楊彥茹 李淑珍 錢佳佳 （烏蘭察布醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校藥學(xué)檢驗(yàn)系，烏蘭察布 012000）

肺癌是常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅人類生命健康。依據(jù)病理類型的不同，可將肺癌分為小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌，其中非小細(xì)胞肺癌占肺癌患者的80%～90%［1］。目前，肺癌的治療主要以手術(shù)聯(lián)合放化療為主，早期肺癌治療療效較佳，而多數(shù)患者確診時(shí)已處于中晚期，五年生存率低于50%，因此，需要尋找更有效且安全的治療方法［2］。表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EG?FR）是一種受體型酪氨酸激酶，其異常活化和過表達(dá)可引起腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，因此，靶向EGFR 小分子抑制劑成為腫瘤治療的重要策略之一［3］。納扎替尼（nazartinib）是第三代表EGFR酪氨酸激酶抑制劑，是目前正在開發(fā)和臨床測(cè)試的用于治療非小細(xì)胞肺癌的候選藥物［4］。微小RNA（miRNA）是一類參與調(diào)控細(xì)胞增殖、分化和凋亡等生命過程的小分子非編碼RNA，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，是腫瘤治療的潛在分子靶點(diǎn)。研究顯示，miR-940 在非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）組織中的表達(dá)明顯低于癌旁組織，且miR-940 高表達(dá)的NSCLC 患者總生存率明顯高于miR-940 低表達(dá)患者，過表達(dá)miR-940 靶向抑制FAM83F 的表達(dá)降低了肺癌細(xì)胞的增殖能力［5］。因此，本研究以肺癌細(xì)胞NCI-H2170 為研究對(duì)象，旨在觀察nazartinib 對(duì)NCI-H2170細(xì)胞增殖和凋亡的影響及其能否通過調(diào)控miR-940 發(fā)揮作用，以期為nazartinib 在臨床中的應(yīng)用提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 肺癌細(xì)胞系NCI-H2170（中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)）；nazartinib（美國(guó)Selleck 公司）；胎牛血清（FBS，浙江天杭生物科技公司）；RPMI 1640 培養(yǎng)基、細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8（CCK-8）、Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡試劑盒和二喹啉甲酸（BCA）蛋白檢測(cè)試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；LipofectamineTM2000試劑盒和Trizol試劑（美國(guó)Invitrogen 公司）；miR-940抑制劑（anti-miR-940）、抑制劑陰性序列（anti-miRNC）和PCR 引物（上海生工生物工程有限公司）；兔抗人細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）、活化的半胱天冬酶-3（Cleaved-caspase-3）、磷酸化JAK2（p-JAK2）、磷酸化STAT3（p-STAT3）和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）多克隆抗體（美國(guó)Santa Cruz 公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR 試劑盒（大連寶生物工程有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 復(fù)蘇NCI-H2170細(xì)胞，用含10%FBS 的RPMI1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)。將NCIH2170 細(xì)胞以2.5×105個(gè)/孔NCI-H2170 細(xì)胞接種于6 孔板中，用LipofectamineTM2000 脂質(zhì)體法，分別轉(zhuǎn)染anti-miR-940、anti-miR-NC。轉(zhuǎn)染6 h 后，更換培養(yǎng)基。再培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞備用。

1.2.2 細(xì)胞分組處理 未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞分為對(duì)照組（NC組）、不同劑量nazartinib組，其中NC組細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，nazartinib 組細(xì)胞分別用含1、2、4、8、16 nmol/L nazartinib 的培養(yǎng)基培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染anti-miR-NC、antimiR-940 的細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)，記為anti-miR-NC組、anti-miR-940 組。轉(zhuǎn) 染anti-miR-NC、anti-miR-940 的細(xì)胞用含8 nmol/L nazartinib 的培養(yǎng)基培養(yǎng)，記為nazartinib+anti-miR-940組、nazartinib+anti-miRNC組。

