楊居崩，李 爽，聶發(fā)龍，趙顯芳，朱紫陌，代 蓉，李秀芳

（云南中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，云南 昆明 650500）

上呼吸道感染（URTI）是外鼻孔至環(huán)狀軟骨下緣包括鼻、咽或喉部急性炎癥的總稱，常由病毒和細(xì)菌相互作用引起，包括普通感冒、流行性感冒、病毒性咽炎等［1?2］。由于引起URTI 的病原微生物絕大部分經(jīng)口鼻進(jìn)入機(jī)體，因此鼻黏膜屏障對(duì)于防御病原體進(jìn)入機(jī)體至關(guān)重要。該屏障由機(jī)械屏障、化學(xué)屏障、微生物屏障和免疫屏障有機(jī)地結(jié)合在一起，共同阻止病原微生物對(duì)機(jī)體的侵襲［3］。鼻黏膜免疫功能低下是URTI 發(fā)生的重要原因，也與URTI反復(fù)發(fā)作密切相關(guān)［4?5］。銀翹散源于清代醫(yī)家吳鞠通《溫病條辨》，被稱為“辛涼平劑”，臨床常用于治療普通感冒、流行性感冒、急性支氣管炎等疾病，療效良好。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，銀翹散可通過(guò)增強(qiáng)上呼吸道免疫屏障功能發(fā)揮預(yù)防及改善URTI 的作用［6?8］，本研究中探討了銀翹散對(duì)模型小鼠鼻黏膜屏障功能低下的影響。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與動(dòng)物

儀器：Infinite M200 PRO型酶標(biāo)儀（瑞士Tecan公司）；EPS ?301型垂直電泳儀、Mini Trans ?Blot?Cell型濕轉(zhuǎn)儀，均購(gòu)自美國(guó)Bio ?Rad 公司；UVP凝膠成像分析系統(tǒng)（美國(guó)Bio Spectrum 公司）；XS125A 型分析天平（瑞士Precisa公司）。

試藥：BCA 蛋白濃度檢測(cè)試劑盒（批號(hào)為090321211027）、RIPA 裂解液（批號(hào)為20211104）、過(guò)硫酸銨（APS）（批號(hào)為ST005）、TEMED（批號(hào)為ST728），均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；吐溫?20（德國(guó)Biofroxx 公司，批號(hào)為EZ6789B150）；10%十二烷基硫酸鈉（SDS，批號(hào)為G522KA5701）、二硫蘇糖醇（DTT，批號(hào)為A620058 ?0025），均購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；Tris（批號(hào)為1109U071）、1 mol/L Tris ?HCl緩沖液（批號(hào)為20191217）、1.5 mol/ L Tris ?HCl 緩沖液（批號(hào)為20211230）、甘氨酸（批號(hào)為1210J061），均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；免疫球蛋白A抗體（Anti ?IgA，美國(guó)Novus Biologicals 公司，批號(hào)為NB7501）；Rabbit Anti ?Goat IgG（H+L）（批號(hào)為20000332）、Goat Anti ?Rabbit IgG（H + L）（批號(hào)為20000373）、β ?Actin Mouse McAb（批號(hào)為10021787）、緊密連接蛋白（Occludin）Rabbit PolyAb（批號(hào)為13409 ?1 ?AP），均購(gòu)自美國(guó)Proteintech 公司；脂多糖（LPS，批號(hào)為068M4093V）、異硫氰酸熒光素（FITC）?葡聚糖（批號(hào)為CBW4630），均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；水為去離子水。

飲片：金銀花（批號(hào)為C180301）、連翹（批號(hào)為C180601）、桔梗（批號(hào)為C181001）、竹葉（批號(hào)為C190201）、生甘草（批號(hào)為C180501）、淡豆豉（批號(hào)為C190401）、牛蒡子（批號(hào)為C180801）、葦根（批號(hào)為C180901）、薄荷（批號(hào)為C181204）、荊芥穗（批號(hào)為C190701），均購(gòu)自云南慈慧藥業(yè)有限公司。

動(dòng)物：SPF級(jí)雄性KM小鼠，5周齡，體質(zhì)量18～20 g，購(gòu)自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（川）2020 ?030，飼養(yǎng)于云南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室［SYXK（滇）K2017 ?0005］，飼養(yǎng)期間小鼠自由飲水，飼喂普通維持飼料。飼養(yǎng)環(huán)境：晝夜各半、循環(huán)照明，濕度恒定，溫度為22～25 ℃。所有操作均符合云南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)要求（審批號(hào)R ?06202009）。

1.2 方法

1.2.1 藥液制備

除薄荷和荊芥穗外，取其余藥材飲片，加入12倍量的水，浸泡30 min，煎煮10 min，再將薄荷和荊芥穗倒入共煎5 min，濾過(guò)，取續(xù)濾液，45 ℃下旋蒸至所需濃度。4 ℃保存，使用時(shí)以溫水預(yù)熱，1周內(nèi)使用［9］。

