張 珊 鞏衛(wèi)康 張 娜 李春華

（北京工業(yè)大學(xué)環(huán)境與生命學(xué)部，北京 100124）

人 分 泌 型 磷 脂 酶 A2-ⅠⅠA （secretory phospholipase A2group ⅠⅠA，sPLA2-ⅠⅠA）是一種脂解酶，在細胞脂代謝和信號傳導(dǎo)中起重要作用［1］。sPLA2-ⅠⅠA 通過催化甘油磷脂sn-2 位酯鍵水解，產(chǎn)生眾多信號介質(zhì)前體，參與許多炎癥性疾病的發(fā)生，如哮喘、關(guān)節(jié)炎和癌癥等［2］。研究sPLA2-ⅠⅠA的結(jié)構(gòu)動力學(xué)和功能之間的關(guān)系可更好地理解其相關(guān)疾病的分子機制。

到目前為止，有16 種亞型的sPLA2從蛇、人、豬以及植物等生物中純化出來。它們的結(jié)構(gòu)具有6對以上二硫鍵和保守的催化二聯(lián)體His/Asp 及鈣結(jié)合 環(huán)（Xxx-Cys-Gly-Xxx-Gly-Gly）。 大 部 分 的sPLA2具有相似的折疊結(jié)構(gòu)：3個α螺旋（α-helix）、2 個β 折疊（β-sheet）和1 個保守的Ca2+結(jié)合環(huán)（loop2）（圖1）。在哺乳動物中研究最多的sPLA2是人ⅠⅠA型的sPLA2（sPLA2-ⅠⅠA），該型酶含有7對二硫鍵，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，還具有防御細菌感染和殺菌的能力［3］。sPLA2-ⅠⅠA 催化循環(huán)包括4 個步驟：a. 酶通過底物結(jié)合區(qū)與膜結(jié)合；b.從膜上提取單個磷脂分子到酶的結(jié)合口袋；c.水解磷脂的sn-2 位酯鍵；d. 釋放水解產(chǎn)物［4］。酶與底物結(jié)合是催化循環(huán)中重要的環(huán)節(jié)，其中膜作為變構(gòu)劑，它的結(jié)合使酶從關(guān)閉構(gòu)象轉(zhuǎn)變?yōu)榇蜷_構(gòu)象，促進酶結(jié)合磷脂分子而發(fā)生催化反應(yīng)［4］。因此，sPLA2-ⅠⅠA 的結(jié)構(gòu)動力學(xué)以及別構(gòu)過程一直是人們研究的熱點。

Fig.1 Structure of sPLA2(PDB ID:3u8b)

2015 年Mouchlis 等［4］應(yīng) 用 分 子 動 力 學(xué)（molecular dynamics，MD）模擬方法研究了不同類型sPLA2酶結(jié)合口袋的功能差異，并對其催化循環(huán)提出了新的見解。2020年Manukyan［5］用MD模擬方法研究了人類sPLA2在有無膜環(huán)境下的構(gòu)象變化。眾所周知，MD模擬可以在原子水平探測生物分子的動力學(xué)性質(zhì)，但是它非常耗時，很難對蛋白質(zhì)大尺度的功能性運動進行采樣分析。針對該問題，研究人員提出了一些粗?；哪Ｐ停渲袕椥跃W(wǎng)絡(luò)模型（elastic network model，ENM）是研究蛋白質(zhì)功能性運動最為有效的方法之一。兩種常用的ENM是高斯網(wǎng)絡(luò)模型（Gaussian network model，GNM）［6］和 各 向 異 性 網(wǎng) 絡(luò) 模 型（anisotropic network model，ANM）［7］。結(jié) 合ENM，Atilgan等［8］提出了微擾響應(yīng)掃描（perturbation-response scanning，PRS）方法來評價蛋白質(zhì)殘基對外界微擾的響應(yīng)程度，該方法已被廣泛應(yīng)用于識別蛋白質(zhì)變構(gòu)調(diào)控中潛在的別構(gòu)位點［9］。另外，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)網(wǎng)絡(luò)（protein structure network，PSN）方法也被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)折疊和關(guān)鍵位點預(yù)測的研究。

