蘇日娜 劉天怡 馬璐瑤 劉夢(mèng)華 周 娜 郝 鈺

（北京中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院免疫與微生物學(xué)系，北京 102488）

小檗堿（berberine，BBR）又名黃連素，是一種常見(jiàn)的異喹琳生物堿，是從黃連屬植物中提取的天然活性成分，具有抗炎、抗氧化、降血糖、降脂、抗凋亡等多種生物活性。BBR 可以通過(guò)抑制各種炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生與表達(dá)，以及抑制炎癥信號(hào)通路的激活來(lái)減輕炎癥反應(yīng)［1-2］。研究發(fā)現(xiàn)，BBR 可以同時(shí)通過(guò)抗炎、抗氧化等雙重作用治療糖尿病并發(fā)癥、非酒精性脂肪肝等多種炎癥性疾病［3-5］。進(jìn)一步研究顯示，BBR 治療非酒精性脂肪肝的可能機(jī)制是在ROS/TXNIP 軸介導(dǎo)下，抑制NLRP3 炎癥體活化及其介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡［6］。NLRP3作為目前研究最深入的固有免疫模式識(shí)別受體，受到刺激后可被激活并組裝成NLRP3 炎癥體，在多種炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。ROS 是氧化應(yīng)激的主要產(chǎn)物，機(jī)體受到損傷后生成的線(xiàn)粒體活性氧簇（mitochondrial reactive oxygen species，mtROS）被認(rèn)為是NLRP3 炎癥體活化的關(guān)鍵調(diào)控因素之一［7］。本課題組前期研究亦發(fā)現(xiàn)BBR 可通過(guò)降低mtROS 的表達(dá)抑制NLRP3 炎癥體的活化，但其作用機(jī)制仍需進(jìn)一步深入探究［8］。

NLRP3 炎癥體活化后可激活炎癥半胱氨酸Caspase-1，而活化的Caspase-1又可以切割下游焦亡執(zhí)行因子gasdermin D（GSDMD），使其產(chǎn)生具有細(xì)胞毒性的GSDMD-N 端并在細(xì)胞膜上打孔觸發(fā)細(xì)胞焦亡，一些促炎因子如IL-1β、IL-18通過(guò)該孔被分泌至胞外并進(jìn)一步擴(kuò)大炎癥反應(yīng)［9-10］。本課題組已經(jīng)發(fā)現(xiàn)BBR 對(duì)mtROS-NLRP3 信號(hào)通路有抑制作用，BBR 是否通過(guò)進(jìn)一步抑制NLRP3 炎癥體介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡來(lái)發(fā)揮抗炎作用呢？基于此，本研究中用H2O2處理細(xì)胞，構(gòu)建線(xiàn)粒體氧化應(yīng)激損傷模型，并以mtROS-NLRP3 信號(hào)通路介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡為切入點(diǎn)，通過(guò)探討B(tài)BR 對(duì)巨噬細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷誘導(dǎo)的細(xì)胞焦亡的影響，進(jìn)一步證實(shí)其抗炎抗氧化的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 小鼠巨噬細(xì)胞系J774A.1（北京協(xié)和細(xì)胞庫(kù)）儲(chǔ)存于北京中醫(yī)藥大學(xué)免疫與微生物學(xué)系實(shí)驗(yàn)室液氮罐中。鹽酸小檗堿（中國(guó)食品藥品檢定研究 院，批 號(hào)：110713-201613）；過(guò) 氧 化 氫、NAC（Sigma）；SYBR-Green 熒 光 定 量PCR 試 劑 盒（ToYoBo）；RNA 提 取 試 劑Trizol、MitoTracker?Red CMXRos（Invitrogen）；BCA 試劑盒（Beyotime）；anti-NLRP3 抗 體（Cell Signaling Technology，Cat.No15101S）；小鼠IL-1β ELISA 檢測(cè)試劑盒（Bioleg?end，Cat.No 432604）；ROS 檢測(cè)試劑盒、乳酸脫氫酶（LDH）檢測(cè)試劑盒（碧云天生物公司）；FAM FLICA?Caspase-1 Assay Kit（Immuno Chemistry）；胎牛血清（HyClone）。引物采用Primer6.0 設(shè)計(jì)，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成（表1）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞分組及處理 培養(yǎng)J774A. 1 細(xì)胞用含10%胎牛血清、1×105U/L 青霉素和100 mg/L 鏈霉素的DMEM 高糖培養(yǎng)基于37 ℃、5%CO2的無(wú)菌培養(yǎng)箱中。設(shè)置正常對(duì)照組（control組）、模型組（H2O2作用24 h）、BBR 干預(yù)組（H2O2+BBR 作用24 h）和NAC 干預(yù) 組（H2O2+NAC 作 用24 h）。 H2O2終 濃 度 為100 mmol/L，BBR 終濃度為16.8μmol/L，NAC 終濃度為1μg/ml。

