李秀懷 劉宗莉 曾貞

（華南農(nóng)業(yè)大學園藝學院 廣州 510642）

前言

氣質聯(lián)用儀（GC-MS）結合了氣相色譜（GC）高分辨率與質譜（MS）高靈敏度的優(yōu)點，解決了單獨使用氣相色譜或質譜儀進行分析所帶來的局限性，因兼具靈敏度高、選擇性強、分離和鑒定可同時進行等特點，該技術近年來被廣泛應用在食品、醫(yī)藥、環(huán)境、農(nóng)業(yè)等領域。中國是世界上最早生產(chǎn)和飲用紅茶的國家，紅茶是中國六大茶類中最具影響力的茶類之一[1]，一直備受消費者的喜愛，其香氣是茶葉感官審評的重要因子，不同地域、不同品種的紅茶香氣風格各異，表現(xiàn)出甜香、果香、蜜香、花香等多種香氣類型。研究不同種類紅茶中的揮發(fā)性香氣組分及確定其主要呈香物質，對于不同紅茶品種的區(qū)分、紅茶加工技術的提升、以及紅茶品質真?zhèn)蔚蔫b定等具有重要的意義。分析香氣的組分及含量，是茶葉研究的重點，近年來，GC-MS聯(lián)用技術將紅茶香氣組分的研究推向了高潮，本文主要介紹了氣質聯(lián)用技術及其在紅茶香氣檢測中的研究，并提出了展望。

1 氣相質譜聯(lián)用技術

氣相色譜-質譜聯(lián)用 (GC-MS) 技術是目前最成熟的兩譜聯(lián)用技術，通常簡稱為氣質聯(lián)用，是指將氣相色譜儀器 (GC) 與質譜儀 (MS) 通過適當接口 (interface) 相結合, 借助計算機進行聯(lián)用分析的技術[2]，根據(jù)氣相色譜柱固定相的物理狀態(tài)，可將其分為氣固色譜法 (填充柱氣相色譜法) 和氣液色譜法 (毛細管氣相色譜法)[3]。氣質聯(lián)用技術的原理是首先在氣相色譜中，利用被測混合物各組分在色譜柱中氣體流動相與固定相之間分配系數(shù)的差異，實現(xiàn)對待測混合物中的多組分分離；再利用電離源將已分離的各種成分分子電離為離子后輸送入質量分析儀器，根據(jù)不同離子在磁場中運動行為不同將離子按照質荷比分離，經(jīng)過分析后再將所得質譜信號數(shù)據(jù)輸入到計算機中[4]。經(jīng)色譜柱分離后的樣品源源不斷地流入離子源，離子源再不斷地將離子輸送入質量分析器，設定好分析器掃描的質量范圍和掃描時間, 即可在計算機上采集到分離好的質譜圖[5]，質譜圖上色譜峰的保留時間是被測物質定性的依據(jù)，依據(jù)色譜峰的峰高或峰面積又可實現(xiàn)對被測物質的定量分析。因兼具色譜的高分辨率和質譜的高靈敏度，且有大量標準譜庫等特點，氣相色譜聯(lián)用技術被廣泛應用在食品、醫(yī)藥、環(huán)境、化妝品等領域，作為揮發(fā)性物質檢測與分析的重要工具，以期同時實現(xiàn)對混合物中組分的快速分離和對化合物結構特點的精準分析。

2 紅茶香氣特征

香氣是構成紅茶質量的基本屬性之一，在感官審評中是評價紅茶優(yōu)劣的重要因素，常被用作紅茶等級劃分的重要指標。紅茶中的芳香物質種類繁多，且化學組成及結構復雜多變。目前，已從紅茶中檢測出的香氣成分多達400多種[6]，主要香氣物質涵蓋醛類、醇類、酮類、酯類、烯類、烷烴類等[7]，其中以芳樟醇及其氧化物、香葉醇、苯甲醇、苯乙醇、水楊酸甲酯等物質為特征香氣物質[8]。紅茶香氣物質形成機理復雜，通常是在萎凋、揉捻、發(fā)酵、干燥等加工工序中，由香氣前體經(jīng)糖苷類水解、美拉德反應、脂肪酸氧化、類胡蘿卜素降解、異構化等反應綜合作用形成。

