唐 潔，楊 強(qiáng)，劉源才，江 威，夏金陽(yáng)，陳申習(xí)

（勁牌有限公司 勁牌研究院 中藥保健食品質(zhì)量與安全湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 大冶 435100）

米根霉（Rhizopus oryzae）在分類學(xué)上屬于真核生物界的接合菌門、接合菌綱、毛霉目、毛霉科中的根霉屬，是自然界中廣泛存在的一類真菌，并經(jīng)過美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局認(rèn)證的安全菌株[1]。R.oryzae能夠利用不同的化合物和多糖作為能源和碳源，產(chǎn)生許多代謝產(chǎn)物，主要有酶類、酯類、有機(jī)酸、風(fēng)味物質(zhì)、聚合物和生物乙醇等，其代謝產(chǎn)物如乳酸、富馬酸、L-蘋果酸及消化酶等有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，可廣泛用于食品、醫(yī)藥及飼料等行業(yè)[2]。R.oryzae優(yōu)勢(shì)驅(qū)動(dòng)力是其產(chǎn)生的淀粉酶和糖化酶可以將淀粉分解為葡萄糖，并產(chǎn)生乳酸和高級(jí)醇等風(fēng)味物質(zhì)，在釀酒發(fā)酵初期起關(guān)鍵作用[3]。小曲清香型白酒中R.oryzae在發(fā)酵初期占主導(dǎo)，主要起糖化作用，將淀粉水解為其他菌株可利用的糖類物質(zhì)[4]。

微生物菌株的高產(chǎn)特性除其遺傳特性決定外，其所處環(huán)境條件對(duì)其生長(zhǎng)以及代謝途徑也有很大的影響。由于R.oryzae含有豐富的糖化型淀粉酶，因此對(duì)碳源的利用較廣。但R.oryzae缺乏酸性蛋白酶，對(duì)氮源要求比較嚴(yán)格，偏好有機(jī)氮源，而一旦缺乏有機(jī)氮，則會(huì)影響菌絲的生長(zhǎng)和產(chǎn)酶酶活或?qū)е戮N退化[1]。GHOSH B等[5]考察了不同氮源對(duì)根霉菌株產(chǎn)異淀粉酶的影響，發(fā)現(xiàn)蛋白胨和尿素促進(jìn)了該酶的產(chǎn)量。此外，R.oryzae需要大量的其他微量元素來進(jìn)行生長(zhǎng)代謝。GHOSH B等[6]研究發(fā)現(xiàn)，Mn2+、Fe3+、Ba2+、Mg2+和Ca2+能促進(jìn)R.oryzaePR7異淀粉酶酶活力的增加。FUJIO Y等[7]研究發(fā)現(xiàn)，在霉菌基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基中添加Zn2+和Ca2+有利于R.oryzae糖化酶酶活的提高。劉延波等[8]從大曲中分離篩選得到1株耐高溫根霉菌，通過單因素試驗(yàn)測(cè)定其糖化酶活力，結(jié)合響應(yīng)面分析法優(yōu)化其培養(yǎng)條件，測(cè)得其糖化酶活力在料水比為5∶3（g∶mL）、氮源添加量為0.4%、培養(yǎng)時(shí)間為5 d時(shí)最高，經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證酶活力達(dá)到162.38 U/g，與預(yù)測(cè)值基本接近。

實(shí)際生產(chǎn)中，根霉麩曲的制作流程為：根霉一級(jí)種（試管種）→根霉二級(jí)種（液態(tài)培養(yǎng)）→根霉麩曲。隨著R.oryzae傳代次數(shù)的增加、漫長(zhǎng)的生產(chǎn)周期和復(fù)雜的培養(yǎng)成分往往會(huì)產(chǎn)生有害物質(zhì)，導(dǎo)致R.oryzae較易出現(xiàn)退化現(xiàn)象[3]。為降低生產(chǎn)成本及提高生產(chǎn)效率，R.oryzae培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分、培養(yǎng)溫度等因素對(duì)其是否能發(fā)揮最大的產(chǎn)酶生理活性、生產(chǎn)出優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的酒曲起著至關(guān)重要的作用。而文獻(xiàn)報(bào)道更多的是對(duì)根霉麩曲制作條件[13-16]及R.oryzae單菌株產(chǎn)酶活性條件的優(yōu)化[9-12]，很少對(duì)制作根霉麩曲的種子生長(zhǎng)及糖化性能進(jìn)行系統(tǒng)研究，且同種屬不同株的R.oryzae生長(zhǎng)及最佳糖化性能的培養(yǎng)條件不同。因此，優(yōu)化發(fā)酵條件和培養(yǎng)基成分，創(chuàng)造適合菌體生長(zhǎng)和代謝的最佳條件以充分發(fā)揮菌種的潛力，是提高R.oryzae糖化性能的關(guān)鍵。否則即使有了優(yōu)良菌株，菌種的生產(chǎn)能力也不能充分體現(xiàn)。因此，本研究通過單因素、正交試驗(yàn)對(duì)R.oryzaeG1培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，以充分發(fā)揮菌株的糖化性能，進(jìn)一步提高菌株的發(fā)酵性能。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

