鄒修為，熊有明，謝劍波，肖志鵬，顏 瑾，陳 武，唐前君，王運生

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學植物保護學院，湖南 長沙 410128；2.衡陽市煙草公司，湖南 衡陽421001；3.邵陽市新邵縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，湖南 新邵 422900）

辣椒（Capsicum annuumL.）是我國種植面積最大的蔬菜作物之一[1]。隨著我國設施蔬菜栽種面積逐年增加，辣椒疫病已成為嚴重影響辣椒產(chǎn)量和品質(zhì)的一種毀滅性土傳病害。其病原菌辣椒疫霉（Phytophthora capsici）寄主廣泛，可以在土壤中長期存活，一旦傳入就難以根治，嚴重時可造成毀棚，帶來巨大經(jīng)濟損失。隨著人們環(huán)保意識的不斷增強，生物防治已逐漸成為植物病害綠色防控的重要選項，在防治蔬菜病害方面優(yōu)勢凸顯。已有多種辣椒疫霉生防菌的報道[2-3]，部分生防菌兼具拮抗和促生作用[4]，大多數(shù)生防菌是從根際土壤中分離得到的。

黑水虻（Hermetia illucensL.）作為腐食性昆蟲，能夠取食禽畜糞便和生活垃圾，轉(zhuǎn)化為昆蟲蛋白質(zhì)和脂肪。黑水虻蟲糞，又稱蟲沙，可開發(fā)為優(yōu)質(zhì)有機肥，從黑水虻腸道中挖掘有益微生物，可直接利用黑水虻幼蟲生物反應器生產(chǎn)生物有機肥。近年來，黑水虻作為環(huán)保昆蟲，廣泛應用于禽畜糞便、餐廚垃圾、農(nóng)業(yè)有機廢棄物的資源化利用[5]。黑水虻腸道中含有非常豐富的微生物，這些腸道微生物對于黑水虻消化吸收有機垃圾中的營養(yǎng)物質(zhì)具有十分重要的作用[6]。同時，豐富的黑水虻腸道微生物也是挖掘有益微生物的寶庫，例如具有抗菌活性的枯草芽孢桿菌[7]、產(chǎn)蛋白酶和有機磷分解酶的有益菌等[8]。黑水虻蟲糞可作為優(yōu)質(zhì)有機肥，黑水虻腸道微生物具有作為生物菌肥益生菌開發(fā)的潛力，來自黑水虻腸道的有益微生物，由于在同一生態(tài)位經(jīng)歷協(xié)同進化，經(jīng)黑水虻腸道后可在蟲糞中長時間穩(wěn)定存活，從而延長生物菌肥的貨架期。

Y4-39 菌株就是筆者所在實驗室前期從黑水虻腸道中分離、純化的一株對辣椒疫霉菌具有高效抑菌活性的生防菌，該研究通過形態(tài)學、生理生化檢測及16S rDNA 序列對其進行鑒定，并測試了該菌株所產(chǎn)抑菌物質(zhì)對熱、光及蛋白酶的敏感性，還通過盆栽試驗比較了不同發(fā)酵液劑量處理對辣椒疫霉的防治效果，以期為該菌株的后續(xù)開發(fā)利用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲和菌株

黑水虻種群為課題組保存種群，最初來源為武漢品系。辣椒疫霉病菌（Phytophthora capsici）LYB-1 由湖南省農(nóng)業(yè)科學院蔬菜研究所辣椒課題組提供。

1.2 黑水虻腸道菌的分離

選取 3～5 頭4 齡健康黑水虻幼蟲，首先用無菌水清洗蟲體3 次，然后用75%乙醇浸泡幼蟲1 min，再用0.1%的升汞浸泡2 min，用無菌水清洗幼蟲3 次，置于無菌濾紙上，在無菌條件下解剖取出幼蟲的腸道，加入0.5 mL 無菌水于研缽中進行研磨，然后再加入1.5 mL 無菌水，稀釋成不同濃度梯度菌懸液，取適宜稀釋度的菌懸液涂布在酪蛋白篩選培養(yǎng)基上進行篩選，選取抗辣椒疫霉菌效果較好的菌株進行后續(xù)試驗。

1.3 菌株形態(tài)學及生理生化鑒定

取分離純化的菌株于LB 平板劃線培養(yǎng)、30℃培養(yǎng)24 h 后觀察菌落形態(tài)，培養(yǎng)72 h 后在顯微鏡下觀察其芽胞形態(tài)，并進行革蘭氏染色、甲基紅試驗、V-P試驗、淀粉水解試驗、接觸酶試驗、糖醇類發(fā)酵試驗和耐鹽試驗等生理生化試驗。

