汪麗芬，俞紅燕，樓 毅，張亞蘭，顧江萍

（杭州動(dòng)物園，浙江杭州 310008）

腸道菌群是生存在機(jī)體腸道中的微生物群，種類繁多，數(shù)量龐大，能不斷進(jìn)行自我調(diào)整并能使菌群保持動(dòng)態(tài)平衡，與機(jī)體生理活動(dòng)、健康狀況密切相關(guān)。國(guó)內(nèi)有用高通量測(cè)序法對(duì)川金絲猴、大熊貓腸道菌群的研究[1～2]。黑猩猩與人同屬人科，是現(xiàn)存與人類血緣最近的高級(jí)靈長(zhǎng)類動(dòng)物，尚未有對(duì)黑猩猩腸道菌群的季節(jié)性變化研究。本試驗(yàn)以杭州動(dòng)物園6只健康成年黑猩猩為研究對(duì)象，采集一年四季24個(gè)糞樣，通過(guò)Illumina MiSeq平臺(tái)對(duì)糞便細(xì)菌16S rDNA的V3～V4區(qū)進(jìn)行測(cè)序，對(duì)黑猩猩腸道菌群的季節(jié)性變化進(jìn)行分析，希望能了解黑猩猩腸道菌群的季節(jié)性情況，為一年四季中動(dòng)物的腸道健康狀況提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

浙江省杭州動(dòng)物園（E120°12′，N30°16′）的6只黑猩猩，編號(hào)分別為1～6：明明（♀，1998.3）、老大（♀，2006.3）、老三（♂，2009.8）、老四（♀，2009.9）、老五（♂，2010.9）、老六（♀，2010.1），身體健康狀況良好。分別于春天（Spr）、夏天（Sum）、秋天（Fal）、冬天（Win）收集4組24個(gè)糞樣。

1.2 樣品處理

糞樣采集前一天晚上需將采樣的黑猩猩單籠飼養(yǎng)，于早上08:00取樣，挑選較新鮮的糞便，選取糞便中間未被污染的部分于已消毒的采樣管中，立即于-40℃冰箱保存。所有糞樣在干冰冷藏條件下寄送到上海派森諾生物科技股份有限公司。

1.3 生物信息學(xué)數(shù)據(jù)分析

委托上海派森諾生物科技股份有限公司對(duì)樣品進(jìn)行前處理、Illumina Miseq高通量測(cè)序及數(shù)據(jù)分析，測(cè)序片段為16S rDNA V3～V4可變區(qū)。主要利用FLASH軟件[3]（v1.2.7，http://ccb.jhu.edu/software/FLASH/）、QIIME軟 件[4]（Quantitative Insights Into Microbial Ecology，v1.8.0，http://qiime.org/）對(duì)測(cè)序序列進(jìn)行處理、統(tǒng)計(jì)，并對(duì)稀疏曲線、OTU、Alpha多樣性、組間分類學(xué)差異和聚類情況進(jìn)行分析。多樣性指數(shù)采用SPSS進(jìn)行單因素方差分析，數(shù)據(jù)用（±s）表示。P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 4個(gè)季節(jié)黑猩猩樣本腸道菌群的OTU分析

4個(gè)季節(jié)黑猩猩樣本腸道菌群共有OTU 1593，春天組占35%，夏天組占35%，秋天組占40%，冬天組占38%（見(jiàn)圖1）。

2.2 4個(gè)季節(jié)黑猩猩樣本腸道菌群Alpha多樣性分析

4個(gè)季節(jié)黑猩猩樣本腸道菌群多樣性指數(shù)（Chao1、Ace、 Simpson、Shannon）見(jiàn)表1，各組間無(wú)顯著差異。

表1 4個(gè)季節(jié)黑猩猩樣本腸道菌群多樣性指數(shù)表

2.3 4個(gè)季節(jié)黑猩猩樣本腸道菌群組間分類學(xué)差異分析

季節(jié)組間存在顯著差異的菌門為厚壁菌門、變形菌門。夏天組厚壁菌門豐度顯著高于其它3組。變形菌門冬天組豐度最高，顯著高于夏天組。夏天組WPS-2門顯著低于秋天組、冬天組（見(jiàn)圖2）。

組間存在顯著差異的菌門：春天組中，布雷德菌屬顯著高于冬季組，鏈型桿菌屬和脫鹽桿菌屬顯著高于秋天組；夏天組中，貪銅菌屬顯著高于其它3個(gè)季節(jié)，RFN20菌屬顯著高于春天組；秋天組中，普雷沃氏菌屬顯著高于夏天組，布勞特菌屬和多爾氏菌屬顯著高于冬天組、多爾氏菌屬顯著高于夏天、冬天組；冬天組中，厭氧弧菌屬顯著高于春、夏天組，擬桿菌屬和琥珀酸弧菌屬顯著高于夏天、秋天組，脫硫弧菌屬顯著高于春天組，小類桿菌屬和毛形桿菌屬顯著高于夏天組，Sphaerochaeta菌屬顯著高于其它各組（見(jiàn)圖3）。

2.4 4個(gè)季節(jié)黑猩猩樣本腸道菌群的聚類分析

Win1和Fal1相似度最高，其次為Spr6和Sum6，表現(xiàn)出個(gè)體的特異性。除1、6號(hào)樣本各季節(jié)大部分樣品聚在一起，表明各季節(jié)樣本間有一定的相似性，季節(jié)可能會(huì)對(duì)黑猩猩的腸道菌群產(chǎn)生影響（見(jiàn)圖4）。

3 分析與討論

4個(gè)季節(jié)黑猩猩樣本腸道菌群中3種菌門、18種菌屬有顯著差異，春天組多樣性指數(shù)最高，各樣本菌群聚類分析中除1、6號(hào)樣本各組樣品相似性較高，季節(jié)可能會(huì)對(duì)黑猩猩的腸道菌群產(chǎn)生影響。大熊貓腸道菌群多樣性組成的主成份分析顯示環(huán)境溫度是影響著大熊貓腸道菌群的兩大因子之一[5]。

貪銅菌屬夏天組豐度顯著高于其它3個(gè)季節(jié)，Sphaerochaeta菌屬冬天組豐度顯著高于其它各組，糞桿菌屬夏天組豐度顯著低于其它3個(gè)季節(jié)，這3種菌可能與溫度相關(guān)。金毛扭角羚春季和冬季腸道菌群有5個(gè)菌屬存在差異，與本試驗(yàn)菌屬均不同[6]。Sphaerochaeta是一種化能異養(yǎng)厭氧茵、革蘭氏陰性菌，發(fā)酵糖類、有機(jī)酸產(chǎn)生乙酸、甲酸、甲醇[7]。該細(xì)菌利用乳酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)將環(huán)境中的乳酸攝入體內(nèi)，轉(zhuǎn)化為-D-葡萄糖，進(jìn)入糖酵解過(guò)程，最終生成乙酸、H2和C02[8]。但由于黑猩猩樣本量的限制，特別是不能排除性別的影響，因而試驗(yàn)結(jié)果還需驗(yàn)證與完善。