聞康，郭佳，倪凱，楊崇鑫，羅明志，鄧林紅

(常州大學(xué)藥學(xué)院&醫(yī)學(xué)院(籌)，生物醫(yī)學(xué)工程與健康科學(xué)研究院，常州 213164)

引言

氣道炎癥是多種呼吸系統(tǒng)疾病如哮喘、慢性阻塞性肺部疾病，以及病毒感染疾病如新型冠狀病毒等的重要病理機(jī)制，甚至可能引起急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrme, ARDS)[1]。氣道炎癥的發(fā)生、發(fā)展受多種細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)分子的調(diào)節(jié)，包括微小RNA(microRNA, miRNA)。miRNA是一類由內(nèi)源基因編碼的長度約為22個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，可以通過5′端的種子序列與位于靶基因mRNA 3′端非編碼區(qū)(UTR)靶點(diǎn)結(jié)合而發(fā)揮生物效應(yīng)，參與細(xì)胞行為調(diào)控[2]。Let-7家族是肺中最豐富的miRNA，其中l(wèi)et-7a-5p被報(bào)道為可以調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和細(xì)胞表型的重要因子[3]，但let-7a-5p參與調(diào)控氣道平滑肌細(xì)胞(airway smooth muscle cells, ASMCs)炎癥因子分泌表型的作用及其機(jī)制尚不清楚。

氣道炎癥的產(chǎn)生細(xì)胞包括免疫細(xì)胞和氣道結(jié)構(gòu)性細(xì)胞，如ASMCs。ASMCs不僅具有收縮功能，同時(shí)還具有分泌表型，可分泌轉(zhuǎn)化生長因子β1(transformation growth factor β1, TGFβ1)、白介素等參與氣道結(jié)構(gòu)和功能調(diào)控[4]。其中，ASMCs的分泌功能受到整合素信號(hào)的調(diào)控。整合素是一類由兩條跨膜多肽鏈α和β以非共價(jià)方式結(jié)合而成的異二聚體跨膜黏蛋白，主要介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞之間，及細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的黏附，從而參與炎癥反應(yīng)過程[5]，已有多種靶向整合素的藥物被開發(fā)。研究發(fā)現(xiàn)miR-222可以靶向整合素β8調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥因子的分泌[6]。而整合素αVβ6、αVβ8被報(bào)道可以促進(jìn)TGFβ1的活化[7-8]。雖然ASMCs高表達(dá)let-7a-5p，但不清楚let-7a-5p是否通過靶向整合素調(diào)控ASMCs的TGFβ1的表達(dá)和活化。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞系、質(zhì)粒和試劑

HEK293T、ASMCs(北納生物)；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素鏈霉素和胰蛋白酶(美國ThermoFisher公司)；細(xì)胞培養(yǎng)瓶和培養(yǎng)板(美國康寧公司)；96孔白板、Dual-LumiTM雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。PCR引物、qPCR引物、let-7a-5p模擬物和抑制劑及正常對(duì)照序列(安徽通用生物技術(shù)有限公司)；轉(zhuǎn)染試劑lipofectamine 3000(Invitrogen公司)；psiCHECK-2雙熒光素酶質(zhì)粒(優(yōu)寶生物)；感受態(tài)細(xì)胞(上海生工生物工程有限公司)；DNA提取試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；限制性內(nèi)切酶XhoI和NotI、DNA聚合酶、dNTP(ENB)；T4 DNA連接酶(TaKaRa公司)；PCR產(chǎn)物回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒(OMEGA公司)；cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒以及SYBR染料(vazyme公司)；TGFβ1 ELISA試劑盒(碧云天公司)；除非另有說明，所有其他試劑均購自ThermoFisher公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

HEK293T培養(yǎng)于含10 % 胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)液，置于含5% CO2混合氣體的37℃培養(yǎng)箱，實(shí)驗(yàn)用對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞。