紅茶的產(chǎn)地、品種、加工工藝，芳香物質的含量、種類、比例、強度等因子[6]，均會影響紅茶在香型上的最終呈現(xiàn)，目前，市場上的紅茶香型各異，包括玫瑰香型如滇紅[9]、花果香型如祁門紅茶[10]、松煙香型如正山小種紅茶[11]等。楊彩霞[12]等采用同時蒸餾萃取-氣相色譜質譜聯(lián)用（SDE-GC-MS）法，探究不同烘焙條件下滇紅香氣化學成分的變化，結果表明在70℃、90℃烘焙1～4 h時，苯甲醇等主要香氣成分明顯增加，呈現(xiàn)出玫瑰香、花香、甜香；而在90～110℃烘焙溫度下，含量明顯增加的是α-松油醇、吡嗪等物質，呈現(xiàn)出松香、烤香、焦香。由此表明紅茶香型是由多種因素綜合作用的結果。

3 氣質聯(lián)用儀在紅茶香氣物質檢測中的應用與研究進展

傳統(tǒng)的茶葉感官審評是茶葉香氣檢驗的重要手段，但無法完整提供關于香氣物質種類及含量的信息，且因主觀因素而存在一定的局限性。為加強對紅茶香氣特征的科學全面認識，在傳統(tǒng)茶葉感官審評的基礎上，人們結合精密儀器——氣相色譜-質譜（GC-MS）聯(lián)用技術，對紅茶的呈香成分進行更加客觀的檢測與鑒定。

香氣物質的提取與收集是茶葉香氣檢測的第一步，目前常用的茶葉揮發(fā)性物質提取手段有水蒸氣蒸餾法(Steam distillation, SD)、旋轉錐體柱蒸餾法(Spinning cone column Distillation, SCCD)、固相微萃取法(Solid phase microextraction, SPME)、同時蒸餾萃取法(Simultaneous distillation extraction,SDE)、超臨界流體萃取法 (Supercritical fluid extraction, SFE)等；在完成提取的基礎上，再結合氣質聯(lián)用技術，對紅茶中的香味物質的種類及含量進行測定。

3.1 SD-GC-MS聯(lián)用檢測紅茶中的香氣物質

SD法常用于分離和萃取與水不相溶的揮發(fā)性物質，其工作原理是利用水蒸氣將揮發(fā)性較強的組分帶出，經(jīng)冷凝管冷卻后與水分離。譚文涵[13]等在對比研究普洱大葉種紅茶和熟茶中的20種揮發(fā)組分時，便應用了SDGC-MS的分析方法。SD法雖然設備簡單、操作容易、能有效節(jié)省研究成本，常用于揮發(fā)性物質的大規(guī)模提取[14]，但因提取過程香氣組分易因受熱等影響發(fā)生氧化、降解等化學反應，致使提取到的揮發(fā)性組分可能不全或一些餾分可能分解損失，無法確保香氣物質的真實性。

3.2 SCCD-GC-MS聯(lián)用檢測紅茶中的香氣物質

SCCD是一項高效獨特的液-氣接觸蒸餾技術，在國外已被廣泛應用在茶葉、咖啡、植物精油的提取以及葡萄酒、啤酒的脫醇[15]。在旋轉錐體柱內，液態(tài)物料由于重力作用向下流動，與逆流向上的蒸汽或惰性氣體接觸進行相互傳熱和傳質，而旋轉錐高速旋轉時產(chǎn)生的離心力又推動物料向上移動至錐體柱頂部的冷凝系統(tǒng)，如此反復上下流動以實現(xiàn)揮發(fā)性成分的分離或收集濃縮[16]。與SD法相比，SCCD蒸餾時間短，除了更適用于提取熱敏性香氣化合物，在維持茶葉本身自然香氣特征方面具有獨特的優(yōu)勢之外，還能提取出微量的香氣成分，更完整地呈現(xiàn)茶葉原有芳香成分的種類與含量。馬占福[17]等分別采用SD-GC-MS法與SCCD-GC-MS法研究滇紅茶中的香氣物質，并將所得萃取液添加至茶飲料半成品配制成飲料成品，結果顯示SD獲得的滇紅茶特征香氣成分有23種，SCCD有42種，且后者提取到的萃取液制成的茶飲料成品在色澤、口感、香氣等方面均優(yōu)于前者。除紅茶外，在綠茶香氣研究方面也有類似的報道：高陽[18]等以西湖龍井一級綠茶為對象，用GC-MS分別從SCCD法與SD法獲得的香氣提取物中鑒定出82種和52種香氣物質，其中，SCCD提取物中能代表茶葉香氣特征的成分占比更大，而SD提取物中低揮發(fā)性脂肪酸以及由酯類或配糖體受熱分解產(chǎn)生的物質的含量更多，即SCCD法的萃取效果優(yōu)于SD法。但因涉及復雜的旋轉部件與流體動力學模型的設計技術，國內對SCCD在茶葉香氣提取的研究還十分少。

