郭 玲，楊 芳，郭安良，劉 雯，沈彥軍，李 莉，代彩鳳*，鄧曉惠*

(1.山東大學齊魯醫(yī)院婦產(chǎn)科生殖醫(yī)學中心，濟南 250012；2.山東大學齊魯醫(yī)學院，濟南 250012)

隨著輔助生殖技術(assisted reproductive technology，ART)中超促排卵(controlled ovarian hyperstimulation，COH)方案的不斷改進和實驗室胚胎培育技術的進一步完善，體外受精-胚胎移植(in vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET)的成功率不斷提高，其著床率可高達60%[1]。但是仍有相當一部分患者在經(jīng)歷多次優(yōu)質(zhì)胚胎移植后未能獲得臨床妊娠，臨床上稱之為反復種植失敗(repeated implantation failure，RIF)，已成為限制ART發(fā)展的瓶頸問題。目前RIF的診斷標準尚未統(tǒng)一[2]。2014年Coughlan等[3]提出RIF的診斷標準，40歲以下不孕癥婦女，至少經(jīng)歷3周期新鮮或凍融胚胎移植，累計移植不少于4枚優(yōu)質(zhì)胚胎仍未獲得臨床妊娠。國內(nèi)通常參考2018年《胚胎植入前遺傳學診斷/篩查專家共識》將RIF定義為：經(jīng)歷3次以上胚胎移植，或移植不少于4～6枚優(yōu)質(zhì)卵裂期胚胎或3枚優(yōu)質(zhì)囊胚而未獲得臨床妊娠[4]。RIF的影響因素眾多且復雜，主要可分為配子及胚胎質(zhì)量異常、子宮內(nèi)膜容受性下降和其他混合因素等[5]。近年來隨著分子生物學技術的發(fā)展，目前研究大多聚焦于母-胎界面的分子層面，但關于患者自身病理因素在胚胎種植中影響的報道較少。本研究通過回顧分析不孕癥患者的年齡、不孕類型、不孕年限、體質(zhì)量指數(shù)(body mass index，BMI)、人工流產(chǎn)次數(shù)、抗繆勒管激素(antimullerian hormone，AMH)、基礎內(nèi)分泌、甲狀腺功能、自身免疫抗體相關指標、染色體核型、宮腔鏡檢查、胚胎移植日子宮內(nèi)膜厚度和宮腔深度等因素與RIF的關系，明確RIF發(fā)生的臨床高危因素，以期為RIF的早期病因篩查及早期治療提供臨床依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象 回顧性研究2018年8月至2020年2月于山東大學齊魯醫(yī)院生殖醫(yī)學中心行IVF/ICSI治療的不孕癥患者的臨床資料。根據(jù)胚胎移植后的妊娠結(jié)局，分為RIF組(222例)和對照組(567例)。RIF組納入標準：至少經(jīng)歷3個周期，新鮮或凍融移植周期累計至少移植4枚優(yōu)質(zhì)卵裂期胚胎或3枚囊胚仍未獲得臨床妊娠者。對照組納入標準：第1次行IVF/ICSI-ET助孕即成功獲得妊娠者。排除標準：無可供移植的優(yōu)質(zhì)胚胎；嚴重生殖道解剖結(jié)構(gòu)異常；明確精神疾病病史；存在ART及妊娠禁忌證或合并其他對妊娠有重大影響疾病的患者。本研究已獲得山東大學齊魯醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準。