ASMCs貼壁培養(yǎng)于含10 % 胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素的DMEM低糖培養(yǎng)液中，置于含5 % CO2混合氣體的37℃培養(yǎng)箱，實(shí)驗(yàn)用對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞。

1.3 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)let-7a-5p靶基因

以let-7a-5p作為檢索詞分別在Starbase、miRmap、miRwalk數(shù)據(jù)庫檢索，搜索與let-7a-5p相互作用的靶基因。

1.4 雙熒光素酶報(bào)告載體的構(gòu)建

從NCBI數(shù)據(jù)庫調(diào)取ITGAV基因3′-UTR段的堿基序列(NM_001144999)后，采用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)PCR引物，引物由安徽通用生物公司合成。

ITGAV基因3′-UTR序列、ITGAV PCR前后引物序列、let-7a-5p序列、let-7a-5p模擬物和抑制劑及其正常對(duì)照的序列信息，見表1。ITGAV PCR前后引物序列的加黑體分別為XhoI，NotI酶切位點(diǎn)序列，之前序列為保護(hù)堿基，引物擴(kuò)增長度為102 bp。

表1 人ITGAV基因3′UTR序列、ITGAV PCR前后引物序列、let-7a-5p序列、let-7a-5p模擬物及其正常對(duì)照的序列Table 1 Sequences of 3′UTR of human ITGAV gene, primer sequences before and after ITGAV PCR, let-7a-5p sequence, let-7a-5p mimic and normal control

以HEK293T細(xì)胞基因組cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為50 μL體系：2 × Phanta Max Buffer 25 μL；dNTPMix (10 mM) 1 μL；上下游引物 (10 μM) 各2 μL；cDNA 5 μL；Phanpta Max Super-Fidelity DNA polymerase 1 μL；加水至50 μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性15 s，之后56 ℃退火15 s，72℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)；72℃繼續(xù)延伸5 min，然后4℃保存。PCR反應(yīng)完取2 μL產(chǎn)物進(jìn)行1 %瓊脂糖電泳分析。按照凝膠純化試劑盒說明書進(jìn)行純化產(chǎn)物后，用XhoI、NotI對(duì)上述PCR產(chǎn)物和載體進(jìn)行雙酶切，采用T4 DNA連接酶將雙熒光素酶報(bào)告載體 (psiCHECK-2) 與ITGAV基因3′-UTR片段相連，反應(yīng)體系是PCR產(chǎn)物與熒光素酶報(bào)告載體以3∶1比例混合，圖1為psiCHECK-2載體結(jié)構(gòu)圖譜。取連接反應(yīng)產(chǎn)物100 μL加入轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5a，涂布平板并單克隆挑菌，擴(kuò)增之后提取質(zhì)粒，單酶切和雙酶切后，用瓊脂糖凝膠驗(yàn)證正確，再將重組雙熒光素酶報(bào)告載體測(cè)序鑒定(安徽通用生物系統(tǒng)有限公司)。測(cè)序鑒定正確的重組載體命名為psiCHECK-2-ITGAV-3′-UTR。

比較典型者，如朱權(quán)在對(duì)元曲進(jìn)行風(fēng)格分類時(shí)，其“新定府體一十五家”冠以諸如“承安體(華觀偉麗)”“西江體(文采煥然，風(fēng)流儒雅)”[11](P13-14)這類的評(píng)價(jià)，反映出他對(duì)元曲藝術(shù)成就的高度認(rèn)同。