本研究使用基于結(jié)構(gòu)的模型和方法，包括ENM、PRS和PSN分析了人sPLA2-ⅠⅠA型結(jié)構(gòu)的共享和特異性和動力學(xué)與其功能的關(guān)系，并識別了關(guān)鍵殘基，加深了對酶催化機制的理解。

1 研究方法

1.1 數(shù)據(jù)集的建立

從Protein Data Bank（PDB）數(shù)據(jù)庫中下載來自人分泌型磷脂酶（sPLA2）ⅠⅠA 型的31 個X 射線（X-ray）衍射晶體結(jié)構(gòu)作為研究對象，其PDB ⅠD分別為：1ayp-A，1ayp-B，1ayp-C，1ayp-D， 1ayp-E，1ayp-F，1db4-A，1db5-A，1dcy-A，1j1a-A，1j1a-B，1kqu-A，1kvo-A，1kvo-B，1kvo-C，1kvo-D，1kvo-E，1kvo-F，1n28-A，1n28-B，1n29-A，1pod-A，1poe-A，1poe-B，3u8b-A，3u8d-A，3u8d-B，3u8h-A，3u8h-B，5g3n-A，5g3n-B。

1.2 彈性網(wǎng)絡(luò)模型

彈性網(wǎng)絡(luò)模型（ENM）將蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)簡化為粗?；膹椥跃W(wǎng)絡(luò)，每個殘基簡化為網(wǎng)絡(luò)中的一個節(jié)點，用Cα原子表示；如果兩個Cα原子間的距離小于某一截斷半徑，則認(rèn)為它們之間存在相互作用，用倔強系數(shù)相同的彈簧相連。本工作選取7.0 ?為截斷半徑。這樣，該彈性網(wǎng)絡(luò)的總勢能為：

其中，γ是彈簧的彈性系數(shù)，ΔR（3N維的列向量）代表N個Cα原子偏離平衡位置的位移，E是單位矩陣，?為矩陣的直積，Γ為N×N階的Kirchhoff 矩陣，其元素為：

其中，Rij是第i個和第j個Cα原子之間的距離，rc為截斷半徑。每個殘基的均方漲落以及不同殘基間漲落的交叉相關(guān)性分別表示為：

其中kB為Boltzmann常數(shù)，T為絕對溫度。

GNM 模型可以提供殘基運動的幅度，但不包括方向信息，而ANM 模型可以提供該信息。在ANM 中，選取14.0 ? 為截斷半徑，網(wǎng)絡(luò)的總勢能為：

其中，Rij和Rij0分別為節(jié)點i和j之間的瞬時距離以及處于平衡位置時的距離。蛋白質(zhì)的運動模式由一個Hessian 矩陣H決定，它的元素是大小為3×3 的子矩陣。子矩陣的元素hij為體系勢能函數(shù)（5）對位置的二階偏導(dǎo)數(shù)，當(dāng)i≠j時，hij為：

當(dāng)i=j時，hij為：

在ANM中，殘基的均方漲落以及殘基間漲落的交叉相關(guān)性為：

歸一化的交叉相關(guān)性為：

交叉相關(guān)性的取值范圍為-1到1，正值表示殘基的運動方向相同，負值表示它們的運動方向相反。該值的絕對值越大表示兩個殘基間的運動相關(guān)性越強。

1.3 微擾響應(yīng)掃描模型

微擾響應(yīng)掃描（PRS）［8］是基于線性響應(yīng)理論（linear response theory，LRT）［10］發(fā) 展 的 模 型。PRS可以計算擾動某個殘基時所有殘基的響應(yīng)，從而來推斷蛋白質(zhì)的變構(gòu)特性。由胡克定律F=HΔR，可以計算在受到外力擾動時所有殘基位置 的 改 變 量ΔR，其 中H是ANM 中3N×3N的Hessian 矩陣（截斷半徑仍為14.0 ?）。在PRS 中，每次對網(wǎng)絡(luò)中的一個節(jié)點施加外力，觀測其他所有殘基的響應(yīng)。以對殘基i施加外力為例：

