謝璐，吳義才，劉家宇，陳留曉，談鴻偉，汪圣舟，韋依珊，鄒任玲,2△，李丹，胡秀枋

(1.上海理工大學(xué)健康科學(xué)與工程學(xué)院，上海 200093;2.上海貝瑞電子科技有限公司，上海 201100)

引言

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是體外診斷領(lǐng)域的一項(xiàng)關(guān)鍵技術(shù)，該技術(shù)的基本原理[1-2]是利用特異性核酸引物和具有鏈置換效應(yīng)以及識(shí)別延伸效應(yīng)的Bst DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)，在6～65℃恒溫條件下，經(jīng)過(guò)30～60 min，即可將樣本中包含目標(biāo)片段基因的少量核酸分子擴(kuò)增至千百萬(wàn)份，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)從樣本中檢測(cè)出特定病原體的核酸分子的目的。

相比較體外診斷領(lǐng)域中的其他檢測(cè)技術(shù)，LAMP技術(shù)具有高靈敏度、運(yùn)行簡(jiǎn)便、實(shí)驗(yàn)裝置低廉、高特異性等優(yōu)勢(shì)[3]，更能滿足快速準(zhǔn)確檢測(cè)病原微生物的需求，被廣泛應(yīng)用于多種疾病的確診，包括新型冠狀病毒[4-5]、HPV病毒[6]、諾如病毒[7]、流感病毒[8]等，在病原微生物現(xiàn)場(chǎng)[9-10]、基層檢測(cè)[11]等即時(shí)檢測(cè)領(lǐng)域，該技術(shù)也獲得了越來(lái)越多的關(guān)注。

分子POCT(point of care testing)技術(shù)[12-13]，也被翻譯為“現(xiàn)場(chǎng)即時(shí)檢測(cè)技術(shù)”，是基于核酸檢測(cè)技術(shù)上發(fā)展起來(lái)的一個(gè)理念。該理念保留了核酸檢測(cè)流程中最為核心的內(nèi)容“采樣—分析—輸出”，以滿足在最短的時(shí)間內(nèi)得到準(zhǔn)確檢驗(yàn)結(jié)果的臨床要求。而環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的技術(shù)特點(diǎn)可以很好地適配該技術(shù)理念。因此，本研究以LAMP技術(shù)為基礎(chǔ)，結(jié)合分子POCT的理念，設(shè)計(jì)了一款用于核酸檢測(cè)的POCT裝置。

在LAMP技術(shù)的實(shí)驗(yàn)裝置中，包含核酸擴(kuò)增和定量檢測(cè)兩個(gè)核心模塊。核酸擴(kuò)增模塊的主要功能是提供60～65℃的恒溫條件。在傳統(tǒng)的核酸擴(kuò)增系統(tǒng)中，通常使用帕爾貼元件或電阻絲作為熱源，通過(guò)熱傳導(dǎo)對(duì)目標(biāo)物實(shí)現(xiàn)加熱[14]。帕爾貼的優(yōu)勢(shì)在于它集升降溫功能于一身，控制簡(jiǎn)單；缺點(diǎn)在于價(jià)格較高，且難以定制。電阻絲相對(duì)而言價(jià)格低、適應(yīng)范圍廣。因此，本研究采用內(nèi)含電阻絲的陶瓷加熱片作為熱源對(duì)溫度控制。

定量檢測(cè)模塊的主要任務(wù)是對(duì)擴(kuò)增中的核酸分子進(jìn)行檢測(cè)，目前檢測(cè) LAMP 產(chǎn)物的主要方法有凝膠電泳法，嵌合染料法，濁度法，金屬離子指示劑法[15]和熒光探針法[16]等。不同的檢測(cè)方法決定了LAMP技術(shù)的檢測(cè)能力和精度，相比較其他檢測(cè)方法，熒光探針法具有分辨率高、檢測(cè)準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)。因此，本研究依據(jù)熒光探針法設(shè)計(jì)定量檢測(cè)模塊。

