi)膜癌組織中S100A1蛋白表達(dá)水平比較 免疫組化結(jié)果表明，S100A1主要表達(dá)于細(xì)胞漿和細(xì)胞核(圖1)。子宮內(nèi)膜癌組織、子宮內(nèi)膜不典型增生組織中S100A1蛋白表達(dá)水平顯著高于良性增生子宮內(nèi)膜組織(Z=-3.53，P=0.000；Z=-3.001，P=0.003)；子宮內(nèi)膜癌和子宮內(nèi)膜不典型增生組織之間無(wú)明顯差異(Z=-0.201，P=0.84)(圖2)。子宮內(nèi)膜癌組織中S100A1表達(dá)水平與年齡有相關(guān)性(Z=-3.822，P=0.000)，與肌層浸潤(rùn)、宮頸受累、組織學(xué)類型、FIGO分期、腫瘤分化、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)相關(guān)性(P均>0.05)。見(jiàn)表1。

圖1 免疫組化法檢測(cè)S100A1蛋白在子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)(SP法×400)

圖2 免疫組化分值

表1 S100A1在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)和臨床病理參數(shù)分析

2.2 穩(wěn)定表達(dá)S100A1基因的HEC-1A和HEC-1B細(xì)胞系的建立及鑒定 本研究成功構(gòu)建轉(zhuǎn)染S100A1基因的子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系。Western blot法檢測(cè)顯示，轉(zhuǎn)染組HEC-1A和HEC-1B細(xì)胞中S100A1蛋白表達(dá)強(qiáng)度均明顯高于各自對(duì)照組。qRT-PCR結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染組HEC-1A細(xì)胞、HEC-1B細(xì)胞的S100A1 mRNA表達(dá)水平分別為(831.67±47.56)和(390.50±47.56)，均明顯高于對(duì)照組細(xì)胞(t=17.47，P=0.0001；t=8.19，P=0.001)(圖3)。

圖3 轉(zhuǎn)染組和對(duì)照組子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中S100A1蛋白表達(dá)

2.3 轉(zhuǎn)染組和對(duì)照組子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖能力的比較 CCK-8法檢測(cè)顯示，轉(zhuǎn)染組HEC-1A細(xì)胞培養(yǎng)48h的A值(0.69±0.02)明顯高于對(duì)照組(0.62±0.02，t=4.778，P=0.008)，培養(yǎng)72h的A值(1.09±0.05)明顯高于對(duì)照組(0.90±0.09，t=3.327，P=0.029)；轉(zhuǎn)染組HEC-1B細(xì)胞培養(yǎng)48h的A值(1.08±0.04)明顯高于對(duì)照組(0.87±0.03，t=7.166，P=0.002)，培養(yǎng)72h的A值(2.29±0.05)明顯高于對(duì)照組(1.98±0.10，t=4.925，P=0.0079)。見(jiàn)圖4。

圖4 CCK-8檢測(cè)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖能力的變化

2.4 轉(zhuǎn)染組和對(duì)照組子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的細(xì)胞周期比較 轉(zhuǎn)染組HEC-1A和HEC-1B細(xì)胞的G2/M期細(xì)胞比例分別為(13.19±0.02)%和(19.94±0.36)%，明顯高于對(duì)照組[(11.68±0.47)%和(16.66±0.85)%]，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。HEC-1A細(xì)胞轉(zhuǎn)染組與對(duì)照組相比，G1期細(xì)胞比例顯著下降[(64.60±0.16)% vs(67.90±0.28)%，P<0.05]，S期細(xì)胞比例無(wú)明顯變化[(22.27±0.06)% vs(20.45±0.76)%，P<0.05]。HEC-1B細(xì)胞轉(zhuǎn)染組與對(duì)照組相比，G1期細(xì)胞比例顯著增高[(45.41±0.35)vs(42.35±0.65)%，P<0.05]，S期細(xì)胞比例顯著下降[(34.66±0.01)%與(40.99±0.20)%，P<0.05]。見(jiàn)圖5。

圖5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞周期比例的變化

2.5 轉(zhuǎn)染組和對(duì)照組子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的比較 Transwell體外遷移實(shí)驗(yàn)顯示，轉(zhuǎn)染組HEC-1A和HEC-1B細(xì)胞的穿膜細(xì)胞數(shù)分別為(106±15)和(38±12)個(gè)，對(duì)照組的穿膜細(xì)胞數(shù)分別為(120±9)和(41±3)個(gè)，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。Transwell體外侵襲實(shí)驗(yàn)顯示，轉(zhuǎn)染組HEC-1A和HEC-1B細(xì)胞的穿膜細(xì)胞數(shù)分別為(120±15)和(96±12)個(gè)，對(duì)照組的穿膜細(xì)胞數(shù)分別為(109±4)和(108±21)個(gè)，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，兩組子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的遷移能力無(wú)明顯變化。