得到的響應(yīng)為：

其中，ΔRi是在外力對殘基i擾動后所有殘基位置的改變量。對于力的方向，有研究表明外力的方向?qū)τ诮Y(jié)構(gòu)的擾動不是非常重要［8］，因此在本文中，施加在i殘基3個方向上的力為（1,1,1）。

依次擾動所有殘基可以得到一個N×N階的響應(yīng)矩陣P，其第j列代表擾動殘基j其他殘基的響應(yīng)。將P矩陣進行歸一化后，每一列的平均值代表了該列對應(yīng)殘基的敏感性，如第j列的平均值即為殘基j的敏感性，所有殘基的敏感性就組成了殘基敏感性特征曲線。該曲線峰值對應(yīng)的殘基被認(rèn)為是敏感殘基，在蛋白質(zhì)變構(gòu)中起關(guān)鍵作用［11］。

1.4 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)網(wǎng)絡(luò)方法

蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的形成和功能的發(fā)揮在一定程度上依賴于殘基間復(fù)雜的相互作用網(wǎng)絡(luò)。在傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)網(wǎng)絡(luò)（PSN）方法中，蛋白質(zhì)被簡化成一個無權(quán)的圖，圖中的節(jié)點是殘基，邊是殘基間的相互作用。這里，當(dāng)殘基間的距離小于截斷半徑8.0 ?時，認(rèn)為它們有相互作用。這樣，蛋白質(zhì)的PSN可以用鄰接矩陣來描述，其元素為：

其 中rij表 示 節(jié) 點i和j之 間 的 距 離。H（x） 是Heaviside 函數(shù)，當(dāng)x＞0 時，H（x）=1，當(dāng)x≤0 時，H（x）=0。節(jié)點i的度（degree）是與該節(jié)點連接的其他節(jié)點數(shù)量。

2 結(jié)果與討論

2.1 高斯網(wǎng)絡(luò)模型的慢運動模式分析

在ENM 中，蛋白質(zhì)的低頻運動模式提供了分子大幅度的集合運動信息，與功能運動有關(guān)。為了解sPLA2的功能性動力學(xué)特征，本文對人sPLA2-ⅠⅠA型31 個結(jié)構(gòu)分別構(gòu)建了GNM 模型，計算了前12個最慢運動模式（對漲落的貢獻大于50%）的均方漲落，以及其平均值和標(biāo)準(zhǔn)差（圖2a）。

圖2a 中的殘基漲落與前人MD 模擬［5］得到的漲落曲線相似，說明GNM是獲得蛋白質(zhì)柔性的有效方法。從圖2a 發(fā)現(xiàn)處于漲落極小值的殘基，包括Cys26、Cys28、Cys43、Cys44、His47、Asp48、Cys49、 Tyr51、 Tyr66、 Cys77、 Cys83、 Cys90、Asp91、Cys97 和Cys117，也具有較小的標(biāo)準(zhǔn)差，說明它們在不同的結(jié)構(gòu)中都具有低運動性，是這些結(jié)構(gòu)的動力學(xué)共同特征。其中，His47、Asp48、Tyr51和Asp91構(gòu)成了催化網(wǎng)絡(luò)（圖2b），其通過與水分子發(fā)生相互作用穩(wěn)定了催化反應(yīng)所必需的氧離子中間體［12］。保守的催化二聯(lián)體His47-Asp91占據(jù)漲落的極小值，這符合催化殘基精確定位的要求［13］。另外，上述10個高度保守的半胱氨酸也處于極小值處，參與了二硫鍵的形成，起到了維持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的作用。殘基Tyr66 也高保守，有低運動性，參與了與68 位Tyr/Phe/Trp 的芳香環(huán)堆疊相互作用，起到了穩(wěn)定酶結(jié)構(gòu)的作用［14］。

