張 搖，付瑞環(huán)，陸 靜，馬 力

(河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院乳腺中心，河北 石家莊 050011 )

美國癌癥協(xié)會公布了2021年度癌癥監(jiān)測分析結果，其中乳腺癌在女性惡性腫瘤發(fā)病率中居首位，約占新發(fā)病例的30%，對女性患者的健康和生活造成嚴重影響[1]。半胱氨酸的分泌性酸性蛋白(secreted protein acidic and rich in cysteine，SPARC)蛋白也稱為骨連蛋白或BM-40，是介導細胞間質，但不起主要結構作用的間質細胞蛋白，在組織重塑、血管生成、胚胎發(fā)育及腫瘤形成中起重要作用[2]。SPARC蛋白在多種類型的腫瘤中過表達，被發(fā)現(xiàn)與患者預后相關[3-8]。目前國內外學者已對乳腺癌組織中SPARC蛋白的表達進行了多項研究[9]，但其表達狀態(tài)及對預后的影響未達成共識。有研究指出乳腺癌組織SPARC蛋白表達率明顯高于乳腺良性組織[10]；且其表達與患者年齡、腫物大小、ER、PR狀態(tài)等因素無關；其表達對乳腺癌患者OS無影響[11]。有研究指出乳腺組織SPARC蛋白表達與腫瘤分化程度、Ki-67及淋巴結轉移存在明顯相關性[12]。本研究應用免疫組織化學(immunohistochemistry, IHC)法檢測乳腺癌組織中SPARC蛋白的表達，并分析其與患者臨床病理指標及預后之間的關系。

1 資料與方法

1.1一般資料 隨機收集2010年1—12月河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院原發(fā)性乳腺癌患者術后組織標本122例和同期正常乳腺組織標本38例(均經(jīng)病理證實)。整理并統(tǒng)計乳腺癌病例患者手術時的臨床資料。入組標準：年齡>18歲，均在本院行手術治療并確診為原發(fā)性浸潤性乳腺癌；TNM分期為Ⅰ～Ⅲ期；排除了術前治療對研究對象腫瘤的影響。病理類型中以浸潤性導管癌(invasive ductal carcinoma，IDC)為主，約占84.4%；腫物直徑≤2 cm、>2 cm分別占61.5%、38.5%；淋巴結轉移與無轉移分別占49.2%和50.8%，Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期的患者分別占31.1%、46.0%、22.9%；Luminal型、HER2陽性型、三陰性型患者分別占54.1%、22.1%、23.8%。本研究符合《赫爾辛基宣言》的原則。

1.2檢測方法 從本院病理科找出入組患者的石蠟組織，采用IHC法檢測SPARC蛋白的表達情況。鼠抗人SPARC單克隆抗體購自美國Origene公司(克隆號：OTI2B1)。

1.3判定標準 由兩位病理科高年資醫(yī)生進行雙盲閱片，SPARC蛋白著色主要位于細胞質或間質。以細胞呈清晰棕黃色著色作為陽性表達，任意選擇5個高倍視野，每個視野至少含200個細胞，計數(shù)其中的陽性細胞數(shù)及染色強度，并計算標記指數(shù)，標記指數(shù)=陽性細胞數(shù)/計數(shù)細胞總數(shù)×100%。根據(jù)著色程度和著色細胞占總細胞計數(shù)的百分率綜合進行評分：染色強度(陰性=0，弱=1，中度=2，強=3)和陽性腫瘤細胞的百分比(0%=0，1%～10%=1，11%～50%=2，51%～80%=3，81%～100%=4)。通過將兩個參數(shù)的數(shù)值相乘，可以計算出0～12的免疫反應評分(immunoreactivescore，IRS)。定義IRS<2為陰性表達，IRS≥2為陽性表達[13]。

1.4隨訪 通過電話、門診復查和查閱病案資料的方式進行隨訪，截止日期為2019年12月31日。隨訪時間為自確診開始至末次隨訪或死亡。復發(fā)轉移的患者經(jīng)CT、MRI、ECT或穿刺病理證實。OS定義為患者從手術日起，至任何原因引起死亡的時間。DFS定義為患者從手術日起，至疾病進展或死亡的時間。

1.5統(tǒng)計學方法 應用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。癌組織和正常乳腺組織的SPARC蛋白表達程度比較采用非參數(shù)檢驗；將組織標本SPARC蛋白的表達與臨床病理指標采用χ2檢驗進行比較，組間生存率通過Kaplan-Meier繪制生存曲線進行分析，采用COX比例風險回歸分析進行危險因素分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1乳腺癌組織和正常組織的SPARC蛋白表達情況 SPARC蛋白在乳腺癌組織和正常組織的上皮和間質細胞中均有不同程度的表達，在乳腺癌組織上皮細胞中SPARC蛋白陽性率為24.6%(30/122)，明顯低于間質細胞的54.9%(67/122)的陽性率(P<0.05)；在正常乳腺組織中，上皮和間質細胞的陽性率分別為7.9%(3/38)和68.4%(26/38)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。SPARC蛋白在癌組織和正常組織中上皮細胞的陽性率均顯著低于間質細胞。癌組織和正常乳腺組織中SPARC蛋白在上皮細胞的陽性率分別為24.6%、7.9%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；兩組間質細胞的陽性率分別為54.9%、68.4%，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，提示與正常乳腺組織相比，癌組織中SPARC蛋白在上皮細胞的陽性率顯著增加(圖1)。

