吳海峰，賈建雷，李 倩，甄秀麗，魏雅楠，乜照燕*

(1.河北省胸科醫(yī)院檢驗科，河北 石家莊 050041; 2. 河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院生殖醫(yī)學科，河北 石家莊 050011)

卵巢顆粒細胞(granulosa cells，GCs)是卵巢內重要細胞，GCs對卵泡發(fā)育和胚胎質量至關重要[1]。GCs參與卵泡生長、類固醇合成等生理過程。卵子質量下降與GCs密切關系[2]。GCs體外培養(yǎng)是評價藥物生殖毒性的一個重要方面。環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide，Cy)是已知具有生殖毒性化合物。白藜蘆醇(resveratrol，RES)因具有多種生物活性引起大家重視。RES是一種天然多酚類物質，主要存在于虎杖、葡萄和紅酒中[3]。RES具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化、抗衰老、調節(jié)雌激素等多種藥理學作用[4]。環(huán)磷酰胺屬于前體藥，需在體內代謝才能發(fā)揮作用，無法在體外起作用，其活性代謝產物4-過氧化氫環(huán)磷酰胺(4-hydroperoxy cyclophosphamide，4-HC)可直接作用于細胞[5]。本研究選用4-HC作為研究體外毒性藥物，探討RES能否改善4-HC誘導GCs損傷以及可能改善機制。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2019年6月—2019年12月河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院生殖醫(yī)學中心行體外受精-胚胎移植(in vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET)助孕患者卵泡液中的GCs。排除標準：年齡≥35歲，子宮內膜異位癥、多囊卵巢綜合征以及不明原因不孕患者。

本研究經醫(yī)院倫理委員會批準，患者知情同意并簽署知情同意書。

1.2試驗方法

1.2.1試劑配制 4-HC溶于二甲亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)配成3.4 mmol/L儲備液，-20 ℃避光保存?zhèn)溆谩ES溶于DMSO配成50 mmol/L儲備液，-20 ℃避光保存?zhèn)溆谩；钚匝鯚晒馓结?2,7-Dichlorodi -hydrofluorescein diacetate，DCFH-DA)使用DMSO溶解，配成10 mmol/L(5 mg DCFH-DA+1 mL DMSO)儲備液，按照1∶1 000用無血清培養(yǎng)液稀釋 DCFH-DA，配制成終濃度為10 μmoL/mL工作液。含10%血清細胞培養(yǎng)液配制：胎牛血清10 mL與90 mL DMEM/F12培養(yǎng)基混勻，4 ℃冰箱保存。

1.2.2GCs收集和培養(yǎng) 收集患者卵泡液，采用Percoll密度梯度離心法分離和純化GCs，操作如下：將含GCs卵泡液離心，2 000 r/min，10 min，棄上清，留取沉淀使用胰酶消化，150目不銹鋼細胞篩過濾后，1 000 r/min離心5 min，加入含有10%胎牛血清DMEM/F12培養(yǎng)基中重懸沉淀，臺盼藍染色鑒定細胞活力>90%，接種細胞培養(yǎng)皿，置5%CO2，37 ℃培養(yǎng)箱內培養(yǎng)48 h，待細胞貼壁后更換培養(yǎng)液。

1.2.3GCs鑒定 蘇木精-伊紅染色(hematoxylin-eosin staining,HE)：細胞貼壁長至鋪滿蓋玻片80%左右取出細胞爬片，用預冷PBS洗滌，4%多聚甲醛固定20 min，1% TritonX-100細胞打孔5 min，蘇木素染色5 min，5%伊紅染色2～3 min，流水沖洗，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片，干燥后顯微鏡下觀察，拍照。

免疫組織化學檢測卵泡刺激素受體(follicle-stimulating hormone receptor，FSHR)：將處理好GCs爬片用預冷磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)洗滌，4%多聚甲醛固定20 min，PBS洗滌；0.3%TritonX-100細胞打孔10～15 min，3%甲醇-H2O2室溫孵育10 min清除內源性過氧化物酶；10%山羊血清封閉后于玻片上滴加一抗FSHR兔多克隆抗體(稀釋比例1∶200)，置于濕盒中，室溫1 h后4 ℃冰箱過夜。次日室溫復溫1 h，PBS洗滌后滴加二抗，室溫孵育30 min后滴加辣根過氧化酶標記鏈霉素工作液，室溫孵育30 min后于玻片上滴加二氨基聯苯胺顯色液(3,3′-Diaminobenzidine Tetrahydrochloride，DAB)，在顯微鏡下觀察控制顯色時間，流水沖洗，蘇木素復染3～5 min，流水沖洗，常規(guī)梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片后顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，拍照。