傳統(tǒng)的熒光探針檢測(cè)裝置的光路結(jié)構(gòu)為光纖光路[17-20]和共聚焦光路[21-22]，這兩類光路結(jié)構(gòu)使用濾光片將熒光從發(fā)射光中分離，并采用透鏡系統(tǒng)將其傳遞到傳感器中。而濾光片和透鏡的成本較高，且裝配要求高，是核酸擴(kuò)增與檢測(cè)裝置中最為昂貴的模塊。因此，采用新的光路結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)降低成本十分有意義。

本研究依照聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)醫(yī)藥的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[23]要求，對(duì)裝置的核酸擴(kuò)增能力和熒光檢測(cè)能力進(jìn)行設(shè)計(jì)，并進(jìn)行相關(guān)的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

1 材料與方法

系統(tǒng)設(shè)計(jì)包括核酸擴(kuò)增模塊與核酸檢測(cè)模塊兩個(gè)關(guān)鍵部分。核酸擴(kuò)增模塊采用陶瓷加熱片與散熱風(fēng)扇相結(jié)合的方式，創(chuàng)造一個(gè)65℃的恒溫環(huán)境，以實(shí)現(xiàn)樣本內(nèi)部核酸分子的擴(kuò)增；核酸定量檢測(cè)模塊由光路系統(tǒng)、光電檢測(cè)電路與上位機(jī)數(shù)據(jù)處理軟件三部分組成，其對(duì)核酸擴(kuò)增過(guò)程中產(chǎn)生的熒光進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)與記錄，幫助實(shí)驗(yàn)人員對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析。

1.1 核酸擴(kuò)增模塊設(shè)計(jì)

在本裝置中，核酸擴(kuò)增模塊由6061-T6鋁合金、陶瓷加熱片與散熱風(fēng)扇三部分組成。其中6061-T6鋁合金加工性能好、導(dǎo)熱性佳，將其作為核酸擴(kuò)增模塊中的導(dǎo)熱介質(zhì)，通過(guò)控制其溫度來(lái)實(shí)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的恒溫效果。

將鋁合金加工為上下兩個(gè)部分，見圖1。下部分鋁合金作為底座承載樣本管，側(cè)面與陶瓷加熱片和散熱風(fēng)扇連接，采用單片機(jī)控制陶瓷加熱片和散熱風(fēng)扇的開關(guān)，用于維持底座溫度恒定，實(shí)現(xiàn)恒溫核酸檢測(cè)試劑所需的穩(wěn)定溫度環(huán)境；上部分鋁合金作為熱蓋通過(guò)與底座之間的熱傳導(dǎo)實(shí)現(xiàn)溫度控制，目的是確保樣本管上下部位溫度一致，避免在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中產(chǎn)生大量冷凝水，影響核酸擴(kuò)增與熒光信號(hào)的采集。

圖1 恒溫溫控模塊結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Schematic diagram of the thermostat temperature control module

1.2 核酸檢測(cè)模塊設(shè)計(jì)

熒光探針法[24]通過(guò)使用帶有6-羧基熒光素(FAM)熒光標(biāo)記的Taqman探針，該熒光基團(tuán)能夠在約490 nm波段的激發(fā)光源的激勵(lì)下產(chǎn)生520 nm波段的熒光。核酸擴(kuò)增過(guò)程中，探針完整性被破壞，熒光基團(tuán)脫落，在受到入射光激發(fā)后，產(chǎn)生微弱的熒光。

熒光強(qiáng)度隨著核酸分子濃度變化，實(shí)現(xiàn)核酸濃度定性與定量檢測(cè)的功能。熒光強(qiáng)度的檢測(cè)反映了擴(kuò)增后核酸分子的濃度，因此，熒光檢測(cè)的光路設(shè)計(jì)直接影響了核酸分子的檢測(cè)精度。