1.2 研究方法

1.2.1 IVF過程 研究對象均采用標準化的卵巢刺激方案，主要包括經(jīng)典長方案、長方案、短方案、微刺激方案、拮抗劑方案等。根據(jù)患者的年齡、BMI以及卵巢功能等個體化啟用Gn，通過超聲監(jiān)測卵泡發(fā)育情況，并結(jié)合血清性激素水平及時調(diào)整Gn用法和用量。當至少有2個優(yōu)勢卵泡平均直徑≥18mm時，應用絨毛膜促性腺激素(HCG)(絨毛膜促性腺激素注射液，珠海麗珠醫(yī)藥公司)6000～10000IU肌肉注射，或促性腺激素釋放激素激動劑(GnRH-a)(達必佳，德國輝凌制藥公司)0.2mg皮下注射，或GnRH-a 0.2mg皮下注射及HCG 1000～2000IU肌肉注射誘發(fā)排卵，并于扳機后34～36h取卵。取卵后4～6h，根據(jù)精子質(zhì)量，采用IVF或ICSI受精。取卵后立即給予黃體支持，根據(jù)胚胎培養(yǎng)情況，于取卵后第3天或第5天選擇最多2枚胚胎進行移植，剩余胚胎冷凍保存。

1.2.2 妊娠結(jié)局判斷 結(jié)合患者的個體情況或其他因素進行胚胎移植，包括新鮮胚胎移植和凍融胚胎移植?；颊哂谠缙谂咛ヒ浦埠?4日或囊胚移植后11～12日測定血清β-HCG，若β-HCG<10IU/L，則判定為未妊娠；若β-HCG≥10IU/L，且2～3周后經(jīng)超聲檢查可探及宮內(nèi)妊娠囊和胎心搏動，則判定為臨床妊娠，否則為生化妊娠。

1.2.3 觀察指標 (1)一般臨床資料：年齡、不孕類型、不孕年限、BMI、人工流產(chǎn)次數(shù)、AMH、基礎內(nèi)分泌、甲狀腺功能三項、雙方染色體核型、宮腔鏡檢查、胚胎移植日子宮內(nèi)膜厚度和宮腔深度等；(2)自身免疫抗體相關指標：抗甲狀腺球蛋白抗體(thyroglobulin antibody，TG-Ab)、抗甲狀腺過氧化物酶抗體(anti-thyroid peroxidase antibody，TPO-Ab)、抗核抗體(antinuclear antibody，ANA)、抗心磷脂抗體(anticardiolipin antibody，ACA)、抗β2-糖蛋白I抗體(anti-β2 glycoprotein I antibody，β2-GPΙ-Ab)。

2 結(jié) 果

2.1 患者的一般臨床資料 RIF組的年齡、不孕年限、繼發(fā)性不孕比例、人工流產(chǎn)次數(shù)≥2次比例、基礎FSH、宮腔鏡檢查異常比例均高于對照組，AMH、胚胎移植日子宮內(nèi)膜厚度均低于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 RIF組與對照組患者的一般臨床資料比較

2.2 自身免疫性抗體比較 RIF組的TG-Ab陽性比例、ANA陽性比例、β2-GPΙ-Ab陽性比例均高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(表2)。

表2 RIF組與對照組患者的自身免疫抗體相關指標比較[n(%)]

2.3 多因素logistic回歸分析 將上述具有統(tǒng)計學意義的影響因素分別賦值(表3)，納入多因素logistic回歸模型。多因素分析顯示，不孕年限增加、繼發(fā)性不孕、低AMH水平、宮腔鏡檢查異常、ANA陽性、β2-GPΙ-Ab陽性等因素是RIF的危險因素，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(表4)。

表3 RIF影響因素賦值說明

表4 多因素logistic回歸分析RIF的危險因素

2.4 ROC曲線分析 logistic回歸分析顯示，所得模型具有統(tǒng)計學意義(χ2=120.104，P<0.001)；Hosmer和Lemeshow檢驗無統(tǒng)計學差異(P=0.227)，提示擬合良好。采用ROC曲線評價多因素logistic回歸預測模型，AUC=0.737(95%CI為0.697～0.777，P<0.001)，提示所建立的預測模型效果較好(圖1)。

