王淑娟，郜毓堃，郭棟衛(wèi)，王 悅，蘭 天，王云霞，馬婷婷，孫翔宇*

（1.神農(nóng)智華生物科技（山西）有限公司，山西 長治 046299；2.西北農(nóng)林科技大學 葡萄酒學院，陜西 楊凌 712199；3.西北農(nóng)林科技大學 食品科學與工程學院，陜西 楊凌 712199；4.銀川市綠化養(yǎng)護管理站，寧夏 銀川 750001）

黑果腺肋花楸（Aronia melanocarpa）又名為野櫻莓、不老莓、黑澀石楠，屬薔薇科（Rosaceae）腺肋花楸屬（Aronia）多年生落葉灌木[1]。黑果腺肋花楸具有較高抗逆性，耐寒，耐旱，耐瘠薄，且不易染病害蟲害，適宜生長的范圍十分廣闊，具有較短栽培周期且兼具觀賞價值與生態(tài)經(jīng)濟效益，為優(yōu)良經(jīng)濟林樹種[2-3]。黑果腺肋花楸種植歷史約有百年之久，原產(chǎn)于北美，我國東北20世紀末引種以來，目前已形成一定種植規(guī)模[4-5]。黑果腺肋花楸果實富含多酚、多糖、維生素等多種營養(yǎng)物質，具有較強的抗氧化能力[6]。研究發(fā)現(xiàn)，黑果腺肋花楸及其提取物不僅對血脂異常[7]、高血壓[8]、肥胖[9]等常見疾病具有明顯的改善作用，而且還能夠抑制乳腺癌等細胞的增殖[10-11]。

近年來，國家大力推行對水果的綜合開發(fā)利用，尤其是深加工釀酒。政策引導下，以果酒代替糧食酒成為大勢所趨[12]。隨著人們生活水平的不斷提高，對健康越發(fā)重視，因而具有較佳保健功能的果酒越來越受到青睞。黑果腺肋花楸果酒以其獨特的香氣和保健價值逐漸引起大家的關注。

目前研究主要聚焦于黑果腺肋花楸的栽培繁育及其果實成分的提取和生理功能，包括黑果腺肋花楸繁殖技術、栽培技術、生物活性物質的研究[13]?，F(xiàn)有的對黑果腺肋花楸果酒的研究也僅集中在工藝的改良及條件優(yōu)化，鮮有多手段對黑果腺肋花楸揮發(fā)性香氣成分進行系統(tǒng)解析的研究。因此，本研究以干酒、甜酒、白酒和啤酒四種酒類的12款不同市售黑果腺肋花楸酒為實驗對象，對其進行了氣相色譜質譜聯(lián)用技術（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）及電子鼻檢測，并對結果進行線性判別分析（linear discriminant analysis，LDA）及聚類分析（clustering analysis，CA），探究不同黑果腺肋花楸酒香氣特征及差異，以期為黑果腺肋花楸酒不同類別的區(qū)分及鑒定研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 黑果腺肋花楸酒樣

經(jīng)調研考察，選擇銷量較高的12款國產(chǎn)黑果腺肋花楸酒產(chǎn)品為樣品，樣品信息見表1。

表1 12款市售黑果腺肋花楸酒產(chǎn)品信息Table 1 Information of 12 commercially available Aronia melanocarpa wines

1.1.2 化學試劑

氯化鈉（分析純）：四川西隴科學有限公司。

1.2 儀器與設備

PEN 3電子鼻：德國Airsense公司；GC-MS-QP2010氣質聯(lián)用儀：日本島津公司；SPME萃取裝置（50/30 μm，DVB/CAR/PDMS）：美國Supelco公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 GC-MS分析

采用頂空固相微萃取法（headspace solid-phase microextraction，HS-SPME）結合氣相色譜質譜聯(lián)用技術（GC-MS）對不同市售黑果腺肋花楸酒樣品的揮發(fā)性香氣成分進行檢測，在LAN T等[14]的測定方法上稍作修改。5 mL黑果腺肋花楸酒樣品置于20 mL頂空瓶中，45 ℃平衡30 min，將已老化（250 ℃、120 min）的萃取頭插入頂空瓶頂空部分萃取30 min，插入氣相色譜進樣口，250 ℃條件下解吸2 min，并啟動儀器采集數(shù)據(jù)，以進行GC-MS的分離鑒定。