米根霉（Rhizopus oryzae）G1：勁牌公司酒曲中分離并應(yīng)用于小曲清香型白酒生產(chǎn)中。

早秈米、瓊脂、馬鈴薯、大麥芽、麩皮：市售；葡萄糖、乳糖、海藻糖、低聚果糖、蔗糖、淀粉、牛肉浸膏、酵母浸粉、蛋白胨、（NH4）2SO4、（NH4）2HPO4、檸檬酸銨、NaNO3、ZnSO4、KCl、KH2PO4、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、CaCl2、孟加拉紅培養(yǎng)基等均為分析純或生化試劑：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

霉菌完全合成培養(yǎng)基[17]：蔗糖100 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，（NH4）2SO43 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.1 g/L，KH2PO42 g/L，瓊脂粉20 g/L；高粱汁瓊脂培養(yǎng)基、酵母膏胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養(yǎng)基、麩皮培養(yǎng)基：按參考文獻(xiàn)[18]方法配制；馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基、麩皮汁瓊脂培養(yǎng)基：按參考文獻(xiàn)[19]方法配制。

米曲汁瓊脂培養(yǎng)基[20]：以種曲∶水=1∶4補(bǔ)足水，加入適量的糖化酶，55 ℃糖化24 h，過濾，濾液糖度降至5°Bx，pH調(diào)到6.0，加入20%瓊脂粉。

麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基：取適量麥芽浸粉加水溶解，使糖度達(dá)10°Bx，加入20%瓊脂粉。

以上培養(yǎng)基均121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

FE20 pH計(jì)、AL204電子分析天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；BCM-1600A潔凈工作臺(tái)：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；BSC-150 恒溫恒濕培養(yǎng)箱、YXQ-LS-75-SII立式壓力蒸汽滅菌器：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；SFG-02B電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備儀器廠；HYCD-205冷藏冷凍箱：青島海爾特種電器有限公司；WFJ2000 可見光光度計(jì)：尤尼科（上海）儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1R.oryzaeG1培養(yǎng)條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)

培養(yǎng)基種類對(duì)R.oryzaeG1糖化能力的影響：將R.oryzaeG1分別接種至米曲汁瓊脂、高粱汁瓊脂、麥芽汁瓊脂、麩皮汁瓊脂、PDA、YPD瓊脂、孟加拉紅培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并以霉菌完全合成培養(yǎng)基為對(duì)照，培養(yǎng)3 d后將菌絲體接種至麩皮培養(yǎng)基制備成麩曲，并測(cè)其糖化力和糖化酶酶活。

氮源對(duì)R.oryzaeG1糖化能力的影響：以1.3.1確定的最佳培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別添加3 g/L的酵母浸粉、蛋白胨、牛肉浸膏、（NH4）2SO4、檸檬酸銨、（NH4）2HPO4、NaNO3，并以不添加氮源的培養(yǎng)基為對(duì)照，培養(yǎng)3 d后將菌絲體接種至麩皮培養(yǎng)基制備成麩曲，測(cè)其糖化力和糖化酶酶活，考察對(duì)R.oryzaeG1糖化性能的影響，篩選出最優(yōu)氮源。確定最優(yōu)氮源后，分別向培養(yǎng)基中添加1 g/L、3 g/L、6 g/L、9 g/L、12 g/L和15 g/L的最優(yōu)氮源，考察氮源添加量對(duì)R.oryzaeG1糖化性能的影響。