3.3 SPME-GC-MS聯(lián)用檢測紅茶中的香氣物質

SPME是上世紀90年代Arthur和Pawliszyn經(jīng)過研究后首次提出的一項集采樣、萃取、濃縮、吸附和進樣為一體，同時無需溶劑的新型樣品預處理技術[19]，其操作簡單、檢測靈敏度高、符合綠色化學的要求、能快速高效地完成對樣品的前處理，在紅茶香氣分析上具有獨特優(yōu)勢。盡管該技術在發(fā)展中已不斷趨向成熟，但目前在實際樣品分析過程中仍存在一定的缺陷，如萃取頭價格昂貴、維護成本高；萃取頭涂層對樣品的吸附量較少、且易殘留[20]。為進一步推動SPME法在茶葉香氣研究上的應用，學者們通過研究對影響萃取效率的因素包括萃取頭涂層材料的選擇、樣品量的投放、提取溫度時間等條件進行了優(yōu)化，建立起針對某種特定茶樣的最佳萃取條件體系。李云飛[21]等對研究了影響固相微萃取提取紅茶香氣的各種因素，對5種不同型號的萃取頭進行了靈敏度和重復性實驗,得出當萃取條件為NaCl飽和度100%、茶水比1：5.92、萃取時間60.9 min、萃取溫度60℃時，提取云南紅茶香氣成分效果最好的結論。

固相微萃取有三種常用的萃取模式：直接固相微萃取(Direct SPME)、頂空固相微萃取(Headspace SPME)和膜保護固相微萃取(Membrane-protected SPME)，其中HS-SPME萃取模式更適用于易揮發(fā)性有機物的分析，因此更適合作為提取茶葉香氣物質的手段[22]，是當前茶葉香氣物質提取應用最多的方式之一，目前也有不少關于HS-SPME-GC-MS聯(lián)用檢測分析紅茶中香氣物質的研究。楊春[23]等按葉型將久安古茶樹資源劃分為5類后統(tǒng)一制成紅茶茶樣，采用HS-SPME對這5類茶樣揮發(fā)性成分進行提取，用GC-MS共鑒定出83種揮發(fā)性物質，并分析出了5類葉型紅茶香氣特征不同的原因。黃浩[24]等采用HS-SPME-GC-MS技術對春、夏、秋季的黃金茶1號工夫紅茶的香氣品質特征進行研究，結果表明：3個季節(jié)的工夫紅茶樣品共有香氣組分40種，標志差異性化合物有13種；秋季紅茶中揮發(fā)性成分種類與含量均為最多（共66種，總量為345.67μg/L），春季紅茶中最少（共51種，總量為206.09μg/L）；基于對這3個季節(jié)工夫紅茶香氣成分含量的主成分分析，其建立了可有效區(qū)分春、夏、秋季的工夫紅茶樣品的最小二乘-判別分析模型，為該品種工夫紅茶香氣的品質鑒別提供了技術支持。