1.2.1檢測(cè)光路設(shè)計(jì) 在核酸檢測(cè)裝置中，傳統(tǒng)的熒光檢測(cè)光路結(jié)構(gòu)主要有光纖型光路和共聚焦型光路，其光路結(jié)構(gòu)見圖2。

圖2 傳統(tǒng)熒光檢測(cè)光路結(jié)構(gòu)原理圖Fig.2 Schematic diagram of traditional fluorescence detection optical path structure

光纖型光路的核心是采用光纖將光源發(fā)出的光傳導(dǎo)至樣本中，并利用另外一根光纖將熒光傳導(dǎo)至光電傳感器。通常光纖長(zhǎng)度較大，光功率會(huì)出現(xiàn)明顯的損耗，因此，需要透鏡對(duì)光進(jìn)行聚焦處理，以保證檢測(cè)效果，該光路結(jié)構(gòu)的優(yōu)點(diǎn)是應(yīng)用場(chǎng)景較為靈活。文獻(xiàn)[17-20]和上海宏石SLAN-96P熒光定量PCR儀均采用該光路結(jié)構(gòu)。

共聚焦型光路的核心是利用二向色分光鏡對(duì)入射光和熒光信號(hào)進(jìn)行分離處理，多用在只能從樣本上方采集熒光信號(hào)的設(shè)備中。文獻(xiàn)[21-22]和賽默飛ABI7500熒光定量PCR儀等產(chǎn)品采用該光路結(jié)構(gòu)。

這兩種光路結(jié)構(gòu)中均需要采用入射濾光片和檢測(cè)濾光片兩個(gè)帶通濾光片對(duì)光信號(hào)進(jìn)行處理。其中,入射濾光片的功能是將光源的發(fā)射波長(zhǎng)限制在熒光基團(tuán)所能吸收的范圍內(nèi)。檢測(cè)濾光片的波長(zhǎng)范圍是基團(tuán)所發(fā)射熒光的波長(zhǎng)范圍。

由于入射光與熒光的光功率相差極大，若入射濾光片與檢測(cè)濾光片的波長(zhǎng)范圍存在交叉，則熒光信號(hào)將會(huì)被入射光淹沒，導(dǎo)致不能被光電傳感器檢測(cè)到。

為了保證檢測(cè)光路能夠?qū)崿F(xiàn)其檢測(cè)功能，入射光濾光片與檢測(cè)濾光片是傳統(tǒng)熒光檢測(cè)光路結(jié)構(gòu)中的必要元器件。但濾光片的存在會(huì)增加光路結(jié)構(gòu)的成本，且濾光片屬于精密光學(xué)元器件，其安裝要求較高，不利于該技術(shù)向基層推廣。

針對(duì)以上問(wèn)題，本研究依據(jù)PCR熒光檢測(cè)原理，采用正交型光路對(duì)傳統(tǒng)熒光檢測(cè)光路結(jié)構(gòu)進(jìn)行優(yōu)化。具體機(jī)理如下：

位于試管正下方的LED光源發(fā)射出的入射光經(jīng)過(guò)遮光板B內(nèi)部的光纖約束后，以較小直徑的光斑照射到試管內(nèi)的樣本中。由于LED光源位于試管的正下方，因此，入射光全部向上照射，并最終被吸光板所吸收，且不會(huì)被試管側(cè)面的光電傳感器檢測(cè)到。

隨著實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行，樣本內(nèi)的核酸分子開始擴(kuò)增，濃度提高，對(duì)應(yīng)的熒光物質(zhì)的濃度也不斷提高[25]，熒光將被入射光激發(fā)出來(lái)。并以漫反射的形式出現(xiàn)。部分被激發(fā)出的熒光會(huì)向試管側(cè)面照射，經(jīng)過(guò)遮光板A內(nèi)部的光纖約束后，進(jìn)入到試管側(cè)面的光電傳感器中。光電傳感器在受到熒光照射后產(chǎn)生對(duì)應(yīng)的電信號(hào)，并通過(guò)光電檢測(cè)電路實(shí)現(xiàn)對(duì)該電信號(hào)的放大濾波和模數(shù)轉(zhuǎn)換。其光路結(jié)構(gòu)原理見圖3。