1.2.3 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖 細(xì)胞以2.5×104個(gè)/孔接種于96 孔板中，按1.2.2 分組處理。培養(yǎng)24 h后，10 μl/孔加CCK-8 試劑。再孵育2 h，酶標(biāo)儀450 nm測(cè)光密度（OD）值。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 細(xì)胞以5.0×104個(gè)/孔接種于24 孔板中，按1.2.2 分組處理。培養(yǎng)24 h 后，0.25%胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞，參照Annexin V-FITC/PI 試劑盒說明書操作步驟，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.2.5 Western blot 法 檢 測(cè)CyclinD1、Cleavedcaspase-3、p-JAK2 和p-STAT3 蛋白表達(dá) 細(xì)胞以5.0×104個(gè)/孔接種于24 孔板中，按1.2.2 分組處理。培養(yǎng)24 h 后，0.25%胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞，RIPA試劑提取細(xì)胞中總蛋白。BCA 法對(duì)測(cè)定蛋白含量，行10% SDS-PAGE 電泳。電泳后，濕轉(zhuǎn)至PVDF 膜，并于5%脫脂奶粉溶液中封閉1 h。然后分別置于CyclinD1（1∶500）、Cleaved-caspase-3（1∶1 000）、p-JAK2（1∶500）、p-STAT3（1∶500）和GAPDH（1∶1 000）一抗孵育液中，4 ℃孵育過夜。再置于山羊抗兔二抗（1∶3 000）孵育液中，37 ℃孵育1 h。最后加顯影液，避光顯影后曝光拍照。

1.2.6 RT-qPCR 檢測(cè)miR-940 表達(dá) 細(xì)胞以5.0×104個(gè)/孔接種于24 孔板中，按1.2.2 分組處理。培養(yǎng)24 h 后，0.25%胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞，用Trizol 試劑提取細(xì)胞中總RNA。將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，行PCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增程序：95 ℃3 min，95 ℃10 s，58 ℃30 s，72 ℃30 s，共35個(gè)循環(huán)。引物序列：miR-940正向5'-GTATAAAGGGCCCCCGCT-3'，反向5'-AGGGTCCGAGGTATTCGCACT-3'；U6 正 向5'-CATCACCATCAGGAGAGTCG-3'，反 向 5'-TGAC?GCTTGCCCACAGCCTT-3'。2-ΔΔCt法計(jì)算miR-940 相對(duì)于內(nèi)參U6的表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 SPSS22.0 軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以±s表示。兩組間比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；多組間比較用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用SNK-q檢驗(yàn)。以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 nazartinib 對(duì)NCI-H2170 細(xì)胞增殖的影響 與NC 組比較，不同濃度（1、2、4、8、16 nmol/L）的nazar?tinib降低了NCI-H2170細(xì)胞OD值及細(xì)胞中CyclinD1蛋白表達(dá)（P＜0.05，圖1、表1）。16 nmol/L與8 nmol/L對(duì)NCI-H2170 細(xì)胞增殖抑制率的影響無差異，說明8 nmol/L 已達(dá)到抑制率最大值，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)未設(shè)計(jì)16 nmo/L濃度。

表1 Nazartinib對(duì)NCI-H2170細(xì)胞OD值的影響（±s，n=9）Tab.1 Effects of nazartinib on OD value of NCI-H2170 cells（±s，n=9）

表1 Nazartinib對(duì)NCI-H2170細(xì)胞OD值的影響（±s，n=9）Tab.1 Effects of nazartinib on OD value of NCI-H2170 cells（±s，n=9）

Note：Compared with NC group，1）P＜0.05.

OD value 1.158±0.10 0.928±0.091）0.769±0.071）0.604±0.061）0.524±0.051）0.532±0.041）112.006 0.000 Groups NC 1 nmol/L nazartinib 2 nmol/L nazartinib 4 nmol/L nazartinib 8 nmol/L nazartinib 16 nmol/L nazartinib FP

圖1 Nazartinib對(duì)NCI-H2170細(xì)胞中CyclinD1蛋白表達(dá)的影響Fig.1 Effects of nazartinib on protein expression of CyclinD1 in NCI-H2170 cells

2.2 nazartinib 對(duì)NCI-H2170 細(xì)胞凋亡的影響 與NC 組比較，不同濃度（1、2、4、8 nmol/L）的nazartinib提高了NCI-H2170 細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞中Cleavedcaspase-3蛋白表達(dá)（P＜0.05，圖2、表2）。

表2 Nazartinib對(duì)NCI-H2170細(xì)胞凋亡率影響（±s，n=9）Tab.2 Effects of nazartinib on apoptosis rate of NCIH2170 cells（±s，n=9）

表2 Nazartinib對(duì)NCI-H2170細(xì)胞凋亡率影響（±s，n=9）Tab.2 Effects of nazartinib on apoptosis rate of NCIH2170 cells（±s，n=9）

Note：Compared with NC group，1）P＜0.05.