圖1 psiCHECK-2載體結(jié)構(gòu)圖譜Fig.1 Structural mapping of psiCHECK-2 vector

1.5 雙熒光素酶活性測(cè)定

首先采用脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染相應(yīng)模擬物及對(duì)照和質(zhì)粒進(jìn)入HEK293T細(xì)胞。HEK293T細(xì)胞種至96孔白板中，每孔細(xì)胞約3×104個(gè)，轉(zhuǎn)染前換成無血清DMEM培養(yǎng)基80 μL。細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染采用lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑，操作方法遵循說明書進(jìn)行。按照每孔let-7a-5p模擬物或let-7a-5p模擬物正常對(duì)照50 nM，加到含5 μL Opti-DMEM培養(yǎng)基的EP管中，重組質(zhì)粒或空白質(zhì)粒0.2 μg，加到含0.2 μL P3000和5 μL Opti-DMEM培養(yǎng)基的EP管中，同時(shí)另取一EP管，取0.4 μL脂質(zhì)體加到5 μL Opti-DMEM培養(yǎng)基中，混勻，室溫孵育5 min。將上一步中的兩者混勻，室溫孵育20 min。將轉(zhuǎn)染復(fù)合物加到96白板中，模擬物和質(zhì)粒各10 μL/孔,12 h后換成完全培養(yǎng)基。具體實(shí)驗(yàn)分組如下：(1)共轉(zhuǎn)染psiCHECK-2-ITGAV-3′-UTR和模擬物正常對(duì)照組；(2)共轉(zhuǎn)染psiCHECK-2-ITGAV-3′-UTR和let-7a-5p模擬物組；(3)共轉(zhuǎn)染psiCHECK-2空白質(zhì)粒和let-7a-5p模擬物組。上述實(shí)驗(yàn)每組設(shè)4個(gè)平行孔，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，轉(zhuǎn)染48 h檢測(cè)螢光素酶強(qiáng)度。

螢光素酶檢測(cè)的具體方法如下：取出細(xì)胞培養(yǎng)板在室溫平衡10 min，96孔板每孔加入100 μL Dual-LumiTM螢火蟲螢光素酶檢測(cè)試劑，混勻。室溫(約25℃)孵育10 min，使發(fā)光信號(hào)趨于穩(wěn)定。使用具有檢測(cè)化學(xué)發(fā)光功能的多功能酶標(biāo)儀進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè)。之后，96孔板每孔加入100 μL Dual-LumiTM海腎螢光素酶檢測(cè)工作液，混勻。室溫(約25℃)孵育10 min，使發(fā)光信號(hào)趨于穩(wěn)定。使用多功能酶標(biāo)儀進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè)。在以螢火蟲螢光素酶為內(nèi)參的情況下，用海腎螢光素酶測(cè)定得到的RLU值除以螢火蟲螢光素酶測(cè)定得到的RLU值。根據(jù)得到的比值來比較不同樣品間報(bào)告基因的激活程度。

1.6 ASMCs胞內(nèi)mRNA表達(dá)、胞外TGFβ1含量檢測(cè)

采用qPCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ITGAV、TGFβ1的mRNA表達(dá)方法如下(qPCR相關(guān)引物序列見表2)：ASMCs種至12孔板后，轉(zhuǎn)染50 nM let-7a-5p模擬物和抑制劑以及正常對(duì)照，轉(zhuǎn)染48 h后提取總RNA。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。以ASMCs細(xì)胞基因組cDNA為模板，進(jìn)行qPCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為10 μL體系：cDNA 1 μL；前后引物 (10 mM/個(gè)) 各0.4 μL；SYBR染料5 μL；之后加DEPC水至10 μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性10 s，之后56℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。

表2 qPCR相關(guān)引物序列Table 2 Related primer sequences of qPCR

采用Elisa檢測(cè)ASMCs 胞外TGFβ1分泌量方法如下：ASMCs種至12孔板后，轉(zhuǎn)染let-7a-5p模擬物和抑制劑以及正常對(duì)照，轉(zhuǎn)染48 h，之后采用Elisa試劑盒測(cè)上清液中TGFβ1量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件，所有數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，進(jìn)行t檢驗(yàn)。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Let-7a-5p靶向分子的生物學(xué)信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果