圖1 乳腺癌組織中SPARC蛋白的表達(SP ×40)A.癌組織上皮細胞中SPARC表達陽性；B.癌組織上皮細胞中SPARC表達陰性；C.癌組織間質細胞中SPARC表達陽性；D.癌組織間質細胞中SPARC表達陰性；E.乳腺組織上皮細胞中SPARC表達陽性；F.乳腺組織上皮細胞中SPARC表達陰性；G.乳腺組織間質細胞中SPARC表達陽性；H.乳腺組織間質細胞中SPARC表達陰性Figure 1 SPARC protein expression in breast tissues(SP ×40)

2.2乳腺癌組織上皮細胞中SPARC蛋白在不同臨床病理特征組之間表達的比較 乳腺癌組織中SPARC蛋白的表達在患者年齡、腫物直徑、淋巴結狀態(tài)、TNM分期、脈管瘤栓、組織學分級、分子分型、ER、HER2狀態(tài)等分組間的差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；在病理類型、PR狀態(tài)分組間的差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 乳腺癌組織中SPARC蛋白的表達與臨床病理指標的關系Table 1 The relationship between SPARC protein expression and clinicopathological indicators in breast cancer

表1 (續(xù))

2.3乳腺癌組織上皮細胞中SPARC蛋白表達與預后的關系 隨訪截止到2019年12月31日，中位隨訪時間為109個月(6～120個月)，復發(fā)轉移24例(19.7%)，死亡21例(17.2%)。SPARC蛋白表達陽性與陰性患者的DFS率分別為90%、77.2%，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；SPARC蛋白表達陽性與陰性患者的OS率分別為96.7%、78.3%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖2。

圖2 乳腺癌組織上皮細胞中SPARC蛋白表達與DFS和OS的生存曲線圖Figure 2 Expression of SPARC proteinin breast epithelial cells in patients with breast cancer and curves of DFS and OS

將患者臨床病理特征與DFS、OS的關系采用Log-rank檢驗單因素生存分析顯示，年齡、淋巴結狀態(tài)、TNM分期和脈管瘤栓是影響患者DFS的影響因素，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；淋巴結狀態(tài)、TNM分期、SPARC蛋白表達是影響患者OS的影響因素，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2～表3。將篩選出的因子(協(xié)變量)統(tǒng)一引入多因素COX比例風險回歸模型分析，結果顯示TNM分期、年齡均為乳腺癌患者DFS的獨立危險預后因素，年齡≤40歲患者的復發(fā)率較年齡>40歲增高[P=0.014，HR=2.819(1.229～6.468)]，TNM分期為Ⅱ、Ⅲ期的患者較Ⅰ期復發(fā)率增高[P<0.001，HR=3.179(1.715～5.891)]，見表4；TNM分期為乳腺癌患者OS的獨立危險預后因素，TNM分期為Ⅱ、Ⅲ期的患者較Ⅰ期病死率顯著增高[P<0.001，HR=3.256(1.680～6.313)]，SPARC蛋白表達不是影響患者OS的獨立預后因素[P=0.052，HR=0.142(0.019～1.060)]，見表5。

表2 多因素COX回歸分析賦值表Table 2 Assignment table of multivariate COX regression analysis

表3 影響患者DFS和OS的單因素分析Table 3 Univariate analysis of factors influencing DFS and OS in patients

表3 (續(xù))

表4 影響患者DFS的多因素分析Table 4 Multivariate analysis of factors influencing DFS in patients

表5 影響患者OS的多因素分析Table 5 Multivariate analysis of factors influencing OS in patients

3 討 論

SPARC蛋白的主要功能包括：破壞細胞黏附、促進細胞變形、抑制細胞周期、調節(jié)細胞分化、抑制細胞對某些生長因子反應、調節(jié)胞外間質和間質金屬蛋白酶產(chǎn)生以及影響新生血管生成等。SPARC蛋白在惡性腫瘤發(fā)生、侵襲和轉移的過程中發(fā)揮重要作用[14-16]。