圖3 正交光路結(jié)構(gòu)原理圖Fig.3 Schematic diagram of orthogonal optical path structure

本研究中的光路結(jié)構(gòu)可以在不使用濾光片和透鏡的情況下，減少入射光對(duì)熒光采集的影響，降低核酸檢測(cè)裝置中的光學(xué)檢測(cè)部分的成本與技術(shù)難度。同時(shí)，光路結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)緊湊，使各元器件之間不存在相對(duì)位移，保證了光路結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，并且該光路擴(kuò)展性強(qiáng)，可以選用多色LED配合多種熒光探針實(shí)現(xiàn)單樣本管內(nèi)多種核酸靶標(biāo)的檢測(cè)。由于本研究只驗(yàn)證該光路結(jié)構(gòu)的可行性，因此，只采用單色LED進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證。

1.2.2光電檢測(cè)電路設(shè)計(jì) POCT裝置的電路系統(tǒng)框架見圖4。光電檢測(cè)模塊采集樣本被激發(fā)出的熒光信號(hào)通過(guò)MCU進(jìn)行數(shù)據(jù)接收，并處理發(fā)送至上位機(jī)用于顯示和保存。同時(shí)，MCU控制加熱片和散熱風(fēng)扇用于保持實(shí)驗(yàn)環(huán)境的恒溫。

圖4 裝置電路系統(tǒng)整體框圖Fig.4 Overall frame diagram of the device circuit system

目前熒光檢測(cè)中通常采用的光電傳感器共有三類，分別是工業(yè)相機(jī)[18](CCD),光電倍增管[17,21](PMT)和硅光電二極管[19](PD)。三者的優(yōu)缺點(diǎn)見表1。

表1 常用光電傳感器優(yōu)缺點(diǎn)Table 1 Advantages and disadvantages of common photoelectric sensors

本研究要實(shí)現(xiàn)用于核酸檢測(cè)的POCT裝置設(shè)計(jì)，因此，不采用功耗大、成本高的PMT和體積較大的CCD，而采用體積小、技術(shù)成熟的PD作為光電傳感器對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)。

由于熒光信號(hào)的光功率為亞nW量級(jí)，極為微弱。PD是通過(guò)將光信號(hào)(光功率值)轉(zhuǎn)化為電流信號(hào)進(jìn)行工作，在熒光的照射下，其產(chǎn)生的電流也極為微弱，極易受到背景噪聲和電路熱噪聲的影響。因此，在設(shè)計(jì)放大電路之前必須嚴(yán)格控制PD和運(yùn)算放大器的參數(shù)，選擇最適合的型號(hào)。

經(jīng)過(guò)多次選型與測(cè)試，最終本研究光電檢測(cè)模塊中使用濱松光子型號(hào)為S1133-01的硅光電二極管作為光電傳感器，使用靜電級(jí)運(yùn)算放大器ADA4530進(jìn)行運(yùn)算放大，二者的關(guān)鍵參數(shù)見表2、表3。

表2 硅光電二極管S1133-01關(guān)鍵參數(shù)表Table 2 Key parameters of silicon photodiode S1133-01

表3 運(yùn)算放大器ADA4530關(guān)鍵參數(shù)表Table 3 Key parameters of operational amplifier ADA4530

其中，暗電流表示在無(wú)入射光的情況下，PD仍存在的電流輸出，該型號(hào)PD的暗電流最大為10 pA，不影響微弱熒光的檢測(cè)。結(jié)電容越大，放大電路的噪聲越大，因此，盡量選擇較小的結(jié)電容，該P(yáng)D的結(jié)電容低于1 nF，可以進(jìn)行低噪聲電路設(shè)計(jì)。較大的結(jié)電阻可以保證PD產(chǎn)生的光電流全部流向放大電路，該P(yáng)D結(jié)電阻最小為10 GΩ，可以滿足電路需求。