Fig.2 Residue fluctuations obtained by GNM for sPLA2 family member structures

sPLA2的C 端是loop 區(qū)，這可能是其具有較大漲落的原因。目前尚未發(fā)現(xiàn)它有重要的生物學(xué)功能，因此在分析漲落峰值的區(qū)域時沒有考慮C 端。將漲落中峰值的區(qū)域標(biāo)記為1～5（圖2a），并將其展示在結(jié)構(gòu)（PDB ⅠD：3u8b）中（圖2b）。區(qū)域1（Gly29～Ser35）屬于Ca2+結(jié)合環(huán)，主要負責(zé)Ca2+的結(jié)合。鈣離子通過與區(qū)域1中殘基的氧原子、催化殘基Asp48以及水分子的相互作用，得以穩(wěn)定在催化位點附近，為實現(xiàn)催化功能提供條件［5］。區(qū)域2（Gly58～Phe63）、區(qū)域4（Lys102～Tyr109）和區(qū)域5（Ser113～Lys115）主要參與了酶與膜的相互作 用， 特 別 是 殘 基Thr61、 Phe63、 Lys102、Lys107、Asn114 和Lys115 通過疏水或靜電相互作用與膜結(jié)合，其突變會影響酶的活性［15］。區(qū)域3（Ser71～Arg74）屬于連接兩個β 折疊的loop4，其功能還不是很明確。以前的MD模擬工作也顯示此區(qū)域的柔性較大，并且在有無膜的環(huán)境下，其殘基漲落的差異較為明顯［5］，因此推測該區(qū)域可能參與了膜的識別。另外，這些區(qū)域的漲落標(biāo)準(zhǔn)差較大，這是由于不同的結(jié)構(gòu)結(jié)合的配體有所不同導(dǎo)致的，體現(xiàn)了結(jié)構(gòu)對配體識別的特異性，這也說明了這些區(qū)域?qū)Σ煌潴w結(jié)合的調(diào)控。

總之，從GNM 對慢運動模式分析的結(jié)果可發(fā)現(xiàn)，處于漲落極小值處的殘基是對結(jié)構(gòu)穩(wěn)定或催化功能至關(guān)重要的殘基，這些殘基的低漲落是該酶成員共享的動力學(xué)特征，而位于漲落峰值處的殘基可能與底物的結(jié)合有關(guān)，不同的結(jié)構(gòu)間存在顯著差異。

2.2 運動相關(guān)性分析

為了理解蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中殘基運動的關(guān)聯(lián)性，通過式（10）用ANM 模型計算了所有殘基漲落間的交叉相關(guān)系數(shù)的平均（圖3）。由于慢運動模式對應(yīng)著功能性運動，所以本文選取前21 個慢運動模式進行計算（對漲落的貢獻大于50%）。

Fig.3 Average residue cross-correlations for human 31 sPLA2-IIA members

從 圖3 可 見，殘 基Thr104～Asn114 （位 于helix5和loop6上）與殘基Asn1～Thr13（位于helix1上）呈較強負相關(guān)，而與殘基Tyr21～His27（位于loop2 上）呈正相關(guān)。這些殘基在催化位點周圍，這種強相關(guān)運動有助于酶催化殘基的暴露及催化反應(yīng)的發(fā)生。此外，殘基Ala39～Arg53 和殘基Cys88～Asn100 之間存在較強的同向運動，它們分別位于承擔(dān)催化作用的helix3 和helix4 上，其中His47、Asp48、Tyr51 和Asp91 構(gòu)成了催化網(wǎng)絡(luò)。這些殘基的同向運動保證了催化功能的穩(wěn)定發(fā)揮。另外還發(fā)現(xiàn)，殘基Asn1～Thr13 （helix1）、殘基Ala39～Arg53 （helix3） 和 殘 基 Cys88～Asn100（helix4）呈現(xiàn)同向運動。helix1 和4 的同向運動部分是由于形成了疏水三聯(lián)體（Phe5-Ala94-Phe98）而形成的。該三聯(lián)體在空間上彼此接近，參與了高度保守的底物結(jié)合疏水通道的形成，促進了磷脂與催化位點的結(jié)合［16］?？傊?，酶在催化位點周圍的強相關(guān)運動有助于酶與膜和磷脂的結(jié)合，促進催化反應(yīng)的發(fā)生。