圖1 logistic回歸預測模型的ROC曲線

3 討 論

胚胎植入是一個復雜的生理過程，其成功的關鍵在于高質(zhì)量胚胎與良好子宮內(nèi)膜容受性之間的相互作用[6]，主要包括胚泡定位、黏附和侵入等一系列過程。隨著胚胎植入前遺傳學檢測(preimplantation genetic testing，PGT)技術的發(fā)展，約有70%的胚胎被鑒定為高質(zhì)量胚胎[7]，因此母體自身病理因素與胚胎RIF的發(fā)生密切相關。臨床實踐中，部分研究者主張針對RIF患者進行大量臨床病因篩查，包括血栓形成傾向、免疫球蛋白、淋巴細胞亞群及多種血清學和子宮內(nèi)膜免疫細胞因子譜等檢查[8-11]，但其對RIF診斷和預測的意義仍存在較大爭議。RIF對不孕癥患者和家庭造成了巨大的身心和經(jīng)濟壓力，而深入分析和預測RIF發(fā)生的臨床相關高危因素可為患者提供合理的臨床管理策略，對于其獲得良好的妊娠結(jié)局具有重要意義。本研究發(fā)現(xiàn)，不孕年限增加、繼發(fā)性不孕、宮腔鏡檢查異常、ANA陽性、β2-GPΙ-Ab陽性等是RIF的危險因素，AMH是RIF的保護因素。

3.1 不孕年限及不孕類型對胚胎種植的影響 研究表明，隨著不孕年限增加，精子可出現(xiàn)頂體蛋白活性下降、核染色質(zhì)不成熟等，使不孕癥夫婦精卵結(jié)合障礙的可能性升高[12]，從而導致胚胎種植失敗的風險增加。本研究發(fā)現(xiàn)，RIF組患者的不孕年限高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，與既往研究結(jié)果較一致。Devine等[13]研究發(fā)現(xiàn)，原發(fā)性不孕與IVF助孕失敗相關。本研究結(jié)果提示，RIF組患者繼發(fā)性不孕比例(69.37% vs 47.62%)升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。分析原因可能與本研究樣本量相對較少，且RIF組患者平均年齡高于對照組有關。隨著年齡升高，卵巢儲備下降，繼發(fā)性不孕比例增加，子宮內(nèi)膜容受性下降使胚胎著床失敗的可能性增加[14]。經(jīng)多因素logistic分析發(fā)現(xiàn)，不孕年限(OR=1.098，95%CI為1.027～1.174，P=0.006)和繼發(fā)性不孕(OR=1.763，95%CI為1.209～2.570，P=0.003)與RIF的發(fā)生密切相關，但其確切作用機制有待于進一步研究。

3.2 血清AMH水平對胚胎種植的影響 AMH是轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor β，TGF-β)超家族的成員之一，可由卵巢顆粒細胞分泌[15]。研究表明，AMH在調(diào)節(jié)細胞增殖、分化、凋亡和組織修復再生等過程中發(fā)揮重要作用[16]。目前在生殖醫(yī)學領域內(nèi)，血清AMH測定被廣泛用于卵巢功能、COH、胚胎質(zhì)量及妊娠結(jié)局的評估和預測[17-18]。有研究發(fā)現(xiàn)，AMH表達水平過低，可抑制蛻膜化進程，促進子宮內(nèi)膜細胞凋亡，影響子宮內(nèi)膜容受性，導致RIF發(fā)生[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，RIF患者的血清AMH水平低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；多因素logistic分析發(fā)現(xiàn)，AMH是RIF發(fā)生的保護因素(OR=0.932，95%CI為0.882～0.984，P=0.011)，與既往研究結(jié)果較一致。