1.2.4CCK-8檢測4-HC誘導GCs損傷改善 GCs按1×103細胞/孔接種至96孔板，每孔加入100 μL，待細胞貼壁鋪滿培養(yǎng)皿底80%左右。加入含不同濃度4-HC(0、1.0、2.5、5.0、7.5 μmol/L)無血清培養(yǎng)基，處理24 h，每組設5個復孔共5個組。24 h后更換正常培養(yǎng)基，每孔加10 μL CCK-8溶液，37 ℃孵育2～4 h。450 nm波長激發(fā)光下讀取吸光度值。設加藥組(As)、無細胞僅加培養(yǎng)基為空白組(Ab)及接種細胞不加藥物為對照組(Ac)。計算細胞存活率，細胞存活率=(As-Ab)/(Ac-Ab)。通過計算半數抑制濃度(IC50)選擇4-HC濃度。

1.2.5CCK-8檢測RES對4-HC誘導GCs存活率 GCs接種處理同1.2.4，加入不同濃度RES(0、5、10、25、50、75 μmol/L)預處理2 h，再加入上述IC50 4-HC濃度，處理24 h(每個濃度重復5次)，每組5個復孔共5個組。后更換正常培養(yǎng)基，每孔加10 μL CCK-8溶液，37 ℃孵育2～4 h。450 nm波長激發(fā)光下讀取吸光度值。篩選RES濃度。

1.2.6試驗分組以及各項指標測定 GCs分別接種四孔板、六孔板和九十六孔板，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細胞完全貼壁，鋪滿皿底80%左右。分別進行如下處理：對照組(CON)：含相同劑量DMSO無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h；4-HC組：2.5 μmol/L 4-HC無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h；RES+4-HC組：50.0 μmol/L RES無血清培養(yǎng)液預處理2 h，加入終濃度2.5 μmol/L 4-HC繼續(xù)培養(yǎng)24 h；取不同培養(yǎng)皿GCs進行下述指標測定，各組形態(tài)學觀察、活性氧(reactive oxygen species,ROS)和氧化應激以及沉默信息調節(jié)因子2相關酶1(silent information regulator 1,SIRT1) 蛋白測定。

1.2.7DCFH-DA檢測GCs內ROS水平 采用四孔培養(yǎng)皿，各組經藥物處理后，去除培養(yǎng)液，無血清細胞培養(yǎng)液清洗2次，每孔加入0.5 mL DCFH-DA工作液，覆蓋細胞，37 ℃培養(yǎng)箱內孵育30 min，DCFH-DA和細胞充分接觸。無血清細胞培養(yǎng)液洗滌細胞3次，以充分去除未進入細胞內DCFH-DA。倒置熒光顯微鏡觀察，選取各組不重復區(qū)域攝片，Image J熒光定量分析。

1.2.8GCs裂解液氧化應激指標測定 GCs接種于六孔培養(yǎng)板中各組GCs按上述藥物相應處理后，加入適量0.25% Trypsin消化收集細胞，2 000 r/min，5 min，PBS清洗，加入裂解液1 mL，冰上孵育5～10 min(顯微鏡下觀察細胞破碎情況)，離心12 000 r/min，5 min，收集上清液，各用。取上述各組GCs上清液，按照試劑盒說明書操作步驟操作，測定抗氧化酶SOD(A001-3,JianCheng Bioengineering)、CAT(KGT006,KeyGEN Biotech)活力，結果U/mg表示。

1.2.9WesternBlot檢測蛋白表達 取各組GCs，加入含有1 g/L PMSF蛋白酶抑制劑的蛋白裂解液在冰上裂解30 min。細胞刮冰上刮取細胞，收集裂解液于1.5 mL EP管中，然后以12 000 r/min 4 ℃離心20 min，輕輕吸取收集上清液，取2 μL測定蛋白濃度，確定5×SDS上樣緩沖加入量，振蕩器震蕩均勻。沸水水浴5～10 min蛋白變性，-70 ℃保存。采用10%聚丙烯酰胺凝膠電泳( sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE )電泳分離蛋白，濕轉法將分離的蛋白電轉至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride membrane，PVDF)膜，5%脫脂奶粉封閉液孵育1 h，加沉默信息調節(jié)因子2相關酶1(silent information regulator 1,SIRT1)單抗(Cat.ab189494,Abcam)，4 ℃搖床過夜，加HRP標記二抗孵育2 h，ECL試劑顯影，Image J軟件分析目的條帶灰度值，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)(AC001,ABclonal)作為內參。