開環(huán)直流增益和增益帶寬積兩個(gè)參數(shù)直接影響運(yùn)放的放大能力，在本研究中這兩個(gè)參數(shù)應(yīng)盡量大；而輸入偏置電流、輸入失調(diào)電流和輸入失調(diào)電壓會(huì)產(chǎn)生噪音，使信號(hào)的轉(zhuǎn)化產(chǎn)生誤差，因此，這三者的值應(yīng)盡可能的小。

在選定元器件以后，將ADA4530配置為跨阻放大器，與以光伏模式工作的S1133-01相連接，其電路圖見圖5。

圖5 帶光電二極管的跨阻放大器電路圖Fig.5 Circuit diagram of transresistance amplifier with photodiode

在采樣電路中，采用精度為24位的AD7799芯片將模擬信號(hào)轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號(hào)；為保證精準(zhǔn)性，選擇AD680作為電壓基準(zhǔn)芯片，并且在輸入端接入LC濾波，在輸出端接入雙電容減少紋波，使其提供的電壓更加精準(zhǔn)(見圖6)。

圖6 AD模數(shù)轉(zhuǎn)換電路圖Fig.6 Circuit diagram of Analog-to-Digital conversion

ADA4530通常需要±5 V電源供電，因此，電源模塊由DC/DC芯片和LDO芯片構(gòu)成。DC/DC芯片選用LM2664，將USB接口接入的5 V電壓轉(zhuǎn)變?yōu)?5 V電壓。LDO芯片選用SPX3819，在此電路中它將5 V電壓轉(zhuǎn)化為3.3 V電壓，用于給微控制器供電(見圖7)。

圖7 光電檢測(cè)電路電源部分原理圖Fig.7 Schematic diagram of power supply part of photoelectric detection circuit

1.2.3軟件設(shè)計(jì) 基于QT為本裝置設(shè)計(jì)了一款上位機(jī)用于對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理與展示，通過(guò)USB接口傳輸至計(jì)算機(jī)，根據(jù)串口的通訊參數(shù)，對(duì)通訊協(xié)議、采樣頻率、波特率和數(shù)據(jù)校驗(yàn)位等進(jìn)行了設(shè)置，以實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)的采集和導(dǎo)出功能(見圖8)。

圖8 上位機(jī)與數(shù)據(jù)存儲(chǔ)Fig.8 Host computer and data storage

1.3 裝置性能測(cè)試實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

圖9為本研究所設(shè)計(jì)核酸檢測(cè)POCT裝置的實(shí)物圖。為了驗(yàn)證該裝置的溫控與熒光檢測(cè)能力，參考行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)設(shè)計(jì)了熒光強(qiáng)度重復(fù)性實(shí)驗(yàn)、熒光濃度梯度線性實(shí)驗(yàn)、環(huán)境光強(qiáng)變化實(shí)驗(yàn)和溫度控制精度實(shí)驗(yàn)。

圖9 核酸檢測(cè)POCT裝置實(shí)物圖Fig.9 Picture of POCT device for nucleic acid detection

1.3.1熒光檢測(cè)能力測(cè)試實(shí)驗(yàn) 熒光檢測(cè)能力測(cè)試實(shí)驗(yàn)采用上海吉至(ACMEC)公司的6-羧基熒光素(FAM)作為熒光染料配置熒光標(biāo)準(zhǔn)品。調(diào)制熒光標(biāo)準(zhǔn)品采用的移液槍品牌為大龍生物(DLAB)，其允許最大系統(tǒng)誤差為0.006～0.18 uL。