3.4 SDE-GC-MS聯(lián)用檢測紅茶中的香氣物質

SDE是Likens和Nickerson于1964年提出后經(jīng)多次改進的一種提取揮發(fā)性組分的手段，其工作原理是將樣品和萃取溶劑的蒸汽在密閉裝置中充分混合, 進行反復多次萃取[25]。SDE法重復性高，能將樣品的水蒸氣蒸餾和餾分的溶劑萃取兩個步驟合二為一，以獲得濃縮過數(shù)千倍的高濃度的揮發(fā)性有機物[26],是收集紅茶香氣的一種有效手段。楊停[27]等聯(lián)用SDE-GC-MS結合主成分分析法，在祁門紅茶茶樣中共檢測到48種揮發(fā)成分，主要香氣物質類型為醇類、醛類、芳香烴類、酸類，分別占比54.33%、20.98%、8.54%和6.04%。陳泉賓[28]等以茗科1號紅茶茶樣為試驗材料，采用SDE-GC-MS法探討低溫復式加工技術對紅茶香氣的影響，結果表明低溫復式加工技術能實現(xiàn)增加具花果香味香氣物質的含量的同時降低具有青草氣的青葉醇的含量，為生產(chǎn)花香型紅茶提供了一種新的加工技術。

SDE的特點是萃取溫度高，高溫作用時間長，該特點使其在萃取低揮發(fā)性揮發(fā)物上更具優(yōu)勢，但同時，長時間的高溫作用又可能會造成香氣組分在提取過程中發(fā)生不同程度的熱變化, 產(chǎn)生一些非原有化學成分 (包括揮發(fā)性成分)，不利于反映香氣物質的真實組成[29]。這一點在紅茶香氣分析上還未見闡述，但在其他茶類的香氣分析上已經(jīng)有研究表明：Du[30]等通過對SPME和SDE分別提取到的普洱茶揮發(fā)性化合物進行對比研究，發(fā)現(xiàn)SDE法雖然提取到的揮發(fā)性化合物比SPME提取到的少，但在提取低揮發(fā)性化合物如高分子量的醇、酯和酸方面上，SDE法效果好于SPME法。朱曉鳳[31]等采用了SDE法、HS-SPME法分別對霍山黃大茶的香氣成分進行了提取，發(fā)現(xiàn)SDE法提取到的醇類物質、順式芳樟醇氧化物（呋喃）及雜環(huán)類化合物相對含量較高；其分析可能的原因之一是SDE的蒸餾萃取條件比較苛刻，導致萜烯類氧化反應、糖苷類前體物質水解反應或其他反應（如美拉德反應、Strecker反應等）加劇而產(chǎn)生偽影。

3.5 SFE-GC-MS聯(lián)用檢測紅茶中的香氣物質

SFE是一種以超臨界流體(supercritical fluid, SCF)作為流動相的分離技術。SCF指狀態(tài)處于本身臨界溫度與臨界壓力以上的同時具有高溶解能力與高擴散性能的物質，其對多數(shù)物質有極強的溶解能力，是一種優(yōu)良的溶解劑[32-34]。CO2不可燃、無腐蝕性、成本低廉，是SFE法使用中的首選溶劑，在農(nóng)業(yè)、食品、醫(yī)藥、化工等領域被普遍用作萃取劑提取揮發(fā)性物質。1975年時，這項技術就已經(jīng)被應用在茶葉香氣物質的提取上[35]。SFE-CO2法的工作原理是利用CO2在超臨界狀態(tài)下具有強提取自然產(chǎn)物的能力，通過調節(jié)體系的壓力與溫度來控制其密度，從而提取出香氣物質以及將被溶解的香氣物質從氣相中分離出來。孫海林[36]等采用GC-MS技術對超臨界CO2萃取法香氣提取物進行檢測，考察該方法是否可用于提取滇紅茶香氣成分，結果表明：GC-MS成功從該茶樣提取物中檢測出近50種香氣成分，超臨界CO2流體萃取技術可用于滇紅茶有效香氣成分的提取。同時其通過單因素實驗、正交實驗確定了該技術萃取云南鳳慶滇紅茶樣的最佳工藝。SFE法優(yōu)點是無毒無污染、無有機溶劑殘留，且與SDE法相比操作溫度更低，得到的萃取物中所含成分幾乎與原始茶樣中的完全相同[37,38]，萃取率高。這一點可以借鑒鐵觀音香氣的研究：黃長修[39]等對比了SDE與SFE分別獲得的鐵觀音香氣萃取物，結果表明：SDE所得提取物鑒定出45種成分, 總萃取率為0.122%；SFE的萃取物鑒定出33種成分, 總萃取率為0.231%；即雖然SDE獲得的香氣組分更多, 但這可能是因為SDE在高溫萃取過程中產(chǎn)生了一些新的揮發(fā)性衍生物；而從萃取物中主要香氣成分的質量分數(shù)與萃取率來看，SFE更高。此外，與SPME相比，SFE法可處理的樣品量大，但SFE對設備要求較高，投資成本大[40]，在紅茶香氣物質的檢測上，還是不如SPME-GCMS應用廣泛。