1.2.2 LPS 單次滴鼻刺激實(shí)驗(yàn)

分組與建模：將40只小鼠分為正常對(duì)照組（8只）和模型A 組（32 只）。模型A 組小鼠以LPS（2 mg/ kg，每20 g 體質(zhì)量20 μL，每側(cè)鼻腔各10 μL）單次滴鼻，正常對(duì)照組小鼠滴鼻等體積磷酸鹽緩沖液（PBS）。

IgA 及Occludin 蛋白表達(dá)：采用Western blot 法。模型A 組滴鼻結(jié)束后1，3，5，7 d 時(shí)各取8 只小鼠，過(guò)量麻醉處死，剝?nèi)⌒∈蟊丘つ?，剪碎，加? mL RIPA 裂解液，冰上勻漿，14 000 r /min離心5 min，取上清，以BCA法檢測(cè)蛋白濃度。SDS ?PAGE電泳，電轉(zhuǎn)，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，清洗3次，加入一抗，4 ℃孵育過(guò)夜，清洗3次，加入二抗，室溫振搖孵育1 h，清洗3次，加入ECL 化學(xué)發(fā)光試劑，顯影、成像。將條帶灰度值數(shù)字化，目的條帶與內(nèi)參條帶灰度比值為各目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3 LPS 連續(xù)滴鼻刺激實(shí)驗(yàn)

分組與建模：將40只小鼠分為正常對(duì)照組（8只）和模型B 組（32 只）。滴鼻劑量同1.2.2 項(xiàng)。模型B 組各取8 只小鼠分別連續(xù)1，3，5，7 d 滴鼻給藥，每天1 次，均于末次滴鼻前1 h以FITC ?葡聚糖滴鼻。正常對(duì)照組小鼠滴鼻等體積PBS。

IgA及Occludin蛋白表達(dá)：末次給藥后處死小鼠，剝?nèi)”丘つぃ?.2.2 項(xiàng)下Western blot 法測(cè)定蛋白相對(duì)表達(dá)量。

鼻黏膜上皮屏障通透性：采用酶標(biāo)儀測(cè)定小鼠血清葡聚糖水平，以評(píng)估小鼠鼻黏膜上皮屏障通透性，水平越高表明通透性越好。

1.2.4 銀翹散對(duì)模型小鼠的影響

分組與建模：將32只小鼠分為正常對(duì)照組（等體積蒸餾水）、模型C組（等體積蒸餾水），以及銀翹散低、高劑量組（相當(dāng)于生藥24.18 g/kg 和72.54 g/kg），各8 只。除正常對(duì)照組外（等體積PBS 滴鼻），其余組小鼠以LPS（劑量同1.2.2項(xiàng)）滴鼻后6 h灌胃相應(yīng)藥物（0.2 mL/10 g）或等體積蒸餾水，每天1次，連續(xù)7 d。

IgA及Occludin蛋白表達(dá)：末次給藥后處死小鼠，剝?nèi)”丘つ?，?.2.2 項(xiàng)下Western blot 法測(cè)定蛋白相對(duì)表達(dá)量。按1.2.3項(xiàng)下方法評(píng)估小鼠鼻黏膜上皮屏障通透性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析。計(jì)量資料以±s表示。資料符合正態(tài)分布且各組方差齊，兩組間比較行t檢驗(yàn)，兩組以上行單因素方差分析，兩兩比較行LSD?t檢驗(yàn)；資料符合正態(tài)分布但各組方差不齊，或資料不符合正態(tài)分布且各組方差不齊，行Kruskal ?Wallis非參數(shù)檢驗(yàn)，兩兩比較，采用Bonferroni 法校正P值。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用GraphPad Prism 9.0軟件作圖。

2 結(jié)果

2.1 LPS 單次滴鼻后小鼠鼻黏膜組織中IgA 及Occludin 蛋白表達(dá)水平

與正常對(duì)照組比較，模型A 組小鼠鼻黏膜組織中IgA 蛋白表達(dá)水平僅在滴鼻后1 d 時(shí)顯著降低（P＜0.01），3，5，7 d時(shí)持續(xù)升高且3 d時(shí)基本恢復(fù)正常；Occludin蛋白表達(dá)水平僅在3 d時(shí)顯著降低（P＜0.01）。詳見(jiàn)圖1。

2.2 LPS 連續(xù)滴鼻后小鼠鼻黏膜組織中IgA及Occludin 蛋白表達(dá)、鼻黏膜上皮屏障通透性

A1，B1.電泳圖 A2，B2.統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)A.IgA B.Occludin注：與正常對(duì)照組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01。圖2同。圖1 LPS單次滴鼻后小鼠鼻黏膜組織中IgA，Occludin蛋白表達(dá)水平A1，B1.Electrophoretogram A2，B2.Statistical dataA.IgA B.OccludinNote：Compared with those in the normal control group，*P ＜0.05，**P ＜0.01（for Fig.1 ?2）.Fig.1 Expression levels of IgA and Occludin protein in nasal mucosa of mice after single nasal drip of LPS