生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，整合素家族中存在let-7a-5p靶基因，見表3。對(duì)多個(gè)網(wǎng)站結(jié)果作交集后，發(fā)現(xiàn)let-7a-5p與ITGAV、ITGB3基因3′-UTR存在互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)。鑒于已有文獻(xiàn)報(bào)道let-7a-5p可以靶向ITGB3[9]，本研究重點(diǎn)探究let-7a-5p是否可以靶向ITGAV。

表3 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)let-7a-5p的整合素相關(guān)靶基因Table 3 Bioinformatics analysis predicts integrin-related target genes for let-7a-5p

2.2 psiCHECK-2-ITGAV-3′-UTR雙熒光素酶報(bào)告基因載體的構(gòu)建

為驗(yàn)證let-7a-5p是否靶向ITGAV，構(gòu)建含ITGAV基因3′-UTR雙熒光素酶報(bào)告基因載體。首先使用PCR方法，擴(kuò)增得到ITGAV基因3′-UTR序列(含let-7a-5p結(jié)合位點(diǎn))，見圖2(a)。使用瓊脂糖電泳鑒定，結(jié)果顯示，其長度與數(shù)據(jù)庫中提供的一致，約為102 bp，見圖2(b)。將該片段經(jīng)Xhol、NotI雙酶切后插入線性化的psiCHECK-2載體，然后將其轉(zhuǎn)化進(jìn)DH5α感受態(tài)細(xì)胞。隨機(jī)單克隆挑菌培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，再用Xhol和NotI單酶切和雙酶切鑒定，證實(shí)左邊雙酶切和右邊單酶切后得到的基因片段與預(yù)期大小相符，經(jīng)單酶和雙酶消化的重組載體的瓊脂糖電泳圖，見圖2(c)。將重組載體進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果見圖2(d)。正向及反向測(cè)序圖顯示，重組載體中的ITGAV基因3′-UTR序列與PCR產(chǎn)物長度完全一致，并與ITGAV基因的CDS序列相同，故將該報(bào)告重組載體命名為psiCHECK-2-ITGAV-3′-UTR。

圖2 psiCHECK-2-ITGAV雙熒光素酶報(bào)告基因載體的構(gòu)建Fig.2 Construction of psiCHECK-2-ITGAV dual luciferase reporter gene vector

2.3 Let-7a-5p靶向ITGAV雙熒光素酶報(bào)告基因和ASMCs表達(dá)驗(yàn)證

將構(gòu)建成功的雙熒光素酶報(bào)告載體psiCHECK-2-ITGAV-3′-UT轉(zhuǎn)染HEK239T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染let-7a-5p模擬物和對(duì)照組后檢測(cè)熒光素酶活性，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，let-7a-5p模擬物顯著降低熒光素酶活性(下調(diào)約22 %，P<0.01)。而let-7a-5p模擬物加空白質(zhì)粒組無顯著影響(0.93±0.01)，見圖3(a)。該結(jié)果顯示，let-7a-5p可以降低含ITGAV基因3′-UTR的報(bào)告基因的活性，提示其可以和ITGAV基因3′-UTR結(jié)合。

為確認(rèn)let-7a-5p調(diào)控ASMCs細(xì)胞ITGAV表達(dá)，在ASMCs細(xì)胞轉(zhuǎn)染let-7a-5p模擬物和抑制劑后，采用qPCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)let-7a-5p和ITGAV的表達(dá)，結(jié)果顯示，可以顯著增加和降低細(xì)胞內(nèi)let-7a-5p的表達(dá)量，并降低和增加細(xì)胞內(nèi)ITGAV的mRNA表達(dá)，見圖3(b)。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，let-7a-5p轉(zhuǎn)染成功后在ASMCs細(xì)胞內(nèi)可以和ITGAV基因的3′-UTR結(jié)合，從而降低ITGAV表達(dá)。