目前，關于SPARC蛋白表達陽性的定義存在很大差異，常見的定義分為以下三類：第一類是根據(jù)腫瘤細胞或間質細胞的IHC染色強度定義SPARC蛋白陽性；第二類是評估陽性細胞的染色強度和比例，并將這兩個參數(shù)整合為一個IRS，類似于評估激素受體陽性的常用方法；第三類方法是SPARC蛋白微環(huán)境特征，指由兩名病理學家對腫瘤進行的42個變量的綜合評分，考慮了兩種抗體的染色并評估了最大染色強度、最大染色強度下的細胞百分比以及七種組織成分(即腫瘤細胞、成纖維細胞、炎性細胞、無細胞間質、血管、神經(jīng)組織和正常組織)的總體評分，但該方法較為復雜[17]。預測性指標應適用于常規(guī)臨床實踐，因此，選擇應用IRS，對乳腺癌組織和正常組織中上皮和間質細胞的染色分別進行了評估，通過統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，SPARC蛋白在癌組織上皮細胞的表達較正常乳腺組織顯著增加。本研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌組織中上皮細胞SPARC蛋白表達與患者的年齡、腫物直徑、淋巴結狀態(tài)、分期、脈管瘤栓、組織學分級、分子分型等均不具有相關性，這表明SPARC蛋白表達水平不受上述參數(shù)影響，這與張書勤等[18]研究結果一致；SPARC蛋白表達與與病理類型、PR狀態(tài)相關，在IDC和PR陰性乳腺癌中表達增加。孫孝媛等[19]在研究乳腺癌組織中SPARC蛋白的表達時，將乳腺癌的上皮細胞或間質細胞的IRS≥3分定義為陽性，SPARC蛋白在癌組織的表達與年齡、分期、ER、PR及HER2表達無關，但與淋巴結轉移相關。

關于SPARC蛋白預測預后意義的臨床數(shù)據(jù)較少，在本研究中發(fā)現(xiàn)，SPARC蛋白陽性組患者OS優(yōu)于陰性組。在一項用白蛋白結合型紫杉醇和吉西他濱治療未接受化療的初治轉移性胰腺癌患者的Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗中，對36例患者的腫瘤樣本中上皮細胞和間質的SPARC蛋白表達進行了評估，發(fā)現(xiàn)間質細胞高表達SPARC蛋白的患者的中位OS明顯優(yōu)于低表達組，多變量分析顯示，SPARC蛋白表達水平是OS的重要預測指標[20]。但是，來自一個腫瘤實體的發(fā)現(xiàn)可能不適用于另一個。GeparTrio是德國的一項Ⅲ期多中心隨機對照試驗，評估了SPARC蛋白在乳腺癌中的表達及對新輔助化療的反應，通過IHC對667例乳腺癌組織進行了檢測發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織中SPARC蛋白陽性率為26%；在三陰性乳腺癌中，SPARC蛋白陽性率為37%，明顯高于其他分子亞型(HR+/HER2-23%，HR+/HER2+29%，HR-/HER2+22%)；SPARC蛋白高表達患者的pCR率顯著高于低表達患者；研究沒有發(fā)現(xiàn)SPARC蛋白表達對于OS或DFS的預測價值，僅在三陰性乳腺癌中，可以觀察到SPARC蛋白高表達的患者DFS有增加趨勢[21]。Schneeweiss等[22]對44例晚期乳腺癌患者的SPARC蛋白在上皮細胞、間質和血清中的表達分別進行了評估，當IRS截斷值設為3時，研究中上皮細胞的SPARC蛋白陽性表達率為14%；無論采用何種截斷值，SPARC蛋白在原發(fā)或轉移性癌組織中的表達以及血清水平與任何臨床終點之間(DFS和OS)均不具有相關性，也沒有發(fā)現(xiàn)其對于用Nab-紫杉醇治療晚期乳腺癌療效的預測價值，但作者解釋這可能歸因于樣本量較小。

Nagai等[23]通過IHC對596例患者的乳腺癌組織SPARC蛋白表達情況進行了評估，中位隨訪時間超過10年，Kaplan-Meier分析顯示：高表達SPARC蛋白患者的DFS和OS優(yōu)于低表達患者，差異有統(tǒng)計學意義；COX比例風險模型多變量分析中，SPARC蛋白的表達是乳腺癌患者DFS和OS的獨立預后因素。在本研究中發(fā)現(xiàn)SPARC蛋白表達陽性與陰性的乳腺癌患者OS差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而DFS差異有統(tǒng)計學意義(P>0.05)；為進一步明確影響患者預后的因素，通過COX比例風險回歸分析發(fā)現(xiàn)SPARC蛋白表達可能是影響患者死亡的保護因素，差異無統(tǒng)計學意義[P=0.052，HR=0.142(0.019～1.060)]。造成這種差異的結果可能由于本研究樣本量相對較小，導致數(shù)據(jù)統(tǒng)計偏移，有待進一步擴大樣本量對結果進行驗證。

SPARC蛋白在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中起到重要作用，其表達高低可能是預測患者預后的重要指標。顯然，就如何評估SPARC蛋白表達以更好地確定其預后意義達成共識是有益的，這種評估方法應廣泛適用于常規(guī)臨床實踐；未來需要進一步大樣本量的研究以明確SPARC蛋白的表達對乳腺癌患者的臨床意義。