3.3 宮腔鏡檢查對胚胎種植的影響 宮腔鏡檢查被認為是宮腔內(nèi)病變評估的金標準，目前在RIF的診斷和治療中也被廣泛應用[20]。研究表明，RIF患者中宮腔鏡檢查異常發(fā)生率高達30%～40%[21]，其中與胚胎種植密切相關的最常見的宮腔內(nèi)病變主要包括宮腔粘連、子宮內(nèi)膜炎、子宮內(nèi)膜息肉和黏膜下肌瘤等[22]。多項研究表明，RIF患者在胚胎移植前行宮腔鏡檢查可顯著提高新鮮和冷凍周期的胚胎種植率[23-25]。部分研究發(fā)現(xiàn)，即使在宮腔鏡檢查正常的患者中，通過宮腔鏡檢查也可提高RIF患者的臨床妊娠率[26]。然而，El-Toukhy等[27]研究發(fā)現(xiàn)，行宮腔鏡檢查的RIF患者中宮腔異常比例高達26%，但其中超過20%的宮腔病變無法通過常規(guī)治療加以糾正，且RIF患者是否行宮腔鏡檢查對移植后活產(chǎn)率并無影響。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，RIF患者宮腔鏡檢查異常比例升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；多因素logistic分析發(fā)現(xiàn)，宮腔鏡檢查異常是RIF發(fā)生的危險因素(OR=1.648，95%CI為1.129～2.407，P=0.010)，與既往研究結(jié)果較一致。本研究為回顧性分析，關于RIF患者ART周期前行宮腔鏡檢查可否改善臨床妊娠率仍有待于后續(xù)進一步研究。

3.4 自身免疫抗體對胚胎種植的影響 多項研究表明，先天性免疫、適應性免疫及外周免疫系統(tǒng)之間的協(xié)調(diào)平衡是妊娠成功的基礎條件[28-29]。近年來隨著生殖免疫學的發(fā)展，自身免疫性抗體異常導致的胚胎種植失敗受到越來越多的關注，但對于多種自身免疫性抗體與IVF-ET術后妊娠結(jié)局的關系，目前尚未達成共識[30]。研究認為，ACA可通過引起局部微血栓形成，影響子宮內(nèi)膜容受性[31]。ANA可通過損傷卵母細胞并干擾胚胎細胞分裂導致胚胎種植失敗[32]。β2-GPΙ-Ab可通過損傷滋養(yǎng)細胞，誘導滋養(yǎng)細胞功能障礙，形成血栓，從而對妊娠結(jié)局產(chǎn)生不良影響[33-34]。有研究發(fā)現(xiàn)，外周血中ACA、ANA和β2-GPΙ-Ab高表達是RIF發(fā)生的高危因素[35]。研究發(fā)現(xiàn)，甲狀腺自身免疫性疾病(thyroid autoimmunity，TAI)與RIF的發(fā)生密切相關[31]。TAI不僅可通過甲狀腺功能障礙影響胚胎種植，同時甲狀腺自身免疫抗體可引起機體免疫紊亂，從而導致胚胎著床失敗。本研究發(fā)現(xiàn)，RIF患者的TG-Ab陽性比例、ANA陽性比例和β2-GPΙ-Ab陽性比例均高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；多因素logistic分析發(fā)現(xiàn)，ANA陽性(OR=2.176，95%CI為1.249～3.791，P=0.006)和β2-GPΙ-Ab陽性(OR=2.682，95%CI為1.862～3.862，P<0.001)與RIF的發(fā)生密切相關。但本研究僅納入了ANA、ACA、β2-GPΙ-Ab、TG-Ab和TPO-Ab五項自身免疫性抗體指標，未來仍有待于進一步完善其他多種自身免疫抗體對胚胎種植的影響。

綜上所述，不孕年限增加、繼發(fā)性不孕、宮腔鏡檢查異常、ANA陽性、β2-GPΙ-Ab陽性等因素是RIF的危險因素，AMH是RIF的保護因素。針對相關危險因素建立logistic回歸預測模型，對RIF病因篩查、診斷及針對性干預高危人群具有重要的臨床指導意義。但由于本研究為單一中心的回顧性研究，且研究納入樣本量相對較小，未來仍需大樣本前瞻性隨機對照試驗加以評估和驗證。