GC條件：DB-1MS熔融石英毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），載氣為高純氦氣，流速1.93 mL/min。不分流進樣。升溫程序：初始溫度40 ℃，保持3 min，以4 ℃/min升溫至120 ℃，然后以6 ℃/min的速度升至240 ℃，并保持9 min。

MS條件：電子電離（electronic ionization，EI）源，電子能量為70 eV，離子源溫度為230 ℃；全掃描模式：質量掃描范圍是35～500 m/z。

定性方法[15]：黑果腺肋花楸酒揮發(fā)性物質根據(jù)美國國家標準技術研究所（National Institute of Standards and Technology，NIST）14質譜數(shù)據(jù)庫通過匹配度和保留時間并結合保留指數(shù)確定，并選擇匹配度＞85%的成分為有效香氣成分。保留指數(shù)（retention index，RI）根據(jù)以下公式計算，其中正構烷烴的碳原子數(shù)為C7～C30。

式中：n和n+1分別為待測組分前后正構烷烴的碳原子數(shù)，個；tn和tn+1為相應的正構烷烴出峰保留時間，min；tx為待測組分出峰保留時間，min；其中tn＜tx＜tn+1。

定量方法：采用峰面積歸一化法計算各揮發(fā)性物質的相對含量。

1.3.2 電子鼻檢測

采用電子鼻對不同市售黑果腺肋花楸酒產(chǎn)品的整體揮發(fā)性香氣特征進行檢測分析，在MA T T等[16]的測試方法上稍作修改。將5 mL黑果腺肋花楸酒樣品置于20 mL樣品瓶中，在25 ℃條件下平衡10 min，插入電子鼻探頭進行檢測，每個樣品至少測定8次。電子鼻檢測的具體參數(shù)如下：樣品檢測時間為60 s，清洗時間為300 s，載氣速度為300 mL/min，進樣流量為300 mL/min。

1.3.3 統(tǒng)計分析

揮發(fā)性物質數(shù)據(jù)采用SPSS 26.0.0.0進行方差分析及多重比較，P＜0.05為顯著相關。電子鼻數(shù)據(jù)利用Excel 2016進行整合，并采用SPSS 26.0進行線性判別分析。

2 結果與分析

2.1 黑果腺肋花楸酒揮發(fā)性香氣物質GC-MS分析

采用頂空固相微萃取法結合氣相色譜質譜聯(lián)用技術（HS-SPME-GC-MS）對12款黑果腺肋花楸酒樣品進行揮發(fā)性香氣物質的檢測，結果見表2。黑果腺肋花楸酒樣品揮發(fā)性物質種類維恩圖見圖1。

圖1 黑果腺肋花楸酒樣品揮發(fā)性物質種類維恩圖Fig.1 Venn diagram of volatile substance types in Aronia melanocarpa wine samples

2.1.1 揮發(fā)性化合物種類分析

由表2和圖1可知，所有樣品酒中共檢測出103種揮發(fā)性化合物，其中酯類42種，醇類21種，醛類7種，酮類6種，酸類10種，烯烴類4種。所有樣品共有化合物為2種酯類，為辛酸乙酯、丁酸乙酯。

5種黑果腺肋花楸干型酒樣品中共檢測出64種揮發(fā)性物質，其中酯類31種，醇類17種，醛類6種，酮類5種，酸類10種，烯烴類4種。比高銀璐[17]在黑果腺肋花楸果汁中檢測到的42 種揮發(fā)性物質更豐富，說明發(fā)酵過程增加了果汁的復雜性。來自4個不同產(chǎn)地的5種干型酒中特有化合物有4種，分別為對二甲苯、十二烷異丙基醚、3-乙氧基丙醇和4-甲基-1-戊醇。5種干型酒中共有的揮發(fā)性物質有25種，其中10種為酯類。D1樣品共檢出揮發(fā)性物質種類最多，為64種，其特有揮發(fā)性化合物有7種，分別為對二甲苯、十二烷異丙基醚、乙氧基乙烯、己醛、3-甲基丁酸、己酸丙酯、甲苯；D2樣品共檢出揮發(fā)性物質42種，無特有化合物；D3樣品共檢出揮發(fā)性物質多少52種，其特有的揮發(fā)性物質為3-乙氧基丙醇；D4樣品共檢出揮發(fā)性物質64種，其特有的揮發(fā)性物質4種，分別為芳樟醇、4-甲基-1-戊醇、乙酸異丁酯、乙酸-2-甲基丁基酯；D5樣品共檢出揮發(fā)性物質56種，其特有揮發(fā)性化合物為4-乙基苯酚。黑果腺肋花楸甜酒樣品中共檢測出揮發(fā)性物質47種。