1.2.2 免疫熒光法 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的巨噬細(xì)胞J774A. 1接種于激光共聚焦培養(yǎng)皿中（1×106個(gè)/皿），細(xì)胞處理24 h后棄培養(yǎng)基，PBS清洗細(xì)胞，加入線(xiàn)粒體膜染料MitoTracker Red（1∶1 000）和ROS 熒光探針DCFH-DA（終濃度10μmol/L），37 ℃孵育30 min，棄染料，PBS 洗2 遍，加入DMEM 1 ml/皿，激光共聚焦顯微鏡下觀(guān)察線(xiàn)粒體和ROS 的共定位情況及ROS熒光強(qiáng)度。

1.2.3 RT-qPCR 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的巨噬細(xì)胞J774A. 1 接種于6 孔板中（1×106個(gè)/孔），細(xì)胞處理24 h 后，棄培養(yǎng)基，PBS 清洗細(xì)胞后加入Trizol 試劑裂解細(xì)胞（500μl/孔），并參照說(shuō)明書(shū)提取各組細(xì)胞總RNA。依據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明，每組取1μg RNA配制成10μl 反轉(zhuǎn)錄體系以獲取相應(yīng)的cDNA，隨后用DEPC 水將其10 倍稀釋。取1μl 稀釋后的cDNA作為模板，以小鼠GAPDH 基因作為內(nèi)參，并加入相應(yīng)的引物（表1），實(shí)時(shí)熒光定量法檢測(cè)各組樣品中NLRP3、IL-1β 基因的mRNA 水平。采用2-ΔΔCt法定量分析數(shù)據(jù)。

表1 設(shè)計(jì)并合成的引物Tab.1 Primers designed and synthesized in this study

1.2.4 Western blot 收集各組巨噬細(xì)胞，加入RIPA 裂解液提取細(xì)胞總蛋白。以β-actin 作為內(nèi)參蛋白，用BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒根據(jù)測(cè)定蛋白濃度，然后進(jìn)行蛋白變性，每組蛋白上樣質(zhì)量為20μg，經(jīng)10%SDS-PAGE 電泳后，轉(zhuǎn)至PVDF 膜上電轉(zhuǎn)100 V 70 min。電轉(zhuǎn)后用5%脫脂奶粉室溫?fù)u床封閉1 h，加入兔源抗NLRP3 抗體（1∶1 000 稀釋?zhuān)┘笆笤纯功?actin抗體（1∶5 000稀釋?zhuān)┦覝負(fù)u床孵育3 h或4 ℃過(guò)夜。TBST 洗膜3 次，加入相應(yīng)的羊抗兔和羊抗鼠Ⅱ抗（均按1∶5 000稀釋?zhuān)?，室溫?fù)u床孵育1 h。TBST 洗膜3 次，HRP-ECL 超敏發(fā)光劑顯色、曝光。以目的蛋白條帶與內(nèi)參條帶灰度值的比值進(jìn)行半定量分析。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù) 細(xì)胞處理同1.2.3。①收集6 孔板內(nèi)的細(xì)胞至1.5 ml EP 管內(nèi)，用PBS 洗滌后，加入DCFH-DA（終濃度10 μmol/L），37 ℃孵育30 min，棄染料再用PBS洗滌2遍，重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)。②各組細(xì)胞刮下后，PBS洗滌，每管加入FLICA?caspase-1 染色工作液（1∶30）重懸細(xì)胞并混勻，放入培養(yǎng)箱中避光孵育1 h 后，配制1×Wash Buffer 洗滌細(xì)胞，加入PI 染色液（1∶1 000）重懸細(xì)胞，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.6 檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液上清中LDH 和IL-1β 的釋放水平 具體操作參照相應(yīng)試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以±s表示。多組差異采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），多重比較采用LSD 法（方差齊時(shí)）或Games-Howell 法（方差不齊時(shí)）。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BBR 對(duì)H2O2刺激的巨噬細(xì)胞線(xiàn)粒體釋放ROS的影響 流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組中巨噬細(xì)胞生成的ROS明顯增多（圖1A），激光共聚焦顯微鏡結(jié)果進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)模型組中增多的ROS 與線(xiàn)粒體有明顯的共定位關(guān)系（圖1B），與模型組比較，BBR 或NAC 干預(yù)后ROS的生成及與線(xiàn)粒體的共定位顯著減少（P＜0.01，圖1）。

