劉 里，石 柔

（曲靖師范學(xué)院 化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，云南 曲靖 655011）

0 引 言

輔酶A (CoA)是20 世紀(jì)50 年代初由德國(guó)人Lipmann 和他的同事們發(fā)現(xiàn)的。CoA 是廣泛存在于動(dòng)植物體中的天然輔酶，這種小分子(分子量通?！? 000)以化學(xué)方式參與酶催化反應(yīng)。

CoA 基本結(jié)構(gòu)是由半胱氨酸、泛酸、三磷酸腺苷3 部分組成的。首次從大量豬肝提取物中分離出來(lái)的CoA 用于磺胺乙?；?。CoA 是一種在許多酶催化反應(yīng)中幫助活化和轉(zhuǎn)移?；妮o因子。由于CoA 上的巰基(-SH)與含有?；氖荏w結(jié)合形成硫酯，所以可促進(jìn)細(xì)胞體內(nèi)100 多種化學(xué)反應(yīng)。-SH是賦予其獨(dú)特的化學(xué)/酶學(xué)性質(zhì)的功能位點(diǎn)，它與能量供給、酰基轉(zhuǎn)移、免疫激活，以及許多生物醫(yī)學(xué)反應(yīng)息息相關(guān)。

所有細(xì)胞中都能合成的CoA 參與細(xì)胞內(nèi)的許多生化反應(yīng)，包括氨基酸、碳水化合物和脂類的代謝、肝糖原的儲(chǔ)存、乙酰膽堿的合成，以及三羧酸循環(huán)。

輔酶A 的濃度能反映出一些常見(jiàn)疾病的病理過(guò)程，如糖尿病、癌癥和心肌肥大等。由此可見(jiàn)，在生物基質(zhì)中準(zhǔn)確識(shí)別和檢測(cè)輔酶A 濃度的分析方法十分重要。但國(guó)內(nèi)外對(duì)其檢測(cè)技術(shù)方面的研究進(jìn)展至今還未見(jiàn)報(bào)道。本文綜述了32 年的研究進(jìn)展，為后續(xù)輔酶A 的檢測(cè)提供一些參考價(jià)值。

1 測(cè)定方法

由于輔酶A 在生物體內(nèi)的重要性，需一種靈敏、可靠、快速的分析方法檢測(cè)其含量。本文從1988 年開(kāi)始綜述測(cè)定輔酶A 的各種技術(shù)、檢測(cè)原理以及各種參數(shù)。

已報(bào)道的測(cè)定方法有電化學(xué)法、熒光分光光度法、酶反應(yīng)法、色譜法、毛細(xì)管電泳、液質(zhì)聯(lián)用儀(LC-MS/MS)和比值比色法。

1.1 電化學(xué)法

潛在的低成本和便攜性的電分析設(shè)備是檢測(cè)分析的一個(gè)極具吸引力的選擇。由于電極表面易受其它物質(zhì)的污染，從而降低了電極的靈敏度和準(zhǔn)確度，限制了裸電極的應(yīng)用。相比之下，基于各種修飾電極的電化學(xué)技術(shù)，因其固有的簡(jiǎn)單性、高靈敏度和選擇性而受到青睞。

電化學(xué)發(fā)光(ECL)技術(shù)由于其高靈敏度和儀器簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于許多領(lǐng)域。半導(dǎo)體量子點(diǎn)(QDs)，也被稱為納米晶體(NCs)，由于其獨(dú)特的尺寸依賴性，引起了人們極大的興趣。量子點(diǎn)具有尺寸可控、量子產(chǎn)率高、抗降解穩(wěn)定性好等優(yōu)良性能，量子點(diǎn)已被用于太陽(yáng)能電池、藥物載體、細(xì)胞成像和生化傳感器。

在過(guò)去的幾年里，量子點(diǎn)作為新型ECL 發(fā)射器和ECL 傳感器得到了廣泛的發(fā)展。

1.1.1 研究實(shí)例一

2015 年，Yufang Hu 等人報(bào)道利用核酸模擬配位聚合物優(yōu)良的電催化活性檢測(cè)輔酶A 和組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶的活性。