4種黑果腺肋花楸白酒中共檢測出53種揮發(fā)性物質，其中酯類24種，醇類9種，醛類6種，酮類3種，酸類3種，烯烴類3種。多于南果梨風味白酒29種揮發(fā)性化合物[18]。4種白酒樣品區(qū)別于其他酒種的特有揮發(fā)性物質有5種，為己酸戊酯、丁酸異戊酯、2-壬酮、丁酸-2-甲基丁酯。4種白酒樣品共有揮發(fā)性物質有7種，分別為丁酸乙酯、戊酸乙酯、辛酸乙酯、異丁醇、乙醛縮二乙醇、乙醛和丙酰胺。與上述干型酒樣品相比，白酒樣品之間的差異更大。在4種白酒樣品中，L7樣品共檢出揮發(fā)性物質30種，其特有揮發(fā)性化合物有10種，分別為乙基-2-甲基丙酸酯、2-甲基丁酸乙酯、3-甲基丁酸乙酯、丁酸異戊酯、丁酸-2-甲基丁酯、己酸戊酯、壬醛、癸醛、2-戊酮和2-壬酮；L8樣品共檢出揮發(fā)性物質34種，其特有揮發(fā)性化合物有7種，分別為辛醇、己醛、3-戊烯-2-酮、山梨酸、甲苯、十一烷和十二烷；L9樣品共檢出揮發(fā)性物質22種，其特有揮發(fā)性化合物有4種，正丙酸乙酯、3-甲基丁醛、氨基甲磺酸和2-蒈烯；L10共檢出揮發(fā)性物質19種，其特有揮發(fā)性化合物有3種，分別為己酸乙酯、乙酸-2-苯基乙酯和苯甲醛。

2種黑果腺肋花楸啤酒樣品共檢測出46種揮發(fā)性物質，其中酯類21種，醇類11種，醛類5種，酮類2種，酸類4種，烯烴類1種以及2種其他類物質。啤酒樣品區(qū)別于其他酒種的特有揮發(fā)性物質僅有α-呋喃甲醇，共有揮發(fā)性物質有29種。B11樣品共檢出揮發(fā)性物質42種，其特有揮發(fā)性化合物有13種，分別是正丙酸乙酯、庚酸乙酯、丁二酸二乙酯、9-癸烯酸乙酯，癸酸乙酯、2,2,4-三甲基-1,3-戊二醇二異丁酸酯、α-呋喃甲醇、乙醛、3-甲基丁醛、3-戊烯-2-酮、壬酸、苯乙烯、4-乙基苯酚；B12樣品共檢出揮發(fā)性物質33種，其特有揮發(fā)性化合物有4種，分別為乙基-2-甲基丙酸酯，3-甲基丁酸乙酯、丁二仲醇、（S）-（+）-1,2-丙二醇。

結果表明，12種市售黑果腺肋花楸酒樣品揮發(fā)性香氣成分組成具有共性，但更顯示出差異。同一酒種揮發(fā)性香氣組成成分較為相似，體現(xiàn)在含有較多共同揮發(fā)性香氣物質成分而具有相似的氣味感官特性。根據(jù)酒種內共有成分占總檢出成分數(shù)的比例可得，不同黑果腺肋花楸干酒、白酒、啤酒間共有成分占比分別為39.06%、22.58%、63.04%，說明樣品間揮發(fā)性物質成分組成差異較大。通過比較發(fā)現(xiàn)，不同酒種間揮發(fā)性香氣物質的復雜程度也具有顯著差異。干型酒最為豐富，白酒最為單一，僅檢測出31種香氣物質。此結果可能與其制作工藝有關，黑果腺肋花楸白酒通常采用酒基浸提、勾兌制作，而干型酒則為發(fā)酵產(chǎn)生，因而發(fā)酵酒香氣更為豐富，如發(fā)酵型的獼猴桃白酒在陳釀期間檢出香氣物質共130種，且其香氣成分復雜且在整個過程中富有變化，在不同時間酒樣品中分別檢出香氣成分88種、99種、100種、104種、108種[19]，遠多于黑果腺肋花楸白酒。所有樣品檢測到的揮發(fā)性成分都以酯類物質為主。