3 討 論

S100蛋白屬于EF手相鈣結(jié)合蛋白家族成員，在體內(nèi)發(fā)揮廣泛的生物學(xué)作用，如鈣離子穩(wěn)態(tài)、細(xì)胞骨架構(gòu)成、轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)、細(xì)胞增殖分化、細(xì)胞周期、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、炎性反應(yīng)等[4]。多種S100蛋白如S100P、S100A4、S100A7、S100A8/A9、S100A14參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[5-9]。S100A1主要在心肌中表達(dá)，調(diào)節(jié)心肌內(nèi)Ca2+環(huán)境、細(xì)胞收縮和能量代謝[10]。S100A1在病理?xiàng)l件下表達(dá)異常，與腫瘤發(fā)生發(fā)展有關(guān)[11]。研究發(fā)現(xiàn)，S100A1在黑色素瘤、腎細(xì)胞癌、乳腺癌、卵巢癌和甲狀腺癌的發(fā)生進(jìn)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用[12-16]。然而，S100A1在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)和作用尚不清楚。本研究通過(guò)免疫組化法檢測(cè)S100A1在子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)，結(jié)果顯示其在子宮內(nèi)膜癌和子宮內(nèi)膜不典型增生組織中的表達(dá)均高于良性子宮內(nèi)膜組織，表明S100A1在子宮內(nèi)膜癌和癌前病變組織中表達(dá)異常，可能在良性子宮內(nèi)膜向惡性腫瘤發(fā)生癌變的病理過(guò)程中發(fā)揮一定的促進(jìn)作用。本研究結(jié)果顯示，子宮內(nèi)膜癌組織中S100A1表達(dá)水平與年齡相關(guān)，與肌層浸潤(rùn)、宮頸受累、組織學(xué)類型、FIGO分期、腫瘤分級(jí)、腫瘤大小和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理特征無(wú)明顯相關(guān)性；良性子宮內(nèi)膜及不典型增生子宮內(nèi)膜的S100A1蛋白表達(dá)與年齡無(wú)相關(guān)性。DeRycke等[17]報(bào)道，在子宮內(nèi)膜樣子宮內(nèi)膜癌中，S100A1表達(dá)量與腫瘤分化和臨床分期無(wú)相關(guān)性，這與本研究結(jié)果一致。本研究未行生存預(yù)后分析。研究發(fā)現(xiàn),子宮內(nèi)膜樣子宮內(nèi)膜癌中S100A1高表達(dá)與患者無(wú)復(fù)發(fā)生存率下降有關(guān)，認(rèn)為S100A1可作為子宮內(nèi)膜樣惡性腫瘤預(yù)后不良的標(biāo)志[17]。

本研究結(jié)果表明，S100A1增強(qiáng)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖能力，但不影響細(xì)胞遷移和侵襲能力。有研究發(fā)現(xiàn)，S100A1在神經(jīng)細(xì)胞中調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖[18-19]，參與腫瘤細(xì)胞增殖的異常調(diào)節(jié)[1]。細(xì)胞周期改變引起的細(xì)胞增殖失調(diào)是腫瘤發(fā)生的重要環(huán)節(jié)，S100A1蛋白參與腫瘤細(xì)胞周期的調(diào)控[13]。本研究結(jié)果顯示，S100A1過(guò)表達(dá)的子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞G2/M期細(xì)胞比例顯著增加。S100A1促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖可能與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期有關(guān)，但是具體作用機(jī)制尚不明確。多數(shù)S100蛋白家族通過(guò)與RAGE相互作用并激活細(xì)胞信號(hào)通路發(fā)揮作用，該信號(hào)通路涉及MAP激酶、NF-κB和磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/Akt信號(hào)通路[1]。子宮內(nèi)膜癌中S100A1蛋白調(diào)控細(xì)胞周期的分子機(jī)制需進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，S100A1在子宮內(nèi)膜癌中表達(dá)異常，促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖，影響細(xì)胞周期調(diào)控。因此,S100A1在子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，為子宮內(nèi)膜癌的治療提供新的分子靶點(diǎn)。