以熒光染料溶于水的飽和液作為母液標(biāo)定為1，進(jìn)行梯度稀釋，分別為：1/16濃度、1/32濃度、1/64濃度、1/128濃度、1/256濃度、1/512濃度與去離子水。用以上7個(gè)液體作為檢測(cè)樣本進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.2溫度控制精度檢測(cè)實(shí)驗(yàn) 溫度控制精度檢測(cè)實(shí)驗(yàn)采用FLIRA615紅外熱像儀實(shí)時(shí)對(duì)加熱裝置進(jìn)行溫度監(jiān)測(cè)，溫度檢測(cè)靈敏度小于0.05℃。

2 結(jié)果與討論

2.1 熒光檢測(cè)能力測(cè)試實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1熒光強(qiáng)度重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 光強(qiáng)度檢測(cè)重復(fù)性應(yīng)保證用高、中、低濃度校準(zhǔn)染料重復(fù)檢測(cè)，其變異系數(shù)CV不大于3%。

圖10為各濃度梯度的10次重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，由圖可知，每一濃度的重復(fù)性檢測(cè)結(jié)果偏差極小，接近一條直線。

圖10 各濃度熒光染劑的熒光強(qiáng)度值Fig.10 The fluorescence intensity of each concentration of fluorescent dye

圖11為不同濃度梯度10次檢測(cè)后的CV值與行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)CV值的對(duì)比，可以看出，本研究求得CV值遠(yuǎn)低于行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的CV值。因此，表明本裝置光路結(jié)構(gòu)對(duì)熒光強(qiáng)度檢測(cè)具有良好的重復(fù)性與穩(wěn)定性。

圖11 檢測(cè)熒光CV值與規(guī)定CV值對(duì)照?qǐng)DFig.11 Comparison diagram of detected fluorescence CV value and specified CV value

其中，CV為變異系數(shù)；SD為標(biāo)準(zhǔn)差；M為測(cè)量結(jié)果平均值。

2.1.2熒光濃度梯度線性實(shí)驗(yàn) 熒光濃度梯度線性實(shí)驗(yàn)用于驗(yàn)證熒光強(qiáng)度變化與核酸分子濃度變化的相關(guān)性，該項(xiàng)指標(biāo)直接反映了光路結(jié)構(gòu)對(duì)核酸分子濃度檢測(cè)的靈敏度與真實(shí)性。

根據(jù)行業(yè)要求規(guī)定，對(duì)系列稀釋熒光染料的樣本(至少5個(gè)梯度)進(jìn)行檢測(cè)，各濃度熒光測(cè)定值與稀釋比例的線性相關(guān)系數(shù)r應(yīng)不低于0.990。表4為各濃度梯度的熒光強(qiáng)度平均值與標(biāo)準(zhǔn)差，以及計(jì)算所得相關(guān)系數(shù)。由表4可知，檢測(cè)所得相關(guān)系數(shù)為0.997，高于行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)0.990，可知本研究光路結(jié)構(gòu)檢測(cè)所得熒光信號(hào)與DNA濃度變化有著極好的相關(guān)性，可真實(shí)反應(yīng)DNA濃度的變化。

表4 熒光染劑濃度與檢測(cè)熒光光功率相關(guān)系數(shù)Table 4 Correlation coefficient between fluorescence dye concentration and detection fluorescence light power

其中，Cov(X,Y)為協(xié)方差，Var[X]Var[Y]分別為X、Y的方差。

2.1.3環(huán)境光強(qiáng)變化實(shí)驗(yàn) 通過(guò)對(duì)比在不同環(huán)境下裝置對(duì)同一樣本的檢測(cè)結(jié)果，驗(yàn)證其光密封性與不同環(huán)境檢測(cè)的適應(yīng)能力。