對產(chǎn)地酒樣數(shù)目＞3個的產(chǎn)地酒樣進行分析。產(chǎn)自遼寧朝陽的酒樣共有成分有14種。為探究該地區(qū)是否具有揮發(fā)性香氣化合物上的共性，由于涉及干型酒和白酒兩個品類，去除干型酒共有成分11種，遼寧朝陽地區(qū)的酒樣共有成分為3種，分別為2-戊酮、苯甲酸乙酯、2-己烯酸乙酯。產(chǎn)自吉林通化的酒樣共有成分有12種。同上去除干型酒和白酒共有成分11種，得吉林通化地區(qū)的酒樣共有成分僅1種，為丁二仲醇。因此不同產(chǎn)地的黑果腺肋花楸可能具有揮發(fā)性香氣化合物可能具有共同的地區(qū)特異性成分。

2.1.2 揮發(fā)性化合物相對含量分析

黑果腺肋花楸酒樣品不同類別揮發(fā)性化合物占總揮發(fā)性物質占比熱圖見圖2。由表2可知，12種酒樣中除了樣品D2、D4、S6外，剩余酒樣中酯類物質相對含量最高，含量均超過50%，且在4個白酒樣品中酯類物質占比均超過90%。其中己酸乙酯為主要的酯類物質，平均占比超過20%，其被報道具有蘋果的香氣[20]，在D1、D3、L10樣品中為相對含量最高的酯類物質，分別為14.8%、27.4%、78.0%。值得一提的是，丁酸乙酯在所有樣品中均有檢出（0.37%～58.50%），該物質具有香蕉、草莓的香氣[21]。除了D2和L10樣品外，苯甲酸乙酯在剩余樣品中均檢測出（0.54%～3.14%）。丁酸異戊酯和丁酸-2-甲基丁酯僅在L7樣品中檢出，相對含量分別為0.47%和0.18%。D2、D4、S6酒樣中醇類物質占比最高。樣品D4醇類物質占比高達50%以上。具有苦杏仁味道的異戊醇[21]為主要的醇類物質，平均占比超過20%，除樣品L7外，其在剩余樣品中為相對含量最高的醇類物質。苯甲醇為樣品L7中相對含量最高的醇類物質，達1.81%。醇類物質所得結論與魏春雨等[22]得出的一致，但是其在5種黑果花楸酒中測定出的主要香氣成分還包括乙酸乙酯、乙酸異戊酯、異丁醇和2,3-戊二酮。對黑果腺肋花楸酒揮發(fā)性化合物含量總體特征進行分析得出，所有酒樣中己酸乙酯相對含量最高，甲酸乙酯相對含量最低。

圖2 黑果腺肋花楸酒樣品不同類別揮發(fā)性化合物占總揮發(fā)性物質占比熱圖Fig.2 Heat map of the percentage of different types of volatile compounds in the total volatile matter Aronia melanocarpa wine samples

除了酯類和醇類物質外，酸類物質也是黑果腺肋花楸酒揮發(fā)性物質較為重要的一部分。其中山梨酸和乙酸為占比相對較高。除L7、L9、B11、B12樣品外的其余所有樣品中均檢出乙酸（0.05%～1.62%）。除了上述提及的揮發(fā)性物質外，樣品中還檢測出了烷烴、烯烴等多種揮發(fā)性物質。對二甲苯和十二烷異丙基醚僅在樣品D1中檢出，相對含量分別為0.66%和0.37%。十一烷僅在樣品L8中檢出（0.31%）。

根據(jù)揮發(fā)性物質成分種類相對含量可將樣品大致分為兩類。由圖2可知，樣品D1、D2、D3、D4、S6揮發(fā)性物質成分種類相對含量較為相似，可劃分為一簇。而樣品D5與L7、L8、L9、L10揮發(fā)性物質成分種類相對含量較為相似，可劃分為另一簇。產(chǎn)地方面，聚類結果得出同一酒類樣品的揮發(fā)性化合物化學類別含量上的共性要顯著大于產(chǎn)地效應。結果表明，同一酒類的酒樣間的共性大于同一產(chǎn)地的酒樣間共性。綜上，本實驗通過GC-MS技術檢測了不同種類黑果腺肋花楸酒的揮發(fā)性化合物特征，GC-MS聚類分析結果顯示，黑果腺肋花楸酒樣品之間香氣特征存在著與酒種相關的差異和共性。