2.3 微擾響應(yīng)掃描（PRS）分析

PRS 方法將ENM 與LRT 相結(jié)合，用來評估在蛋白質(zhì)上施加微擾對其構(gòu)象的影響。計算了31 個結(jié)構(gòu)的平均PRS熱圖（圖4a），及其各列元素平均后得到的殘基敏感性曲線（圖4c）。發(fā)現(xiàn)敏感性較高的殘基恰好對應(yīng)于從GNM慢運動模式分析識別到的5個區(qū)域。區(qū)域1負責(zé)Ca2+結(jié)合，敏感性較高，這是酶實現(xiàn)催化功能的要求。區(qū)域2、4和5均參與了酶與膜的相互作用，膜作為變構(gòu)劑調(diào)控酶的構(gòu)象。也就是說，這些區(qū)域在酶的變構(gòu)中起到了重要作用?？傊琍RS是識別蛋白質(zhì)變構(gòu)過程中起關(guān)鍵作用殘基的有效方法。

Fig.4 Evaluation of the role of sPLA2 residues sensitivity and variation among family members

除此之外，關(guān)注到一些具有較低敏感性的殘基Phe5、Met8（位于helix1 上）、Asp41（位于helix3上）、Ⅰle75 （位于β 折疊上）、Cys88、Lys92、Ala95、Phe98（位于helix4 上），它們包埋在結(jié)構(gòu)中（圖4b）。有意思的是，這些低敏感殘基幾乎占據(jù)了快運動模式下（最快的3 個121～124）漲落極大值的位置（圖4c）。GNM 的快運動模式反映了蛋白質(zhì)局部結(jié)構(gòu)的幾何不規(guī)則性，在蛋白質(zhì)折疊中，相較于慢運動模式下漲落，快運動模式下的漲落伴隨著更大的熵減［17］。同以往的研究結(jié)果一致，本研究發(fā)現(xiàn)快運動模式下活躍的殘基往往處于蛋白質(zhì)折疊核區(qū)域，并且這些殘基對結(jié)構(gòu)穩(wěn)定起重要作用［17-18］。同時也發(fā)現(xiàn)它們在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)網(wǎng)絡(luò)中具有高的平均度值（圖4d）。殘基度值（degree）反映了殘基在局部網(wǎng)絡(luò)中的連通性，也反映了殘基對結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的作用［19］。因此，這些殘基在結(jié)構(gòu)上的緊密堆積（高的連通性）以及在快運動模式下的高活動性表明它們在穩(wěn)定結(jié)構(gòu)方面具有重要作用。

3 結(jié) 論

本工作探索了人sPLA2中ⅠⅠA 型結(jié)構(gòu)動力學(xué)和變構(gòu)特性，探索了其動力學(xué)共性和特異性與功能的關(guān)系。根據(jù)GNM分析，發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)中動力學(xué)高度受限的殘基，即催化殘基和半胱氨酸殘基，與酶的共有功能有關(guān)，它們分別對酶的催化和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定至關(guān)重要，在不同成員之間共享。另外，識別到柔性較大的5個區(qū)域，它們參與了保證酶催化活性的鈣離子的結(jié)合，以及與別構(gòu)劑膜的結(jié)合。這些區(qū)域的漲落在不同成員中差異較為顯著，體現(xiàn)出了成員的特異性。ANM 分析結(jié)果暗示了酶催化位點周圍的強相關(guān)運動，這有利于配體的結(jié)合及酶催化功能的實現(xiàn)。最后PRS 方法對酶變構(gòu)特性的分析表明，對擾動高度敏感的殘基對應(yīng)上述柔性較大的5 個區(qū)域，說明這些殘基作為傳感器在變構(gòu)通信中發(fā)揮重要作用，而低敏感性殘基在快運動模式下較為活躍，對酶的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定有大的貢獻。本工作有助于深入理解sPLA2酶共有和特異性功能背后動力學(xué)的機制，對同系物設(shè)計和藥物設(shè)計有一定的指導(dǎo)意義。