1.4 16S rDNA 序列擴增及分析

將篩選保存的菌株（編號Y4-39）在30℃下培養(yǎng)24 h（已達對數(shù)生長期），吸取1.5 mL 菌液置于2.0 mL 離心管中，12 000 r/min 離心3 min，棄上清得到菌體沉淀。利用Easy Pure Bacteria Genomic DNA Kit 細菌基因組DNA 提取試劑盒提取Y4-39 菌株的基因組DNA。用細菌通用引物27F 5′-AGAGTTTGATCCTGG CTCAG-3′ 和1492R 5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′進行PCR 擴增，純化的PCR 產(chǎn)物送往上海生工生物工程股份有限公司測序，組裝得到16S rDNA 一致序列后在NCBI 中進行Blastn 序列比對[9]，選擇rRNA/ITS 庫作為目標序列庫，找出相似度較高的的序列。用ClustalW 程序[10]進行多序列比對，用MEGA7.0 軟件[11]構(gòu)建NJ 樹。

1.5 拮抗菌Y4-39 發(fā)酵液制備

用滅菌牙簽挑選單菌落接種到LB液體培養(yǎng)基中，30℃、200 r/min 振蕩培養(yǎng)24 h。然后按照1%的接種量接種至LB 液體培養(yǎng)基擴繁，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，發(fā)酵液用于后續(xù)對峙試驗，用無菌培養(yǎng)液調(diào)整菌體含量至1×108CFU/mL，用于后續(xù)的盆栽試驗。

1.6 辣椒疫霉孢子液的制備

將辣椒疫霉菌接種在PDA 平板上，25℃黑暗環(huán)境下培養(yǎng)7 d，待其產(chǎn)生大量孢子后，用無菌水洗滌3次，每次加入無菌水2 mL，用無菌毛筆將孢子洗刷下來置于三角瓶中，在光照條件下靜置24 h，然后置于4℃冰箱中靜置30 min，收集孢子液，用無菌水調(diào)整游動孢子含量約1×105CFU/mL，用于后續(xù)接種試驗。

1.7 抑菌物質(zhì)穩(wěn)定性測試

發(fā)酵結(jié)束后，取發(fā)酵液以8 000 r/min 的轉(zhuǎn)速離心5 min 將菌體沉淀，吸取10 mL 上層清液，分別進行如下處理。（1）熱穩(wěn)定性測試溫度設置：將上清液分別置于30、40、60、80、100、120℃（120℃處理在高壓蒸汽滅菌鍋中進行）水浴中處理30 min，以離心后的發(fā)酵液上清液為對照（CK）；（2）蛋白酶穩(wěn)定性測試：分別用蛋白酶K、鏈酶蛋白酶、胰蛋白酶處理上清液，酶濃度為500 g/mL，37℃水浴處理30 min，以未加蛋白酶的處理為對照（CK）；（3）紫外線穩(wěn)定性測試處理：將上清液在紫外燈（254 nm）和自然光下分別照射1、2、4、8、16、24 h，以離心后的發(fā)酵液上清液為對照（CK）。將上述處理過的上清液（10 mL）添加到30 mL 融化冷至50℃以下的PDA 培養(yǎng)基中，充分混勻后倒平板；用無菌接種環(huán)挑取直徑為5 mm 的疫霉病菌菌餅置于平板中央，25℃培養(yǎng)，待其病原菌剛長滿空白對照平板，用十字交叉法測量其處理平板的病原菌菌落直徑，每處理重復3 次。

1.8 生防菌對辣椒疫病的防治作用試驗

辣椒苗（湘研5 號）先在育苗盤中長至8～10 葉，然后移栽至直徑為10 cm 的花盆中，盆內(nèi)裝有滅菌基質(zhì)和滅菌土壤（體積比為1∶1），每盆移栽1株辣椒苗。隨機分為5 組，每組12 盆。設如下處理：T1，10 mL發(fā)酵液+20 mL 無菌培養(yǎng)液；T2，20 mL 發(fā)酵液+10 mL 無菌培養(yǎng)液；T3，30 mL 發(fā)酵液；CK1（陰性對照），30 mL 無菌培養(yǎng)液；CK2（陽性對照），30 mL 50%烯酰嗎啉可濕性粉劑1 000 倍液。將各處理溶液均勻澆灌在辣椒根圍土壤上，24 h 后在辣椒苗根部接種5 mL 辣椒疫霉孢子液（游動孢子含量1×105CFU/mL），保濕培養(yǎng)3 d 后進行常規(guī)管理。接種后10～15 d 調(diào)查發(fā)病情況。參照毛愛軍等[12]的辣椒疫病分級標準進行調(diào)查，計算病情指數(shù)和防治效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株Y4-39 的鑒定