注：**P<0.01。

2.4 Let-7a-5p調(diào)節(jié)ASMCs TGFβ1的表達(dá)和活化

ASMCs轉(zhuǎn)染let-7a-5p模擬物和抑制劑后，分別檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)TGFβ1的mRNA表達(dá)和細(xì)胞外TGFβ1的分泌量。ASMCs細(xì)胞轉(zhuǎn)染let-7a-5p模擬物、抑制劑及相應(yīng)對(duì)照物后檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)TGFβ1 mRNA的表達(dá)，見圖4(a)；let-7a-5p模擬物和抑制劑對(duì)ASMC細(xì)胞外TGFβ1分泌的影響，見圖4(b)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模擬物降低細(xì)胞內(nèi)TGFβ1的mRNA表達(dá)(0.72±0.08)。但檢測(cè)細(xì)胞外分泌TGFβ1的含量發(fā)現(xiàn)，模擬物組細(xì)胞外TGFβ1的分泌量顯著增加(1.16±0.06)，表明let-7a-5p雖然降低細(xì)胞內(nèi)TGFβ1的mRNA 表達(dá)，但可能增加細(xì)胞外基質(zhì)中TGFβ1的活化。

圖4 Let-7a-5p調(diào)控ASMCs胞內(nèi)ITGAV的表達(dá)和細(xì)胞外基質(zhì)TGFβ1的活化Fig.4 Let-7a-5p regulates intracellular ITGAV mRNA expression and extracellular matrix TGFβ1 activation in ASMCs

3 討論

本研究首先經(jīng)生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)let-7a-5p靶基因，構(gòu)建含靶向基因3′-UTR段的雙熒光素酶報(bào)告載體，驗(yàn)證其活性；隨后采用let-7a-5p模擬物和抑制劑調(diào)控ASMCs細(xì)胞內(nèi)let-7a-5p表達(dá)，檢測(cè)靶基因ITGAV的mRNA表達(dá)以及TGFβ1表達(dá)和分泌。結(jié)果發(fā)現(xiàn)let-7a-5p靶向ITGAV基因3′-UTR的靶點(diǎn)從而增加ASMCs細(xì)胞外TGFβ1活化。

ASMCs不僅具有收縮功能，其分泌表型也廣泛參與氣道結(jié)構(gòu)功能的維持及多種氣道疾病如氣道炎癥的發(fā)生、發(fā)展調(diào)控。隨著研究的深入，逐漸發(fā)現(xiàn)多種細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)分子參與ASMCs分泌表型的調(diào)節(jié)。作為一種新的信號(hào)調(diào)節(jié)分子，miRNAs被認(rèn)為在調(diào)節(jié)氣道炎癥和氣道重塑中起著關(guān)鍵作用，如miR-216a靶向JAK2調(diào)節(jié)氣道重構(gòu)[10-11]。雖然miRNA多達(dá)上千種，但報(bào)道顯示miR-23b、miR-24、miR-30b、miR-451和let-7家族在肺中高度表達(dá)[12-15]。尤其是，let-7a-5p作為炎癥反應(yīng)和細(xì)胞表型的調(diào)節(jié)因子，可以通過靶向抑制轉(zhuǎn)錄因子的活性Smad2和STAT3表現(xiàn)抗炎特性，從而抑制TGF-β2誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移、侵襲和上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化[16]。

miRNA與靶標(biāo)mRNA的3′或5′非翻譯區(qū)甚至CDS區(qū)進(jìn)行不完全，不精確的堿基配對(duì)，從而抑制mRNA的翻譯或降解mRNA[17]。目前，尋找miRNA靶基因的主要方法是通過生物信息學(xué)預(yù)測(cè),但生物信息學(xué)對(duì)miRNA靶基因的預(yù)測(cè)存在較大的假陽性，仍需要通過實(shí)驗(yàn)的方法來驗(yàn)證生物信息學(xué)預(yù)測(cè)的是否準(zhǔn)確[18]。本研究采用Starbase、miRwalk、miRmap多個(gè)數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn)整合素家族的多個(gè)基因，如ITGAV是let-7a-5p的靶基因。經(jīng)雙熒光素酶報(bào)告基因分析、ASMCs轉(zhuǎn)染let-7a-5p后ITGAV表達(dá)分析，確認(rèn)let-7a-5p可以靶向ITGAV的3′-UTR區(qū)域，從而降低ITGAV的基因表達(dá)。