碳源對(duì)R.oryzaeG1糖化能力的影響：以1.3.1確定的最佳培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別添加20 g/L的淀粉、低聚果糖、蔗糖、海藻糖、葡萄糖、乳糖、甘油，并以不添加碳源的培養(yǎng)基為對(duì)照，培養(yǎng)3 d后將菌絲體接種至麩皮培養(yǎng)基制備成麩曲，測(cè)其糖化力和糖化酶酶活，考察對(duì)R.oryzaeG1糖化性能的影響，篩選出最優(yōu)碳源。確定最優(yōu)碳源后，分別向培養(yǎng)基中添加15 g/L、20 g/L、25 g/L、30 g/L、35 g/L和40 g/L的最優(yōu)碳源，考察碳源添加量對(duì)R.oryzaeG1糖化性能的影響。

無機(jī)鹽對(duì)R.oryzaeG1糖化能力的影響：以1.3.1確定的最佳培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別添加0.5 g/L的KH2PO4、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、CaCl2、ZnSO4，并以不添加無機(jī)鹽的培養(yǎng)基為對(duì)照，培養(yǎng)3 d后將菌絲體接種至麩皮培養(yǎng)基制備成麩曲，測(cè)其糖化力和糖化酶酶活，考察對(duì)R.oryzaeG1糖化性能的影響，篩選出最優(yōu)無機(jī)鹽。分別向確定的培養(yǎng)基中添加0.1 g/L、0.5 g/L、1 g/L、1.5 g/L、2 g/L和2.5 g/L的最優(yōu)無機(jī)鹽，優(yōu)化無機(jī)鹽添加量。

培養(yǎng)溫度對(duì)R.oryzaeG1糖化能力的影響：將R.oryzaeG1接種至1.3.1確定的最佳培養(yǎng)基中，參考文獻(xiàn)[13]選取了不同培養(yǎng)溫度（25 ℃、30 ℃、33 ℃、37 ℃）進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)3 d后將菌絲體接種至麩皮培養(yǎng)基制備成麩曲，測(cè)其糖化力及糖化酶酶活。

1.3.2R.oryzaeG1一級(jí)種培養(yǎng)條件優(yōu)化正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以蛋白胨添加量、葡萄糖添加量、CaCl2添加量和培養(yǎng)溫度為4個(gè)因素，各因素設(shè)計(jì)3水平，采用L9（34）正交試驗(yàn)，以糖化力為評(píng)價(jià)指標(biāo)，確定R.oryzaeG1一級(jí)種產(chǎn)糖化力最佳培養(yǎng)條件。正交試驗(yàn)因素與水平如表1所示。

表1 米根霉G1培養(yǎng)條件優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal tests for culture conditions optimization of Rhizopus oryzae G1

1.3.3 測(cè)定方法

糖化力：采用化飯法[20]。糖化力定義為每1 g麩曲糖化100 g大米飯24 h所生成的葡萄糖的質(zhì)量（g），單位為g/100 g。

糖化酶酶活：采用3,5-二硝基水楊酸（dinitrosalicylic acid，DNS）法[21]。酶活定義為1 g絕干麩曲在35 ℃、pH4.6條件下1 h內(nèi)分解可溶性淀粉生成1 mg葡萄糖所需的酶量為1個(gè)酶活力單位，U/g。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

采用Origin2018進(jìn)行繪圖，正交試驗(yàn)助手設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)和SPSS 19.0對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)

2.1.1 培養(yǎng)基種類對(duì)R.oryzaeG1產(chǎn)酶及糖化力的影響

由圖1可知，麩皮汁瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)的R.oryzaeG1糖化力最高，為30.73 g/100 g，其次是米曲汁瓊脂和PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)的；高粱汁瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)的R.oryzaeG1糖化酶酶活最高，其次是麩皮汁、米曲汁和麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基，最低的為孟加拉紅培養(yǎng)基培養(yǎng)的R.oryzaeG1。文獻(xiàn)報(bào)道，長(zhǎng)期單一使用某種培養(yǎng)基易使菌株發(fā)生退化[22-24]。本研究考察了不同培養(yǎng)基培養(yǎng)R.oryzaeG1生長(zhǎng)及生產(chǎn)特性，這為R.oryzaeG1長(zhǎng)期培養(yǎng)防止退化提供了試驗(yàn)數(shù)據(jù)和參考。因此，選擇麩皮汁瓊脂培養(yǎng)基作為R.oryzaeG1生長(zhǎng)及糖化性能最佳培養(yǎng)基備選。

圖1 不同種類培養(yǎng)基對(duì)米根霉G1產(chǎn)酶及糖化力的影響Fig.1 Effect of different media on saccharification enzyme activity and saccharification ability of Rhizopus oryzae G1