表1 常用前處理辦法提取紅茶香氣物質的優(yōu)缺點

3.6 GC-MS與其他技術聯(lián)用檢測紅茶中的香氣物質

GC-MS是定量定性分析香氣物質的一種有效手段，但無法具體衡量某一香氣組分在香型的形成中是否有貢獻或貢獻程度的大小；而紅茶香氣特征的形成不僅取決于揮發(fā)性物質的種類與含量，還取決于香氣組分的貢獻值與相互之間的作用。因此，在檢測方面，常將GC-MS與嗅聞儀、電子鼻等儀器聯(lián)用，解決GC-MS在風味研究中的難題。氣相色譜-嗅聞-質譜（GC-O-MS）聯(lián)用技術集分離、定性定量分析、活性成分識別等優(yōu)點于一體，既能鑒定物質的結構,又能有效地鑒別食品中關鍵的氣味活性成分[41]，已成為食品香氣分析領域的研究熱點，在紅茶香氣方面也有相關的研究報道。Xiao[42]等采用GC-MS在譚陽紅、滇紅、祁門紅、宜興紅4種中國工夫紅茶中依次鑒定到63種、64種、62種、62種香氣物質后，用GC-O對這些香氣物質進行嗅聞分析并篩選出了香氣活性化合物，以此為基礎通過偏最小二乘回歸（PLSR）對茶葉樣品、感官屬性和香氣活性化合物之間的關系進行建模，開發(fā)了一種可靠、客觀描述工夫紅茶香氣的方法。葛曉杰[43]等聯(lián)用GC-O-MS技術，對形成花香型紅茶、甜香型紅茶兩種不同香型的關鍵活性成分進行分析，檢測出水楊酸甲酯、橙花醇、苯甲醛、氧化芳樟醇在“花香型”紅茶中呈香更顯著，而脫氫芳樟醇、(反,反)-2,4-庚二烯醛、(反,反)-3,5-辛二烯-2-酮在“甜香型”紅茶中呈香更顯著，這7種成分是決定兩種香型差異的關鍵性因子，為研究不同香型紅茶的呈香因子與理化性質提供了借鑒。

電子鼻檢測技術，是通過模擬人類嗅覺系統(tǒng)的工作特性，對樣本揮發(fā)性物質進行識別、分析、分類的一項仿生技術。在電子鼻系統(tǒng)內置有傳感器陣列和多元數(shù)據(jù)處理器，能實現(xiàn)對復雜氣味信息的采集與綜合判定，與GC-MS聯(lián)用，能實現(xiàn)對茶葉香氣的科學全面評價以及對不同品質茶葉的有效區(qū)分[44-46]。李達敏[47]等對電子鼻與感官分別審評不同海南紅碎茶的結果進行比較，發(fā)現(xiàn)電子鼻技術結果與感官審評基本一致，且電子鼻可以呈現(xiàn)不同紅碎茶的香氣指紋圖譜以區(qū)別不同的茶葉，比單純感官審評結果更全面。王帥[48]等分析用電子鼻區(qū)別有機正山小種紅茶、普通一級正山小種紅茶、普通二級正山小種紅茶3個等級不一的正山小種紅茶的可行性，結果表明：對于香氣存在明顯差異的有機正山小種紅茶與普通正山小種紅茶，以及香氣差異較小的2個不同等級的普通正山小種紅茶，電子鼻都能成功加以識別與區(qū)分；由此說明電子鼻技術也能為同類型不同品質的紅茶的鑒定和認證工作提供簡捷快速的途徑。Yan[49]等聯(lián)用GC-MS與電子鼻技術對富蘊6號和金觀音2個茶樹品種紅茶的主要香氣成分和香氣差異進行了研究，GC-MS結果表明2個品種中有9種香氣物質存在顯著差異，電子鼻的結果表明內置的10個傳感器中有5個能夠識別2個品種的香氣差異并加以區(qū)分，研究結果闡明GC-MS與電子鼻的聯(lián)用能為不同品種紅茶香氣成分的檢測與區(qū)分提供技術支持。