與正常對(duì)照組比較，模型B 組予LPS 滴鼻1 次（1 d 1 次，下同）和連續(xù)滴鼻3 次時(shí)，小鼠鼻黏膜組織中IgA蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01），連續(xù)滴鼻5，7次時(shí)，IgA 蛋白表達(dá)水平雖持續(xù)升高，但未恢復(fù)至正常水平；Occludin 蛋白表達(dá)水平在連續(xù)滴鼻3 次時(shí)顯著降低（P＜0.01）。與正常對(duì)照組比較，模型B 組連續(xù)滴鼻3，5，7次后，小鼠血清葡聚糖水平顯著升高（P＜0.05）。詳見(jiàn)圖2。

2.3 銀翹散對(duì)模型小鼠相關(guān)指標(biāo)的影響

與正常對(duì)照組比較，模型C 組小鼠鼻黏膜組織中Occludin 蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01），血清葡聚糖水平顯著升高（P＜0.01）；與模型C 組比較，銀翹散低、高劑量組小鼠鼻黏膜組織中Occludin蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），血清葡聚糖水平顯著降低（P＜0.01）；銀翹散高劑量組小鼠鼻黏膜組織中IgA 蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）。詳見(jiàn)圖3。

A1，B1.電泳圖 A2，B2.統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)A.IgA B.Occludin C.葡聚糖注：與正常對(duì)照組比較，△△P ＜0.01；與模型C組比較，#P ＜0.05，##P ＜0.01。圖3 銀翹散對(duì)模型小鼠相關(guān)指標(biāo)的影響（±s，n=10）A1，B1.Electrophoretogram A2，B2.Statistical dataA.IgA B.Occludin C.DextranNote：Compared with those in the normal control group，△△P ＜0.01；Compared with those in the model group C，#P ＜0.05，##P ＜0.01.Fig.3 Effect of Yinqiao Powder on relevant indexes of model mice

3 討論

鼻黏膜屏障功能低下是URTI 發(fā)病的重要原因，氣管炎、支氣管炎、肺炎等嚴(yán)重的下呼吸道感染也常始于URTI［10?11］，故保持鼻黏膜屏障功能的完整性對(duì)于防治URTI 具有重要意義。有研究表明，IgA 有助于預(yù)防流感，鼻腔或血清中IgA含量較高的H1N1流感患者，恢復(fù)時(shí)間更短［12?13］。Occludin 蛋白是首個(gè)完整的形成緊密連接的跨膜蛋白［14?15］，在維持上皮細(xì)胞緊密連接屏障中起關(guān)鍵作用，Occludin 蛋白缺失將導(dǎo)致大分子的選擇通透性增加［16］。本研究結(jié)果表明，以LPS 分別單次滴鼻后第1 天和第3 天，小鼠鼻黏膜組織中IgA 和Occludin蛋白表達(dá)水平明顯降低，隨后開(kāi)始升高至接近正常水平，說(shuō)明LPS 單次刺激誘導(dǎo)的炎癥較輕，免疫屏障和機(jī)械屏障破壞程度輕，容易恢復(fù)至正常水平。LPS 連續(xù)滴鼻誘導(dǎo)持續(xù)炎癥刺激，滴鼻1 次和連續(xù)3 次時(shí)，小鼠鼻黏膜組織中IgA 蛋白表達(dá)水平明顯降低，Occludin 蛋白表達(dá)水平在連續(xù)滴鼻3，5，7 次時(shí)明顯降低，血清中FITC ?葡聚糖水平升高，即鼻黏膜上皮屏障的通透性升高，說(shuō)明持續(xù)的炎癥刺激可降低鼻黏膜免疫屏障、機(jī)械屏障的功能，這為病原微生物的入侵提供了便利。

銀翹散是治療URTI 的代表方，具有辛涼透表、清熱解毒的功效，用于溫病初起、邪犯肺衛(wèi)證。方中以金銀花、連翹為君藥，可疏散風(fēng)熱、清熱解毒；薄荷、牛蒡子可辛涼解表、清利咽喉，桔?？砷_(kāi)宣肺氣、止咳利咽，蘆根、竹葉可清熱生津，同為佐藥；生甘草既可調(diào)和藥性、護(hù)胃安中，又合桔梗清利咽喉，為佐使。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，銀翹散具有一定的解熱［17］、鎮(zhèn)痛［18］、抗炎［19］、抗病毒［20］的作用。課題組前期研究表明，銀翹散可明顯降低寒冷刺激后模型大鼠血清中炎性因子水平，并能提高鼻黏膜局部免疫防御能力［21］。本研究結(jié)果表明，與模型C組比較，銀翹散低、高劑量組小鼠鼻黏膜組織中IgA、Occludin蛋白表達(dá)水平明顯升高，鼻黏膜上皮屏障通透性明顯降低。

綜上所述，銀翹散可改善模型小鼠鼻黏膜免疫屏障功能，機(jī)制可能為促進(jìn)鼻黏膜中Occludin 蛋白表達(dá)，降低鼻黏膜上皮屏障的通透性，從而提高鼻黏膜機(jī)械屏障功能。還可通過(guò)促進(jìn)IgA 的表達(dá)，提高鼻黏膜免屏障功能。