2.1.2 氮源對(duì)R.oryzaeG1產(chǎn)酶及糖化力的影響

氮源是微生物生長(zhǎng)繁殖必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，不同氮源培養(yǎng)R.oryzaeG1生長(zhǎng)情況不同。文獻(xiàn)報(bào)道，相比無機(jī)氮源，R.oryzae更喜歡利用有機(jī)氮源[2]。由圖2可知，添加蛋白胨為氮源培養(yǎng)的R.oryzaeG1糖化力最高，為31 g/100 g，其次是添加牛肉浸膏、酵母浸粉為氮源；且添加有機(jī)氮源培養(yǎng)的R.oryzaeG1糖化力明顯高于無機(jī)氮源。添加酵母浸粉為氮源培養(yǎng)的R.oryzaeG1糖化酶酶活最高，添加檸檬酸銨為氮源培養(yǎng)的R.oryzaeG1糖化酶酶活最低，而添加其他氮源培養(yǎng)的該菌株糖化酶酶活相差不大。因此選擇R.oryzaeG1產(chǎn)酶的最佳添加氮源為蛋白胨。

圖2 氮源種類對(duì)米根霉G1產(chǎn)酶及糖化力的影響Fig.2 Effect of nitrogen source type on saccharification enzyme activity and saccharification ability of Rhizopus oryzae G1

在確定R.oryzaeG1產(chǎn)酶的最佳添加氮源為蛋白胨的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步優(yōu)化氮源添加量。由圖3可知，當(dāng)?shù)鞍纂颂砑恿繛? g/L時(shí)，糖化力和糖化酶酶活均最高，隨后糖化力和酶活均下降，這可能與培養(yǎng)基中碳氮比有關(guān)，在一定的范圍內(nèi)菌株才能發(fā)揮最佳的性能。因此，選擇R.oryzaeG1產(chǎn)酶最佳蛋白胨添加量為3 g/L。

圖3 蛋白胨添加量對(duì)米根霉G1產(chǎn)酶及糖化力的影響Fig.3 Effect of peptone addition on saccharification enzyme activity and saccharification ability of Rhizopus oryzae G1

2.1.3 碳源對(duì)R.oryzaeG1產(chǎn)酶及糖化力的影響

一般來說，R.oryzae主要以葡萄糖為碳源，但其可以使用不同糖類用于生長(zhǎng)，如纖維二糖、半乳糖、乳糖、海藻糖、核糖和木糖等。GHOSH B等[25]評(píng)估了不同碳源對(duì)R.oryzaePR7MTCC9642異淀粉酶產(chǎn)生的影響，發(fā)現(xiàn)這種微生物可以使用淀粉和糖原來產(chǎn)酶。添加乳糖和甘油培養(yǎng)菌絲R.oryzaeG1生長(zhǎng)情況一般，其余菌絲均生長(zhǎng)旺盛。由圖4可知，添加葡萄糖為碳源培養(yǎng)的R.oryzaeG1糖化力最高，為31.67 g/100 g，添加乳糖為碳源的糖化力最低；添加海藻糖、蔗糖和乳糖為碳源培養(yǎng)的菌絲制備麩曲糖化酶酶活比較低，添加其他碳源培養(yǎng)酶活較高且相差不大。文獻(xiàn)報(bào)道，糖化能力取決于糖化酶活性的表達(dá)，而糖化酶相關(guān)基因的表達(dá)受各種碳源的影響，導(dǎo)致糖化能力的差異[3]。因此，選擇R.oryzaeG1產(chǎn)酶的最佳添加碳源為葡萄糖。

圖4 碳源種類對(duì)米根霉G1產(chǎn)酶及糖化力的影響Fig.4 Effect of carbon source type on saccharification enzyme activity and saccharification ability of Rhizopus oryzae G1

在確定R.oryzaeG1產(chǎn)酶的最佳添加碳源為葡萄糖的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步優(yōu)化碳源添加量。由圖5可知，當(dāng)葡萄糖添加量為20 g/L時(shí)，糖化力和糖化酶酶活均最高，隨后糖化力和酶活均下降。葡萄糖添加過高會(huì)加大培養(yǎng)基的滲透壓，不利于菌體的生長(zhǎng)，從而影響菌株的性能。因此，選擇R.oryzaeG1產(chǎn)酶最佳葡萄糖添加量為20 g/L。