采用t檢驗(yàn)對(duì)比光強(qiáng)為92.5～94.3 Lux的自然光環(huán)境與光強(qiáng)為0.2～0.9 Lux的暗室中裝置的熒光檢測(cè)能力。圖12為暗室環(huán)境與自然光環(huán)境下，重復(fù)測(cè)試10次所得平均值。表5為不同環(huán)境、不同濃度梯度下，求得t檢驗(yàn)結(jié)果。本次實(shí)驗(yàn)t檢驗(yàn)結(jié)果P=0.99897，當(dāng)t檢驗(yàn)P>0.05時(shí)，無(wú)顯著差異，所以在不同環(huán)境光強(qiáng)下，該裝置的檢測(cè)能力不受影響。

圖12 暗室與自然光狀態(tài)下熒光強(qiáng)度對(duì)照?qǐng)DFig.12 Comparison of fluorescence intensity between darkroom and natural light

表5 暗室與自然光狀態(tài)下熒光強(qiáng)度t檢驗(yàn)結(jié)果Fig 5 Fluorescence intensity t test results in dark room and natural light

2.2 溫度控制精度實(shí)驗(yàn)

為驗(yàn)證本研究裝置溫度控制的精度，使用紅外熱像儀對(duì)鋁塊加熱的過(guò)程進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，實(shí)驗(yàn)參數(shù)設(shè)置為室溫28℃，6061鋁合金輻射率為0.95，相對(duì)濕度50%。行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)要求，溫度控制精度應(yīng)不大于±0.5℃。

在10 min內(nèi)，平均每分鐘對(duì)6061鋁合金塊進(jìn)行采樣，其溫度浮動(dòng)范圍小于0.5℃，計(jì)算其標(biāo)準(zhǔn)差為0.143，滿足行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)要求。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖13。

圖13 紅外熱像儀溫度檢測(cè)結(jié)果Fig.13 Thermal imaging camera temperature test table

3 結(jié)論

本研究研制了一種基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的用于核酸檢測(cè)的POCT裝置，使用時(shí)只需將調(diào)制好的樣本放置入核酸檢測(cè)裝置中，即可進(jìn)行核酸擴(kuò)增和檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。

依照核酸檢測(cè)領(lǐng)域相關(guān)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，本研究對(duì)所設(shè)計(jì)的裝置性能進(jìn)行測(cè)試。結(jié)果表明，溫度控制精度小于±0.5℃；熒光強(qiáng)度檢測(cè)結(jié)果變異系數(shù)小于行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)所要求的3%；線性實(shí)驗(yàn)相關(guān)系數(shù)為0.997，大于行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)0.990；不同環(huán)境光強(qiáng)變化實(shí)驗(yàn)的t檢驗(yàn)分布結(jié)果證明了在不同環(huán)境下，檢測(cè)結(jié)果無(wú)顯著性差異。證明該裝置能夠?qū)崿F(xiàn)核酸擴(kuò)增與檢測(cè)的功能，具有可靠性與穩(wěn)定性。

相比較傳統(tǒng)的核酸檢測(cè)裝置，本研究裝置體積小、成本低、能耗小、操作簡(jiǎn)單、適配性強(qiáng)，且滿足行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)所給定的核酸擴(kuò)增與熒光檢測(cè)的要求，因此，可以滿足多種核酸自提取試劑的檢測(cè)需求。

本研究裝置可以克服傳統(tǒng)檢測(cè)過(guò)程需要實(shí)驗(yàn)室、大型實(shí)驗(yàn)設(shè)備與專業(yè)操作人員的缺點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了“現(xiàn)場(chǎng)即時(shí)檢測(cè)”理念中的分析與輸出目標(biāo)。后續(xù)可以推進(jìn)的工作包括在核酸自提取試劑的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)核酸采樣模塊 ，熒光檢測(cè)模塊實(shí)現(xiàn)多種熒光的同時(shí)檢測(cè)，核酸擴(kuò)增模塊實(shí)現(xiàn)不同溫度循環(huán)控制并進(jìn)行實(shí)際生物樣本檢測(cè)等，以實(shí)現(xiàn)單一樣本多種病原體的檢測(cè)功能，適配更多類型的核酸檢測(cè)試劑。