圖1 BBR對(duì)H2O2刺激的巨噬細(xì)胞mtROS產(chǎn)生的影響Fig.1 Effects of BBR on production of mtROS in J774A.1 cells stimulated by H2O2

2.2 BBR 對(duì)H2O2刺 激 的 巨 噬 細(xì) 胞 中NLRP3 及IL-1β mRNA 表達(dá)的影響 熒光定量PCR 結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組（H2O2）巨噬細(xì)胞中的NLRP3 及IL-1β mRNA 水平顯著升高；與模型組相比，BBR 加藥組和NAC 組可明顯下調(diào)巨噬細(xì)胞中的NLRP3及IL-1β mRNA的表達(dá)水平（圖2）。

圖2 BBR 對(duì)H2O2 刺激的巨噬細(xì)胞中NLRP3 及IL-1β mRNA表達(dá)的影響Fig.2 Effects of BBR NLRP3 and IL-1β mRNA expres?sion in J774A.1 cells stimulated by H2O2

2.3 BBR 對(duì)H2O2刺激的巨噬細(xì)胞中NLRP3蛋白表達(dá)的影響 Western blot 結(jié)果顯示，同對(duì)照組相比，模型組巨噬細(xì)胞中NLRP3 的相對(duì)表達(dá)量增高，與模型組相比，BBR或NAC干預(yù)后可降低NLRP3的表達(dá)量（圖3）。

圖3 BBR 對(duì)H2O2刺激的巨噬細(xì)胞中NLRP3 蛋白表達(dá)的影響Fig.3 Effects of BBR on protein expression of NLRP3 in J774A.1 cells stimulated by H2O2

2.4 BBR對(duì)H2O2刺激的巨噬細(xì)胞Caspase-1活性及其介導(dǎo)的焦亡的影響 流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組細(xì)胞Caspase-1 活性顯著升高；與模型組相比，小檗堿干預(yù)組細(xì)胞Caspase-1活性顯著下降（圖4A）；同時(shí)，模型組中Caspase-1 介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡率較正常組亦顯著升高，而B(niǎo)BR組和NAC組中Caspase-1 介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡率較模型組顯著降低（圖4B）。

圖4 BBR 對(duì)H2O2 刺激的巨噬細(xì)胞Caspase-1 活性及其介導(dǎo)的焦亡的影響Fig.4 Effects of BBR on Caspase-1 activity and pyroptotic rate of J774A.1 cells stimulated by H2O2

2.5 BBR 對(duì)H2O2刺激的巨噬細(xì)胞中LDH 釋放水平的影響 檢測(cè)不同處理組巨噬細(xì)胞釋放的LDH 結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組巨噬細(xì)胞釋放LDH水平顯著升高；BBR 組及NAC 組巨噬細(xì)胞釋放的LDH 水平相對(duì)于模型組均顯著降低（圖5）。

圖5 BBR對(duì)H2O2刺激的巨噬細(xì)胞中LDH釋放水平的影響Fig.5 Effects of BBR on release of LDH in J774A. 1 cells stimulated by H2O2

2.6 BBR 對(duì)H2O2刺激的巨噬細(xì)胞中IL-1β 分泌水平的影響 與正常對(duì)照組相比，模型組細(xì)胞上清液中IL-1β 分泌水平顯著升高；與模型組相比，BBR 組和NAC組的IL-1β分泌水平顯著下降（圖6）。

圖6 BBR 對(duì)H2O2 刺激的巨噬細(xì)胞中IL-1β 分泌水平的影響Fig.6 Effects of BBR on secretion of IL-1β in J774A. 1 cells stimulated by H2O2

3 討論

大量證據(jù)表明，人類(lèi)疾病的發(fā)病機(jī)制與氧化應(yīng)激的增加有關(guān)［11］。ROS 是氧化應(yīng)激的主要產(chǎn)物，細(xì)胞ROS 的主要來(lái)源是線(xiàn)粒體，各種應(yīng)激條件，包括代謝率增加、缺氧或膜損傷，都顯著地誘導(dǎo)mtROS的產(chǎn)生［7］。本研究結(jié)果顯示，氧化應(yīng)激誘導(dǎo)劑H2O2處理的巨噬細(xì)胞中mtROS 水平顯著增加，BBR 干預(yù)可明顯減低mtROS 的累積，說(shuō)明BBR 能夠抑制mtROS 的累積從而減輕H2O2誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷。