圖5 碳源添加量對(duì)米根霉G1產(chǎn)酶及糖化力的影響Fig.5 Effect of carbon source addition on saccharification enzyme activity and saccharification ability of Rhizopus oryzae G1

2.1.4 無機(jī)鹽對(duì)R.oryzaeG1產(chǎn)酶及糖化力的影響

R.oryzae需要其他微量元素來進(jìn)行生長(zhǎng)代謝和產(chǎn)酶，無機(jī)鹽與酶的激活等作用息息相關(guān)。本試驗(yàn)選取了根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[6-7]有利于R.oryzae糖化酶酶活提高的Zn2+、Ca2+、Fe2+、Mg2+以及調(diào)節(jié)滲透壓的K+。由圖6可知，與對(duì)照不添加無機(jī)鹽相比，添加MgSO4·7H2O、ZnSO4對(duì)R.oryzaeG1產(chǎn)糖化力沒有提升反而有所抑制。添加FeSO4·7H2O、CaCl2、KH2PO4對(duì)產(chǎn)糖化力有促進(jìn)作用，尤以添加CaCl2促進(jìn)R.oryzaeG1糖化性能的提升，糖化力和糖化酶酶活均最高。因此，選擇R.oryzaeG1產(chǎn)酶的最佳添加無機(jī)鹽為CaCl2。

圖6 無機(jī)鹽種類對(duì)米根霉G1產(chǎn)酶及糖化力的影響Fig.6 Effect of inorganic salt type on saccharification enzyme activity and saccharification ability of Rhizopus oryzae G1

在確定R.oryzaeG1產(chǎn)酶的最佳添加無機(jī)鹽為CaCl2的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步優(yōu)化無機(jī)鹽添加量。當(dāng)CaCl2添加量為1.5 g/L時(shí)，R.oryzaeG1產(chǎn)糖化力和糖化酶酶活最高。CaCl2作為無機(jī)鹽可以提供與酶活力相關(guān)的Ca2+，從而促進(jìn)菌體的代謝產(chǎn)酶。因此，選擇R.oryzaeG1產(chǎn)酶最佳CaCl2添加量為1.5 g/L。

圖7 無機(jī)鹽添加量對(duì)米根霉G1產(chǎn)酶及糖化力的影響Fig.7 Effect of inorganic salt addition on saccharification enzyme activity and saccharification ability of Rhizopus oryzae G1

2.1.5 培養(yǎng)溫度對(duì)R.oryzaeG1產(chǎn)酶及糖化力的影響

R.oryzae在合適的培養(yǎng)溫度條件下生長(zhǎng)時(shí)間短且菌絲體生長(zhǎng)良好[26]，且溫度是影響微生物產(chǎn)酶的重要因素之一[27]，因此考察了不同培養(yǎng)溫度對(duì)R.oryzaeG1生長(zhǎng)的影響，不同培養(yǎng)溫度培養(yǎng)3 d后菌絲生長(zhǎng)情況見圖8。由圖8可知，氣生菌絲茂密程度為25 ℃＞30 ℃＞33 ℃＞37 ℃，表明此菌株隨著培養(yǎng)溫度的升高，對(duì)氣生菌絲的繁殖有一定的抑制。尤其當(dāng)培養(yǎng)溫度達(dá)37 ℃時(shí)，R.oryzaeG1菌絲偏黃、孢子量較少。其余培養(yǎng)溫度培養(yǎng)下的根霉G1菌絲白色，且孢子量較多。

圖8 不同培養(yǎng)溫度條件下米根霉G1生長(zhǎng)情況Fig.8 Growth status of Rhizopus oryzae G1 at different culture temperature conditions

由表2可知，R.oryzaeG1在37 ℃和25 ℃條件下培養(yǎng)時(shí)糖化力最高，均達(dá)到30 g/100 g；30 ℃和33 ℃條件下培養(yǎng)的糖化力相對(duì)較低。結(jié)合菌絲生長(zhǎng)情況，選擇R.oryzaeG1產(chǎn)酶最佳培養(yǎng)溫度為25 ℃。

表2 不同培養(yǎng)溫度條件下培養(yǎng)的米根霉G1糖化力及糖化酶酶活Table 2 Saccharification ability and saccharification enzyme activity of Rhizopus oryzae G1 cultured at different temperature conditions

2.2 培養(yǎng)條件優(yōu)化正交試驗(yàn)