Apoptosis rate/%7.69±0.75 12.53±1.131）18.03±1.641）24.83±2.311）28.36±2.431）206.724 0.000 Groups NC 1 nmol/L nazartinib 2 nmol/L nazartinib 4 nmol/L nazartinib 8 nmol/L nazartinib FP

圖2 Nazartinib 對(duì)NCI-H2170 細(xì)胞凋亡及Cleavedcaspase-3蛋白表達(dá)的影響Fig.2 Effects of nazartinib on apoptosis of NCI-H2170 cells and protein expression of Cleaved-caspase-3

2.3 nazartinib 對(duì)NCI-H2170 細(xì)胞中miR-940 表達(dá)的影響 與NC 組比較，不同濃度（1、2、4、8 nmol/L）的nazartinib 提高了NCI-H2170細(xì)胞中miR-940表達(dá)（P＜0.05，圖3）。

圖3 Nazartinib對(duì)NCI-H2170細(xì)胞中miR-940表達(dá)的影響Fig.3 Effects of nazartinib on expression of miR-940 in NCI-H2170 cells

2.4 nazartinib 對(duì)NCI-H2170 細(xì) 胞 中JAK2/STAT3信號(hào)通路的影響 與NC 組比較，不同濃度（1、2、4、8 nmol/L）的nazartinib 降 低 了NCI-H2170 細(xì) 胞 中p-JAK2和p-STAT3蛋白表達(dá)（P＜0.05，圖4）。

圖4 Nazartinib 對(duì)NCI-H2170 細(xì) 胞 中p-JAK2、p-STAT3蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Effects of nazartinib on protein expressions of p-JAK2 and p-STAT3 in NCI-H2170 cells

2.5 敲 減miR-940 逆 轉(zhuǎn)nazartinib 對(duì)NCI-H2170 細(xì)胞增殖、凋亡及JAK2/STAT3 信號(hào)通路的影響 與miR-NC inhibitor 組 比 較，miR-940 inhibitor 組NCIH2170 細(xì) 胞OD 值 及 細(xì) 胞 中CyclinD1、p-JAK2 和p-STAT3 蛋 白 表 達(dá) 升 高（P＜0.05），凋 亡 率 及Cleaved-caspase-3 蛋 白 表 達(dá) 降 低（P＜0.05）。與nazartinib+miR-NC inhibitor 組比較，nazartinib+miR-940 inhibitor 組NCI-H2170 細(xì) 胞OD 值 及 細(xì) 胞 中CyclinD1、p-JAK2 和p-STAT3 蛋 白 表 達(dá) 升 高（P＜0.05），凋亡率及Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)降低（P＜0.05，圖5、表3）。

圖5 敲減miR-940 逆轉(zhuǎn)nazartinib 對(duì)NCI-H2170 細(xì)胞中CyclinD1、Cleaved-caspase-3、p-JAK2 和p-STAT3 蛋白表達(dá)的影響Fig.5 Knockdown of miR-940 reverses effect of nazar?tinib on protein expressions of CyclinD1，Cleavedcaspase-3，p-JAK2 and p-STAT3 in NCI-H2170 cells

表3 miR-940 逆 轉(zhuǎn)nazartinib 對(duì)NCI-H2170 細(xì) 胞OD 值和凋亡率的影響（±s，n=9）Tab.3 Knockdown of miR-940 reverses effect of nazar?tinib on OD value and apoptosis rate of NCIH2170 cells（±s，n=9）

表3 miR-940 逆 轉(zhuǎn)nazartinib 對(duì)NCI-H2170 細(xì) 胞OD 值和凋亡率的影響（±s，n=9）Tab.3 Knockdown of miR-940 reverses effect of nazar?tinib on OD value and apoptosis rate of NCIH2170 cells（±s，n=9）

Nore：Compared with miR-NC inhibitor group，1）P＜0.05；compared with nazartinib+miR-NC inhibitor group，2）P＜0.05.

Apoptosis rate/%7.72±0.71 2.46±0.141）27.39±2.111）10.06±0.912）723.468 0.000 Groups miR-NC inhibitor anti-miR-940 nazartinib+miR-NC inhibitor nazartinib+miR-940 inhibitor FP OD value 1.143±0.11 1.432±0.121）0.540±0.051）1.024±0.092）134.044 0.000

3 討論

作為一種新型的EGFR 酪氨酸激酶小分子抑制劑，nazartinib 對(duì)突變型EGFR 具有選擇性抑制作用，且在體內(nèi)耐受性良好，并具有良好的安全性［6］。目前，nazartinib 對(duì)腫瘤細(xì)胞惡性行為影響的相關(guān)研究還比較少見。本研究顯示，不同濃度（1、2、4、8 nmol/L）的nazartinib 可降低肺癌細(xì)胞NCI-H2170 的OD 值，而提高其凋亡率，說明nazartinib 抑制了肺癌細(xì)胞增殖，且促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