本研究采用海腎和螢火蟲雙熒光素酶報(bào)告基因，其中螢火蟲熒光素酶報(bào)告基因的組成型活性提供內(nèi)對(duì)照，反應(yīng)轉(zhuǎn)染、細(xì)胞及質(zhì)粒等系統(tǒng)的良好狀態(tài)，而海腎熒光素酶報(bào)告基因的活性可以判斷整合基因受let-7a-5p調(diào)節(jié)的活性變化，從而準(zhǔn)確判斷l(xiāng)et-7a-5p與ITGAV相互作用的準(zhǔn)確性。本研究的熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)選擇HEK293T作為受試細(xì)胞，HEK293T細(xì)胞具有易于培養(yǎng)、細(xì)胞貼壁能力強(qiáng)和高轉(zhuǎn)染效率的特點(diǎn)，選擇該細(xì)胞來進(jìn)行熒光素酶報(bào)告基因分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度更高，雙熒光素酶報(bào)告結(jié)果驗(yàn)證了let-7a-5p直接調(diào)控ITGAV的基因表達(dá)。

整合素是粘著斑跨膜結(jié)構(gòu)的重要分子，可以通過粘著斑內(nèi)其成分如vinculin和talin調(diào)節(jié)細(xì)胞的形態(tài)和生物力學(xué)行為[19-20]。這些分子可以連接細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞骨架系統(tǒng)，在許多細(xì)胞行為中發(fā)揮基本作用，如細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞骨架分布和收縮/舒張、細(xì)胞粘附、生長和遷移[21-22]，并且一些整合素亞型如ITGβ3已被證明可被let-7a-5p直接靶向[9]。本研究發(fā)現(xiàn)let-7a-5p調(diào)控細(xì)胞內(nèi)ITGAV的表達(dá)，且通過雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)證明了let-7a-5p通過靶向ITGAV降低細(xì)胞內(nèi)TGFβ1的mRNA表達(dá)，但增加細(xì)胞外TGFβ1分泌量，提示其可以促進(jìn)細(xì)胞外TGFβ1活化。

TGFβ1是一組多效性細(xì)胞因子，具有獨(dú)特的抗炎和免疫調(diào)節(jié)特性，且在肺纖維化發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用，而整合素可能是抗纖維化治療的新靶點(diǎn)。有報(bào)道顯示多種miRNAs可以通過靶向整合素調(diào)控TGFβ1的表達(dá)和活化。本研究發(fā)現(xiàn)let-7a-5p可能通過靶向ITGAV促進(jìn)ASMCs的TGFβ1的活化，從而影響氣道炎癥的發(fā)展。

let-7a-5p的靶向分子眾多，包括整合素家族的多個(gè)亞型，本研究結(jié)果并未確認(rèn)let-7a-5p僅通過靶向ITGAV調(diào)控TGFβ1的表達(dá)和活化，其他整合素家族分子可能也參與let-7a-5p對(duì)ASMCs的TGFβ1表達(dá)和活化，有待于后續(xù)進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建ITGAV基因3′-UTR熒光素酶報(bào)告載體，證明let-7a-5p可以通過靶向ITGAV 3′-UTR降低ASMCs細(xì)胞內(nèi)ITGAV和TGFβ1的表達(dá)，但增加細(xì)胞外分泌TGFβ1量，提示let-7a-5p可能通過靶向ASMCs ITGAV從而促進(jìn)細(xì)胞外TGFβ1活化。研究結(jié)果為進(jìn)一步發(fā)掘let-7a-5p作為ASMCs的分泌調(diào)控分子和相關(guān)藥物開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。