由表3可知，各因素對(duì)R.oryzaeG1糖化力影響程度依次為（A）蛋白胨添加量＞（B）葡萄糖添加量＞（D）培養(yǎng)溫度＞（C）CaCl2添加量。由直觀分析可以看出，R.oryzaeG1糖化能力最佳培養(yǎng)條件為A2B3C3D2，即在麩皮汁瓊脂培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加3 g/L蛋白胨、30 g/L葡萄糖、2.5 g/L CaCl2，培養(yǎng)溫度為30 ℃。由表4可知，主體間效應(yīng)的檢驗(yàn)中校正模型的P＜0.01代表該模型具有極其顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且蛋白胨添加量、葡萄糖添加量和培養(yǎng)溫度對(duì)糖化力具有極顯著影響（P＜0.01），為主要因素，無機(jī)鹽添加量對(duì)糖化力具有顯著影響（P＜0.05），為次要因素[28]。

表3 米根霉G1糖化能力培養(yǎng)條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 3 Results and analysis of orthogonal tests for culture conditions optimization of Rhizopus oryzae G1

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 4 Analysis of variance of orthogonal tests results

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

正交試驗(yàn)直接得出的是試驗(yàn)組6（在麩皮汁瓊脂培養(yǎng)基上添加3 g/L蛋白胨、30 g/L葡萄糖和0.5 g/L CaCl2，培養(yǎng)溫度為30 ℃）糖化力最高，因此將此結(jié)果與方差分析的結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證對(duì)比，并以實(shí)際生產(chǎn)上常用的米曲汁瓊脂培養(yǎng)基為對(duì)照，進(jìn)一步確定培養(yǎng)R.oryzaeG1一級(jí)種最佳糖化性能的培養(yǎng)條件，結(jié)果見表5。由表5可知，組合2#培養(yǎng)的菌體制備的麩曲糖化力和糖化酶酶活均高于組合1#和對(duì)照培養(yǎng)的菌體制備的麩曲，優(yōu)化后糖化力達(dá)到33.97 g/100 g。因此，確定了R.oryzaeG1一級(jí)種（試管或平皿培養(yǎng)）最佳的培養(yǎng)條件為在麩皮汁瓊脂培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加3 g/L蛋白胨、30 g/L葡萄糖和2.5 g/L CaCl2，培養(yǎng)溫度為30 ℃。

表5 米根霉G1一級(jí)種最佳培養(yǎng)條件的確定Table 5 Determination of optimum culture conditions for first degree species of Rhizopus oryzae G1

3 結(jié)論

糖化能力是R.oryzaeG1最重要的功能之一，但在實(shí)際生產(chǎn)中此菌株較易出現(xiàn)退化現(xiàn)象，主要表現(xiàn)為生產(chǎn)的麩皮曲糖化力的下降導(dǎo)致了酒曲糖化性能降低，從而使酒曲質(zhì)量不合格。根霉麩曲是由R.oryzae一級(jí)種、二級(jí)種逐漸擴(kuò)大培養(yǎng)而成，R.oryzaeG1一級(jí)種作為根霉麩曲的最原始種子，對(duì)其糖化性能的提升是提高根霉麩曲糖化力的關(guān)鍵。本研究首先通過單因素試驗(yàn)分別對(duì)R.oryzaeG1一級(jí)種培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，再通過正交試驗(yàn)和驗(yàn)證試驗(yàn)確定了此菌株一級(jí)種處于最佳糖化性能的培養(yǎng)條件。結(jié)果表明，氮源添加量、碳源添加量和培養(yǎng)溫度對(duì)糖化力具有極顯著影響（P＜0.01），為主要因素，無機(jī)鹽添加量對(duì)糖化力具有顯著影響（P＜0.05），為次要因素。R.oryzaeG1一級(jí)種最佳培養(yǎng)條件為在麩皮汁瓊脂培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加3 g/L蛋白胨、30 g/L葡萄糖和2.5 g/L CaCl2，培養(yǎng)溫度為30 ℃，在此條件下制備的麩曲糖化力為33.97 g/100 g，糖化酶酶活為5 536.64 U/g。本研究為維持R.oryzaeG1一級(jí)種高效的糖化性能、防止菌種退化提供了數(shù)據(jù)參考。下一步將優(yōu)化好的參數(shù)應(yīng)用于生產(chǎn)提高純種根霉麩曲糖化能力，進(jìn)而提升酒曲質(zhì)量。