2.2 電子鼻結果分析

電子鼻是一種模擬嗅覺功能的人工嗅覺儀器，包含氣敏傳感器陣列、信號處理系統(tǒng)和模式識別系統(tǒng)3部分。樣品氣味分子被氣敏傳感器吸附后產(chǎn)生信號，信號被傳送到信號處理系統(tǒng)處理后最終由模式識別系統(tǒng)對信號處理的結果做出判斷[23]。電子鼻作為一種可以快速檢測食品風味的工具，在行業(yè)中得到廣泛應用。本試驗采用PEN3電子鼻的金屬氧化物電子鼻傳感器吸附了各組樣品不同氣味分子后在其表面進行信號轉化，從而得到不同的響應值。PEN3電子鼻10個傳感器特征見表3[24]。

表3 電子鼻傳感器性能Table 3 Performance of electronic nose sensor

不同黑果腺肋花楸酒樣品電子鼻傳感器響應信號平衡后的平均響應值柱狀圖見圖3。由圖3可知，黑果腺肋花楸酒樣品在傳感器W5S、W1S、W1W、W2S平均響應值較高，而在傳感器W1C響應值最低。由上述對GC-MS的結果可知，揮發(fā)性香氣成分中芳烴成分相對含量較低（0.31%～3.84%）。與電子鼻傳感器所得結果一致。白酒樣品L7、L8、L9、L10在各個傳感器響應值均較高，其中在W5S平均響應值最高。啤酒樣品B11和B12在各傳感器響應值普遍偏低，尤其在W5S傳感器上與高值樣品差距明顯。

圖3 不同黑果腺肋花楸酒樣品電子鼻檢測平均響應值柱狀圖Fig.3 Histogram of average response value of electronic nose detection of Aronia melanocarpa wine samples

不同市售黑果腺肋花楸酒產(chǎn)品電子鼻響應值進行線性判別分析（liner discriminant analysis，LDA）的結果見圖4。LDA是一種是將高維的模式樣本投影到最佳鑒別矢量空間的的典型算法。通過LDA可以抽取分類信息和壓縮特征空間維數(shù)，其中空間距離較為接近的樣品在性質上也較為相似[26]。由圖4可知，樣品LD1和LD2的總方差貢獻率為96.4%，其中樣品LD1的方差貢獻率為64.6%，樣品LD2的方差貢獻率為31.8%。大部分樣品間無重疊部分，表示大部分樣品間香氣特征存在差異，可以進行區(qū)分。樣品D2和D3間有重疊區(qū)域表示二者香氣特征難以完全區(qū)別。由各樣品間的空間距離可得，一般情況下同酒種間距離較近，如啤酒樣品B11和B12以及干型酒和甜型酒樣品D1、D2、D3、D4、S6距離較近。特別的是，干型酒樣品D5更接近于白酒樣品L7、L8、L9、L10，這一結果與上述由圖2所得到的聚類結果一致。綜上，通過電子鼻檢測不同種類黑果腺肋花楸酒的揮發(fā)性化合物特征，電子鼻線性判別分析顯示了黑果腺肋花楸酒樣品之間可進行區(qū)分。

圖4 黑果腺肋花楸酒樣品電子鼻檢測響應值線性判別分析結果Fig.4 Linear discriminant analysis results of response value of e-nose detection of Aronia melanocarpa wine samples

3 結論

對12種市售黑果腺肋花楸酒產(chǎn)品進行GC-MS分析結合電子鼻分析，系統(tǒng)、全面、多維度的表征了黑果腺肋花楸酒香氣風味物質的差異。12種酒樣共檢測出103種揮發(fā)性化合物，其中酯類42種，醇類21種，醛類7種，酮類6種，酸類10種，烯烴類4種。辛酸乙酯和丁酸乙酯是12種酒樣的共同化合物，其平均相對含量分別為12.86%和13.70%。電子鼻檢測LDA結果與GC-MS檢測CA結果顯示，黑果腺肋花楸酒樣品之間香氣特征存在差異和共性，利用其揮發(fā)性香氣成分的GC-MS及電子鼻檢測結果進行區(qū)分和鑒別。本研究結果為未來更精確探究黑果腺肋花楸酒樣品的香氣風味特征提供了理論基礎。