在數(shù)據(jù)分析方面，GC-MS聯(lián)用技術的應用一般與香氣活度值(odor activity value, OAV)結合，以此篩選出構建香氣特征的關鍵香氣活性物質，完善香氣檢測與鑒定體系的同時為香氣改良提供理論指導。OAV是指樣品中揮發(fā)性物質濃度與該物質香氣閾值的比值[50]，當OAV＞1時，將該物質定義為關鍵香氣組分；當0.1＜OAV＜1時，將該物質定義為修飾性香氣組分；當OAV＜0.1時，將該物質定義為潛在香氣組分；在一定范圍內，OAV值越大，說明該物質對總體香氣形成的貢獻程度越大[51]。張韻[52]等采用HS-SPME-GC-MS對3種高香種工夫紅茶進行提取檢測后，從中篩選出23種OAV值大于1的關鍵香氣組分，并以此為基礎利用偏最小二乘回歸法分析了茶樣香氣特征與關鍵香氣成分之間的關聯(lián)，為該品類紅茶的品質評定與調控提供了理論支撐。鄭鵬程[53]等先用HS-SPME-GC-MS法初步明確湖北省32個不同區(qū)域紅茶香氣物質種類與總量，后結合OAV值進一步探討32個紅茶的主要香氣成分與香氣類型。尹鵬[54]等采用HS-SPME-GC-MS結合香氣活度值對4種信陽紅茶樣品的香氣成分進行了分析，結果共檢測到88個主要香氣成分，含量高且OAV值大于1的香氣成分有芳樟醇、β-紫羅酮等7種，含量較低但OAV值較高的有β-大馬烯酮、癸醛等5種，其中β-大馬烯酮的OAV值高達272.00，側面表明了香氣組分含量高的物質，在茶葉呈香中的貢獻不一定大。OAV值的測定，為紅茶香氣構成的研究分析提供了更為科學的判斷依據(jù)。

結語

綜上所述，水蒸氣蒸餾法(SD)、旋轉錐體柱蒸餾法（SCCD）、同時蒸餾萃取法(SDE)、固相微萃取法(SPME)、超臨界流體萃取法(SFE)在紅茶有效香氣成分的提取與收集上均有較好的適用性，但每種前處理方式都有其優(yōu)點與缺點，為確保真實體現(xiàn)紅茶本身香氣品質，在實驗時應根據(jù)實際需求加以選擇。在對香氣物質進行恰當前處理的基礎上，采用氣質色譜質譜聯(lián)用技術能實現(xiàn)對紅茶揮發(fā)性香氣物質的有效檢測與評定，進一步明確香氣品質形成的化學物質基礎；與嗅聞技術、電子鼻技術等結合，還能彌補傳統(tǒng)感官審評受主觀影響較大而使評審結果出現(xiàn)較大誤差的缺陷，更客觀、全面、準確地實現(xiàn)對紅茶品質的量化分析及品種分類。目前國內外應用GC-MS聯(lián)用技術對紅茶類香氣的分析多集中于大吉嶺紅茶、祁門紅茶、滇紅、正山小種紅茶等品種，對廣東地區(qū)主產(chǎn)紅茶品種特征香氣組分種類與含量的研究還有待進一步加強，以用于構建其香氣特征GC-MS譜帶，為其香氣的控制與優(yōu)化積累更多更全面的科學性研究數(shù)據(jù)，為其香氣審評及品質鑒定提供更快速便捷的技術支持。