氧化應(yīng)激和炎癥密切相關(guān)，在疾病的病理發(fā)展過(guò)程中常同時(shí)出現(xiàn)。作為固有免疫系統(tǒng)的重要組成部分，NLRP3 炎癥體的過(guò)度活化在病毒感染、糖尿病、痛風(fēng)、炎癥性腸病等多種疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。NLRP3 炎癥體的活化需要雙信號(hào)：①啟動(dòng)信號(hào)-NLRP3識(shí)別胞質(zhì)中病原體相關(guān)分子模式（PAMPs）或損傷相關(guān)分子模式（DAMPs），通過(guò)激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB 促進(jìn)NLRP3 和前白細(xì)胞介素-1β（pro-IL-1β）的基因表達(dá)上調(diào)；②活性氧（ROS）的產(chǎn)生、離子通量的改變、溶酶體破裂等被認(rèn)為是NLRP3炎癥體激活的觸發(fā)因素［12-13］。在以上分子事件的刺激下，NLRP3 炎癥體組裝并激活Cas?pase-1，活性caspase-1 切割細(xì)胞因子pro-IL-1β 和pro-IL-18 促進(jìn)其成熟［14-15］。研究發(fā)現(xiàn)線(xiàn)粒體ROS 有助于NF-κB 信號(hào)通路的活化、促炎細(xì)胞因子的釋放，抑制mtROS 可消除低氧誘導(dǎo)的大鼠內(nèi)皮細(xì)胞中NF-κB活化和IL-6分泌［16］。線(xiàn)粒體ROS更是被看作NLRP3 炎癥體激活的主要調(diào)控因子，特別是在NFκB 信號(hào)通路的激活和炎癥小體組裝方面都發(fā)揮了重要作用［7］。本課題組前期研究亦有相同發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)相關(guān)抗氧化基因的表達(dá)可以清除過(guò)量的ROS，繼而抑制NF-κB 核轉(zhuǎn)位，減少NLRP3 炎癥體活化［17］。本研究結(jié)果顯示，在H2O2處理巨噬細(xì)胞構(gòu)建的線(xiàn)粒體氧化應(yīng)激損傷模型中，隨著mtROS 的累積，NLRP3 和IL-1β 的基因表達(dá)顯著提高，NLRP3 的蛋白表達(dá)量增多，Caspase-1 活性增強(qiáng)；加入ROS 清除劑NAC后NLRP3炎癥體的活化被顯著抑制，進(jìn)一步確證了mtROS 對(duì)NLRP3 炎癥體活化的調(diào)控作用，BBR 干預(yù)后，能夠明顯抑制mtROS 的表達(dá)并進(jìn)一步抑制NLRP3炎癥體的活化。

NLRP3 炎癥體的激活對(duì)依賴(lài)于Caspase-1 的經(jīng)典細(xì)胞焦亡途徑至關(guān)重要。NLRP3 炎癥體激活后促進(jìn)pro-caspase-1 的活化，活化的Caspase-1 不僅能將pro-IL-1β 和pro-IL-18切割成熟的生物活性形式，還能切割GSDMD，解除其自身C 端結(jié)構(gòu)域?qū) 端結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)抑制，GSDMD N 端具有成孔活性，可以在細(xì)胞膜上打孔，觸發(fā)一種細(xì)胞腫脹裂解性的促炎細(xì)胞死亡形式，稱(chēng)為焦亡［9］。當(dāng)胞膜的完整性遭到破壞時(shí)，細(xì)胞發(fā)生滲漏，LDH 及成熟的細(xì)胞因子IL-1β 和IL-18 向胞外釋放并募集更多炎癥細(xì)胞，擴(kuò)大局部炎癥反應(yīng)［18-19］。本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，H2O2處理巨噬細(xì)胞后，細(xì)胞上清中IL-1β 的分泌水平和LDH 釋放量顯著增多，Caspase-1介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡率也顯著升高，提示H2O2能誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞焦亡。而B(niǎo)BR能夠減輕Caspase-1介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡、減少I(mǎi)L-1β的分泌水平和LDH的釋放。

綜上所述，H2O2誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞線(xiàn)粒體氧化損傷可以產(chǎn)生大量ROS，累積的ROS 促進(jìn)NLRP3 炎癥體的活化繼而激活Caspase-1依賴(lài)的細(xì)胞焦亡，促使成熟的IL-1β 釋放至胞外放大局部炎癥反應(yīng)。BBR通過(guò)減少線(xiàn)粒體釋放的ROS 來(lái)抑制NLRP3 炎癥體活化，進(jìn)而抑制活化的Caspase-1 介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡，減少I(mǎi)L-1β 的分泌，從而發(fā)揮抗炎作用。本研究以mtROS-NLRP3-焦亡為切入點(diǎn)，進(jìn)一步充實(shí)BBR 抗炎抗氧化的理論機(jī)制，為臨床治療相關(guān)疾病豐富了理論基礎(chǔ)。