1.3統(tǒng)計學方法 應用SPSS 21.0軟件進行數據分析。計量資料若數據符合正態(tài)分布，多組樣本均數比較采用單因素方差分析和SNK-q檢驗，若不滿足正態(tài)性，采用非參數檢驗 Kruskal-Wallis檢驗；計數資料組間比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1GCs培養(yǎng)和鑒定 GCs貼壁后多成呈纖維型，大小均一(圖1A)。HE染色結果GCs細胞漿染成淡紅色并含有顆粒狀物，細胞核染成深藍色，位于整個細胞中央，多呈橢圓形或不規(guī)則形(圖1B)。免疫組織化學結果示FSHR陽性染色位于細胞漿，呈棕褐色，FSHR陽性占整個視野90%以上(圖1C)。

圖1 GCs形態(tài)及FSHR免疫組織化學染色A.GCs形態(tài)×200;B.GCs HE染色×200;C.FSHR免疫組織化學染色Scale bar=100 μm，Magnification×200Figure 1 Morphology of GCs and immunocytochemistry staining of FSHR

2.24-HC誘導GCs毒性作用 4-HC(0、1.0、2.5、5.0、7.5 μmol/L)處理GCs 24 h，CCK-8結果表明：與對照組比較，隨著4-HC濃度增加，GCs存活率降低，呈劑量依賴關系，與對照組相比差異有統(tǒng)計學(P<0.05)，見表1。按IC50選擇2.5 μmol/L為后續(xù)濃度。

表1 4-HC對GCs存活率影響 Table 1 The effect of 4-HC on survival rate of GCs

2.3RES預處理對4-HC誘導GCs毒性改善作用 加入不同濃度RES(5、10、25、50、75 μmol/L)處理2 h后，加入2.5 μmol/L 4-HC ，與未加RES比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。RES濃度50 μmol/L效果最佳，選擇50.0 μmol/L為后續(xù)實驗藥物濃度，見表2。

表2 RES對4-HC誘導GCs存活率影響Table 2 The effect of RES on survival rate of GCs induced by 4-HC

2.4RES預處理對4-HC誘導GCs形態(tài)影響 CON組GCs貼壁生長，大多呈纖維形。4-HC組GCs生長狀態(tài)不佳，細胞變圓，凸起回縮。RES+4-HC組GCs形態(tài)與對照組GCs相比沒有明顯差異，RES一定程度地改善4-HC誘導GCs形態(tài)改變。見圖2。

圖2 RES預處理對4-HC誘導GCs形態(tài)影響A.對照組×200；B.4-HC組×200；C.RES+4-HC組 ×200Figure 2 Effects of RES pretreatment on morphology of GCs induced by 4-HC

2.5RES預處理對4-HC誘導GCs氧化應激水平影響 DCFH-DA檢測GCs內ROS結果顯示4-HC組ROS熒光強度增加，與CON組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，RES+4-HC組ROS熒光強度降低，與4-HC組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖3。

圖3 RES預處理對4-HC誘導GCs內ROS影響A.對照組；B.4-HC組；C.RES+4-HC組；D.ROS熒光強度Figure 3 Effect of RES pretreatment on 4-HC-induced ROS in GCs

進一步對GCs裂解液內抗氧化酶SOD、CAT分析結果顯示，4-HC組抗氧化酶SOD、CAT活性下降，與CON比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，RES+4-HC抗氧化酶SOD、CAT活性升高與4-HC組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，RES減少4-HC對GCs氧化應激損傷，見表3。

表3 RES對4-HC誘導GCs抗氧化酶影響Table 3 Effects of RES on GCs antioxidant enzymes induced by 4-HC

2.6RES預處理對4-HC誘導GCs SIRT1影響 Western Blot檢測SIRT1結果顯示，RES+4-HC組SIRT1表達高于CON組、4-HC組(P<0.001)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，以上結果表明，RES預處理增加了SIRT1表達(圖4)。

圖 4 不同組GCs中SIRT1蛋白表達水平A.Western Blot檢測SIRT1條帶；B.SIRT1相對表達Figure 4 The expression level of SIRT1 in GCs in different groups

3 討 論

女性腫瘤患者化療前卵巢保護、減少化療誘導卵巢損傷對于女性生育力保護尤為重要。Cy作為臨床抗腫瘤一線用藥可以直接或者間接損傷卵巢功能。氧化應激損傷是環(huán)磷酰胺誘導卵巢損傷機制之一，Cy可引起卵巢組織內氧化和抗氧化系統(tǒng)失衡，抗氧化能力減弱產生大量ROS從而影響卵巢功能。GCs是卵泡中最重要的細胞群，對卵泡發(fā)育至關重要。GCs也是一種主要的功能細胞，分泌生殖激素，在卵泡生長中發(fā)揮重要調節(jié)作用。GCs有絲分裂率高也是Cy主要的靶細胞。GCs與卵巢功能密切相關。GCs體外培養(yǎng)是評價藥物生殖毒性的重要方法。故本研究選擇GCs為研究對象。RES具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化、抗衰老、調節(jié)雌激素等多種藥理學作用[6]。此外，RES是一種高效氧化劑和自由基清除劑，能保護細胞核DNA、膜脂質等分子免受氧化損傷。本研究以人GCs為研究對象，建立4-HC損傷模型，探討RES對4-HC誘導的人GCs損傷保護作用以及可能保護機制。