細(xì)胞增殖紊亂和凋亡受阻是腫瘤的重要發(fā)病機(jī)制，抑制腫瘤細(xì)胞增殖且誘導(dǎo)其凋亡是腫瘤治療的重要途徑。CyclinD1 是細(xì)胞周期調(diào)控分子，其可促進(jìn)細(xì)胞快速通過G1 期，加速G1 期/S 期轉(zhuǎn)變進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞增殖［7］。Caspase 家族是一類天冬氨酸依賴的半胱氨酸蛋白水解酶，該級(jí)聯(lián)反應(yīng)是細(xì)胞凋亡過程的中心環(huán)節(jié)。Caspase-3 是caspase 級(jí)聯(lián)反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)控分子，其受到上游凋亡信號(hào)刺激后被激活，切割下游多種分子，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［8］。本研究顯示，nazartinib可降低NCI-H2170細(xì)胞中CyclinD1蛋白的表達(dá)，而促進(jìn)Cleaved-caspase-3 蛋白表達(dá)，進(jìn)一步說明nazartinib 可抑制肺癌細(xì)胞增殖，且加劇細(xì)胞凋亡。

miRNA 是一類廣泛存在于真核生物中約為18～25 個(gè)核苷酸的小分子非編碼RNA，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程。miR-940 是miRNA 家族成員之一，其在乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌等腫瘤中表達(dá)上調(diào)，發(fā)揮促癌基因作用；而miR-940在食管鱗狀細(xì)胞癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、非小細(xì)胞肺癌、舌鱗癌和神經(jīng)膠質(zhì)瘤等腫瘤中表達(dá)下調(diào)，上調(diào)其表達(dá)可抑制腫瘤發(fā)展進(jìn)程［9-15］。本研究顯示敲減miR-940 促進(jìn)了肺癌細(xì)胞NCI-H2170 增殖，且抑制了其凋亡，與JIANG 等［13］報(bào)道過表達(dá)miR-940 可抑制肺癌細(xì)胞A549 和H226 遷移和侵襲的結(jié)果一致，提示miR-940 可作為肺癌治療的潛在分子靶點(diǎn)。本研究還顯示nazartinib 可促進(jìn)NCI-H2170 細(xì)胞中miR-940 的表達(dá)，而敲減miR-940 降低了nazartinib 對(duì)NCI-H2170 細(xì)胞增殖和凋亡的影響，提示nazartinib 可能通過上調(diào)miR-940 表達(dá)來影響NCI-H2170細(xì)胞增殖和凋亡。

JAK2/STAT3是JAK/STAT通路中的一個(gè)重要信號(hào)通路，參與調(diào)控細(xì)胞的增殖和凋亡，與肺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［16］。STAT3 是STATs 家族成員之一，在多種腫瘤中異?；罨洚惓；罨瘜?dǎo)致細(xì)胞異常增殖分化，且凋亡受到抑制，是目前已被確認(rèn)的癌基因［17］。STAT3 的致癌機(jī)制主要與其激活CyclinD1、Survivin等靶基因的產(chǎn)物表達(dá)有關(guān)。JAK2是STAT3 的上游分子，其特異性抑制劑AG490 可阻斷JAK2/STAT3 信號(hào)通路，從而抑制細(xì)胞增殖［18］。研究顯示，miR-19a 的下調(diào)可以抑制骨肉瘤SaOS-2細(xì)胞中的JAK2/STAT3 信號(hào)傳導(dǎo)途徑，促進(jìn)Cleavedcaspase-3 和Bax 凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，并增加細(xì)胞中的活性氧水平，從而促進(jìn)SaOS-2 細(xì)胞凋亡并抑制其增殖［19］。本研究顯示nazartinib 抑制了肺癌細(xì)胞NCI-H2170 中p-JAK2 和p-STAT3 蛋白的表達(dá)，提示nazartinib 抑制了NCI-H2170 細(xì)胞中JAK2/STAT3 信號(hào)通路的激活；而敲減miR-940 則激活了NCIH2170細(xì)胞中JAK2/STAT3信號(hào)傳導(dǎo)途徑，進(jìn)一步提示nazartinib 可能通過靶向上調(diào)miR-940 進(jìn)而抑制JAK2/STAT3 信號(hào)傳導(dǎo)途徑來抑制NCI-H2170 細(xì)胞增殖及促進(jìn)其凋亡。

綜上，酪氨酸激酶小分子抑制劑nazartinib 可有效抑制肺癌細(xì)胞增殖，且促進(jìn)細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制與靶向上調(diào)miR-940 表達(dá)并抑制JAK2/STAT3 信號(hào)傳導(dǎo)途徑有關(guān)。