該研究小組首先以CoA 為有機(jī)配體，采用簡(jiǎn)單的原位合成策略制備了一種新型的仿核酸輔酶A-銀離子[CoA-Ag(I)]配位聚合物(CP)，發(fā)現(xiàn)其對(duì)還原H2O2具有獨(dú)特的電催化活性。在此基礎(chǔ)上，研制了一種新型的無(wú)標(biāo)簽電化學(xué)傳感器，用于檢測(cè)CoA 和組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(HAT)的活性。

Yufang Hu 等人使用這種獨(dú)特的CoA-Ag(I) CP作為電化學(xué)信號(hào)探針，高靈敏度和高選擇性檢測(cè)輔酶A 的檢測(cè)機(jī)制分為以下3 步：

（1） 由于CoA 分子的兩端分別是游離的硫醇基團(tuán)和腺嘌呤，CoA 可與Ag(I)形成配位聚合物重復(fù)單位[(-CoA-Ag(I)-)]，并與沿著主鏈作為側(cè)基的多個(gè)腺嘌呤堿基形成鏈狀結(jié)構(gòu)。因此，如果將CoA-Ag(I)CP 與核酸相比，它們都具有多個(gè)堿基側(cè)基，但CoA-Ag(I)CP 用硫醇-Ag(I)CP 主干取代原來(lái)的戊糖/磷酸核酸主干。因此，在某種程度上，CoA-Ag(I) CP 在結(jié)構(gòu)上與聚A 單鏈核酸(ssNA)相似，所以，命名為模擬核酸CP。

（2） 受ssNA 與氧化石墨烯(GO)等二維碳納米材料強(qiáng)選擇性相互作用的啟發(fā)，發(fā)現(xiàn)CoA-Ag(I)CP與ssNA 類似，也可以通過(guò)側(cè)鏈的腺嘌呤通過(guò)π-π堆積作用輕松并有效地與GO 結(jié)合。

（3） 實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明了GO 修飾電極吸附的CoA-Ag(I)CP 對(duì)H2O2的還原具有較高的電催化活性。電流與CoA 的濃度呈良好的線性關(guān)系，線性范圍為0.1~100 μM，檢出限為0.05 μM(S/N=3)。實(shí)際樣為添加了CoA 的人血清，加標(biāo)回收為96.7%~108.5%。

1.1.2 研究實(shí)例二

2018 年，Zhao 等人發(fā)現(xiàn)了一種超靈敏測(cè)定輔酶A 的光電化學(xué)方法。輔酶A 作為電子供體加入到納米CdSe/ZnO 光電極的光電化學(xué)反應(yīng)中，建立了一種新的光電化學(xué)(PEC)體系。

PEC 分析利用光來(lái)激發(fā)光電活性物質(zhì)，被激發(fā)的物質(zhì)與電子給體/受體發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)生光電流。因此，PEC 方法的靈敏度受電極、光電材料、電子給體或受體類型等多種因素的影響。

與電化學(xué)方法相比，PEC 可以消除一些不需要的背景信號(hào)，與光催化過(guò)程相似，產(chǎn)生的光電流能大大提高該方法的靈敏度。

一方面，CdSe 量子點(diǎn)是一種介于宏觀和微觀結(jié)構(gòu)之間的亞穩(wěn)態(tài)半導(dǎo)體材料，具有吸收光譜寬、穩(wěn)定性好、比表面積大等優(yōu)點(diǎn)，已被用于制備PEC傳感器。另一方面，CysH 和CoASH 都是含有巰基(-SH)的化合物，可以作為電子給體進(jìn)行電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)，并且可以抑制光敏半導(dǎo)體納米材料的光激發(fā)電子空穴對(duì)的復(fù)合，產(chǎn)生光電效應(yīng)。

在ZnO 納米棒陣列表面覆蓋CdSe 量子點(diǎn)，制備了CdSe/ZnO 光電極。CdSe/ZnO 光電極作為光敏界面，以其光敏性和作為電子受體的特性，與CysH 或CoASH 形成了一個(gè)PEC 體系，為CysH 和CoASH 的分析提供了一種新的PEC 方法。