2.1.1 生理生化鑒定經(jīng)劃線純化后的單菌落形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，菌株在LB 平板上28℃培養(yǎng)24 h 后，形成4～6 mm 的近似圓形的乳白色菌落（圖1），前期邊緣較整齊，表面較光滑，后期邊緣不整齊，表面粗糙顯皺狀；革蘭氏染色呈陽性（圖2），短桿狀，兩端鈍圓，能運動，發(fā)酵后期形成芽孢；能水解淀粉，V-P 試驗和接觸酶反應、葡萄糖產(chǎn)酸、硝酸鹽還原、明膠液化及檸檬酸鹽利用等試驗結(jié)果均為陽性（表1）。通過形態(tài)學與生理生化測定結(jié)果初步判斷該菌株為芽孢桿菌。如圖3 所示，菌株Y4-39 對辣椒疫霉菌有明顯拮抗作用。

圖1 菌株Y4-39 的菌落形態(tài)

圖2 菌株Y4-39 的革蘭氏染色結(jié)果

圖3 菌株Y4-39 對辣椒疫霉菌的拮抗作用

表1 菌株Y4-39 生理生化特性

2.1.2 16S rDNA序列鑒定菌株Y4-39 的16S rDNA基因序列測序結(jié)果顯示，其大小為1 511 bp。在NCBI進行Blastn 比對，目標庫選擇16S rRNA/ITS 序列庫，結(jié)果顯示，菌株Y4-39 與Bacillus velezensisFZB42 最相似，相似性為99.67%，選擇最相似的20 條序列進行進化分析，以Macrococcus bohemicusCCM 7100 作為外群，采用Neighbor-joining 法，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果顯示菌株Y4-39 與Bacillus velezensisFZB42 在同一枝上（圖4）。綜合形態(tài)學、生理生化特征和16S rDNA 序列分析，鑒定菌株Y4-39 為貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）。

圖4 菌株Y4-39 的16S rDNA 系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2 菌株Y4-39 抑菌物質(zhì)的熱穩(wěn)定性

由圖5 可知，隨著溫度的升高，菌株Y4-39 發(fā)酵液的抑菌活性呈下降趨勢，40℃處理與對照差異不顯著，60～80℃處理，抑菌活性有所下降，但依然保持較高抑菌活性，但當溫度≥100℃時，抑菌圈直徑急劇降低，120℃處理后，抑菌活性喪失。

圖5 菌株Y4-39 抑菌物質(zhì)的熱穩(wěn)定性測試結(jié)果

2.3 菌株Y4-39 抑菌物質(zhì)對蛋白酶的穩(wěn)定性

由圖6 可知，菌株Y4-39 發(fā)酵液經(jīng)蛋白酶K、胰蛋白酶、鏈酶蛋白酶處理后，對辣椒疫霉菌的抑菌直徑分別為14.3、20.2、20.8 mm，與CK 相比，抑菌圈直徑分別降低了68.1%、47.3%、47.1%，說明發(fā)酵液成分均對蛋白酶敏感，其中對蛋白酶K 最為敏感。

圖6 菌株Y4-39 抑菌物質(zhì)對蛋白酶的穩(wěn)定性測試結(jié)果

2.4 菌株Y4-39 抑菌物質(zhì)對紫外光的穩(wěn)定性

由圖7 可知，菌株Y4-39 發(fā)酵液在自然光下穩(wěn)定性較好，各處理抑菌活性無明顯變化；紫外光處理1～4 h 后，菌株Y4-39 發(fā)酵液對辣椒疫霉菌抑菌活性無明顯影響，但處理4 h 后，其抑菌活性逐漸降低，紫外線照射24 h 活性最低，其抑菌圈直徑為20.5 mm，僅為對照組的53.9%。