本研究結果顯示，4-HC顯著降低GCs存活率并呈劑量依賴關系，進一步研究發(fā)現，4-HC誘導GCs損傷中，GCs內ROS升高，GCs裂解液抗氧化酶SOD、CAT活性下降，由此可見，4-HC誘導了GCs氧化應激產生。與之前報道一致，化療藥物可以增加GCs氧化應激水平[7]，卵巢中氧化應激損傷被認為是卵泡儲備減少和生育能力下降的原因之一[8]。高水平ROS與卵巢毒性密切有關，可以引起GCs凋亡，導致卵泡閉鎖[9]。

RES能夠激活體內抗氧化酶系統(tǒng)SOD、CAT等，具有細胞內抗氧化活性。RES可以保護細胞免受氧化應激損傷而延緩細胞死亡[10]。本研究發(fā)現，RES顯著改善4-HC誘導GCs存活率降低，這種改善作用很大程度上取決于RES濃度，隨RES濃度增加，4-HC誘導GCs存活率降低得到改善。之前研究發(fā)現RES濃度在50～100 μmol/L時，可以對大鼠GCs生長產生抑制[11]。本研究中，75 μmol/L RES對GCs改善作用有所下降。故選擇50.0 μmol/L RES為實驗藥物濃度。50.0 μmol/L RES顯著抑制了4-HC誘導ROS產生，與4-HC組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。RES組抗氧化酶活性SOD、CAT 活性升高，RES通過減少細胞內ROS，提高SOD、CAT水平，減輕4-HC誘導GCs氧化應激損傷。

為進一步研究RES改善4-HC誘導GCs損傷機制，進行了相關蛋白檢測。SIRT1是酵母長壽基因沉默信息調節(jié)因子2(silent information regulator，Sir2)的哺乳動物同源體，SIRT家族成員之一，廣泛分布于體細胞與生殖細胞，參與細胞增殖、分化、代謝、凋亡等多種生理過程。近年來，有研究證實SIRT1在卵泡發(fā)育方面發(fā)揮重要作用，SIRT1可能參與類固醇激素合成關鍵酶的表達調控，從而影響哺乳動物的生殖過程[12]。一項臨床實驗證實，SIRT1參與人類生殖，它們可能在卵母細胞成熟和IVF臨床妊娠中發(fā)揮作用[13]。SIRT1下調可導致GCs凋亡增加，卵巢儲備功能下降，甚至卵巢早衰[14]。RES是SIRT1天然激動劑，RES通過上調SIRTl保護線粒體功能和細胞免受活性氧損傷[15]。RES與SIRT1相互作用已成為體內外研究焦點[16]。有研究發(fā)現RES激活SIRT1保護造血細胞免受放療誘導損傷[17]。還有研究發(fā)現RES通過激活SIRT1可以改善放療誘導卵巢炎癥[18]。SIRT1是卵子、GCs和胚胎氧化還原狀態(tài)的傳感器，可以抑制氧化應激對卵子產生的不良影響。本研究顯示，與CON組、4-HC組相比，RES+4-HC組SIRT1明顯增加。RES對4-HC誘導的GCs損傷改善作用可能與SIRT1增加有關。

目前，在臨床研究中RES已被報道用于心臟保護、抗腫瘤和增強胰島素敏感性。動物模型體內研究顯示，補充白藜蘆醇對雌性生殖衰老有積極影響[19]。一項體外添加實驗證實RES改善了人卵母細胞成熟度和質量[20]。亦有研究證實，RES口服降低了GCs氧化應激水平，增加線粒體合成和ATP生成[21]。

此外，越來越多的研究表明氧化應激可以導致GCs凋亡，進而損害卵泡發(fā)育，與女性卵巢功能密切相關。本研究RES有效抑制4-HC誘導GCs損傷，同時發(fā)現SIRT1表達增加。避免GCs損傷是否可以改善化療藥物的生殖毒性尚需進一步證實。目前，已經建立Cy誘導的大鼠模型。RES和SIRT1在預防化療藥物生殖毒性方面的潛力還需要在動物模型和人類中進一步研究。