圖7 菌株Y4-39 抑菌物質(zhì)對紫外線的穩(wěn)定性測試結(jié)果

2.5 菌株Y4-39 對辣椒疫病的防治作用

從表2 可以看出，3 種劑量處理對辣椒疫霉均具有一定的防治效果，與CK1（空白對照）相比，用菌株Y4-39 發(fā)酵液灌根處理能顯著降低辣椒疫病的病情指數(shù)，其中以T3 處理的病情指數(shù)最低，為21.35，略高于CK2（50%烯酰嗎啉可濕性粉劑1000 倍液），但二者之間差異不顯著。在該試驗條件下，T2 和T3 處理防治效果均達到65%以上，二者之間差異不顯著，從節(jié)省成本的角度考慮，推薦實際使用劑量為20 mL發(fā)酵液/株。

表2 生防菌Y4-39 對辣椒疫霉的防治效果

3 討 論

菌株Y4-39 是從黑水虻腸道中分離純化的一株對辣椒疫霉和白絹病菌均有較好抑制效果的芽孢桿菌，但對這2 種病原菌的的抑菌活性物質(zhì)可能不同，初提物經(jīng)蛋白酶處理后，對白絹病菌的抑菌作用消失，但對辣椒疫霉菌的抑菌作用僅有所下降，但依然具有抑制作用。推測對白絹病菌的抑菌物質(zhì)主要是抗菌肽類，對蛋白酶敏感，而對辣椒疫霉菌的抑菌物質(zhì)除了抗菌肽外，還存在其他抗菌物質(zhì)。課題組對菌株Y4-39 的全基因組序列進行了測序，結(jié)果表明，其基因組中至少存在13 個次生代謝產(chǎn)物合成基因簇（結(jié)果另發(fā)表），包括有表面活性素（surfactin）、大環(huán)內(nèi)酰亞胺H （macrolactin H）、bacillaene、芬枯草菌素（fengycin）、地非西丁（difficidin）、桿菌素（bacillibactin）和桿菌溶素（bacilysin）等。但菌株Y4-39 對辣椒疫霉菌具有抑制作用的活性物質(zhì)是什么，仍需進一步研究確定。

黑水虻為腐食性昆蟲，腸道微生物對其消化、轉(zhuǎn)化有機垃圾的營養(yǎng)元素具有非常重要的輔助作用。黑水虻腸道微生物大部分來自食物和環(huán)境，前腸、中腸、后腸微生物種類差異比較大，前腸和中腸受食物和環(huán)境微生物的影響顯著高于后腸[13]。菌株Y4-39 在黑水虻前、中、后腸和蟲糞中均有存在，表明其能在黑水虻腸道中存活、繁殖并從蟲糞中排泄出來，具有進一步開發(fā)利用的潛力?？梢酝ㄟ^人為接種的方式將菌株Y4-39 接種到黑水虻食物中，黑水虻取食、活動后，菌株進一步發(fā)酵增殖，從而獲得含有大量Y4-39 功能菌的蟲沙，從而進一步研發(fā)具有生防功能的生物菌肥。通常，生物菌肥中的菌與肥是分開制備，然后再通過物理混合而成[14]。而經(jīng)黑水虻輔助發(fā)酵生產(chǎn)的生物菌肥由于菌與肥是在同一體系中完成的，相互之間經(jīng)歷了相互適應、協(xié)合進化過程，菌與肥之間相融性更好，功能菌能更好地存活于菌肥體系，從而提升了菌肥的活性。

該研究鑒定的貝萊斯芽孢桿菌Y4-39 菌株對辣椒疫霉病菌具有良好的抑制效果，盆栽試驗結(jié)果表明，20 mL 發(fā)酵液灌根處理對辣椒疫霉防效達67.78%。貝萊斯芽孢桿菌是一種安全的環(huán)境有益菌，在多個領(lǐng)域內(nèi)得到廣泛應用[15]。菌株Y4-39 經(jīng)黑水虻幼蟲發(fā)酵后在其蟲糞中存在大量活性菌，抗逆性強，能形成芽孢，可開發(fā)為具生防功能的生物菌肥。

4 結(jié) 論

從黑水虻腸道中分離純化獲得一株對辣椒疫霉菌具有高效抑菌活性的生防菌，編號為Y4-39，經(jīng)形態(tài)學、生理生化和16S rDNA 序列分析，鑒定為貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）；其抑菌活性物質(zhì)主要為抗菌肽類物質(zhì)，能經(jīng)受80℃以下高溫處理，但對蛋白酶和紫外線較敏感；盆栽試驗結(jié)果表明，菌株Y4-39 發(fā)酵液對辣椒疫霉具有良好的防治效果，20 mL/株發(fā)酵液灌根處理對辣椒疫霉的防效達67.78%。