在20 mW/cm2，410 nm 可見(jiàn)光照射下，得到了偏置電壓為0 V 時(shí)半胱氨酸或輔酶A 對(duì)光電流的敏感響應(yīng)。優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件后，光電流與輔酶A 濃度的對(duì)數(shù)成正比，線性范圍為2.00×10-2~ 50.0 μmol/L，輔酶A 的檢出限為1.00×10-2μmol/L(S/N=3)。其它氨基酸或常見(jiàn)輔酶不干擾半胱氨酸和輔酶A 的測(cè)定。

1.1.3 研究實(shí)例三

2018 年，Chen 等人研究了一種CoA- 銀配位絡(luò)合物(CoA-Ag)，它能加速H2O2分解，提高CdTe@CdS QDs 的陰極ECL 強(qiáng)度。

輔酶A 是代謝過(guò)程中必不可少的輔酶，由腺苷3’-磷酸和一個(gè)巰基組成。因此，CoA 被認(rèn)為是一種與貴金屬(如銀、金、銅)離子反應(yīng)能力強(qiáng)的巰基官能團(tuán)化合物。鑒于上述原理，2 個(gè)官能團(tuán)巰基和腺嘌呤連接的分子CoA-Ag 絡(luò)合物，是由大量巰基-Ag 重復(fù)單位，像類似的多聚腺苷酸RNA 鏈組成的。

為了驗(yàn)證CoA-Ag 復(fù)合物的RNA 結(jié)構(gòu)，Chen等人研究了合成的CoA-Ag 絡(luò)合物是否可以用熒光法與SGII 結(jié)合，因?yàn)镾GII 熒光染料可以特異性染色單鏈核酸。

研究結(jié)果表明，與SGII 結(jié)合CoA-Ag 絡(luò)合物具有明顯的放大信號(hào)發(fā)射，而單一的CoA-Ag 絡(luò)合物或SGII 熒光不明顯，事實(shí)證明CoA-Ag 具有RNA 結(jié)構(gòu)。

單鏈核酸很容易通過(guò)π-π 和分子間作用力吸附在石墨烯或氧化石墨烯(GO)表面。由于CoA-Ag絡(luò)合物與RNA 類似，所以，GO 表面對(duì)CoA-Ag 也有高吸附能力。此外，GO 負(fù)載CoA-Ag 的量隨著CoA-Ag 絡(luò)合物的量增加而增加。

CdTe@CdS QDs 是一種陰極ECL 發(fā)射納米材料，在CdTe@CdS QDs-ECL 體系中引入了CoA-Ag絡(luò)合物，研究其電化學(xué)行為和ECL 行為。CdTe@CdS QDs 表現(xiàn)出ECL 最大波長(zhǎng)在607 nm，與熒光發(fā)射光譜相當(dāng)，表明陰極ECL 信號(hào)來(lái)源于CdTe@CdS QDs 激發(fā)態(tài)(CdTe@CdS*)。在CoA-Ag 存在時(shí)，CdTe@CdS QDs 在607 nm 表現(xiàn)出相同的最大波長(zhǎng)，表明CoA-Ag 只是放大了CdTe@CdS* 的數(shù)量，而不會(huì)改變CdTe@CdS QDs 的其它屬性。

Chen 等人推測(cè)CoA-Ag 絡(luò)合物加速了電極表面的電子轉(zhuǎn)移，增加了CdTe@CdS*的數(shù)量，最終增強(qiáng)了ECL 信號(hào)。在負(fù)電位方向掃描時(shí)，通過(guò)電荷注入將共反應(yīng)物H2O2還原為羥基自由(·OH)，將CdTe@CdS QDs 還原為納米晶CdTe@CdS(e-)。隨后，·OH 與帶負(fù)電荷的CdTe@CdS(e-)發(fā)生反應(yīng)，直接氧化CdTe@CdS QDs，同時(shí)發(fā)出光，產(chǎn)生激發(fā)態(tài)CdTe@CdS*。

ECL 信號(hào)隨著CoA 濃度在0.1~100 μM 范圍內(nèi)增加而增加，這是由于增加了CoA-Ag 絡(luò)合物的數(shù)量。根據(jù)不同濃度CoA 下的ECL 的強(qiáng)度，ECL信號(hào)與CoA 濃度之間存在線性關(guān)系。線性方程為I-I0/I0= 0.082 0C+ 0.211(I0表示了最初的ECL 強(qiáng)度，I表示CoA-Ag 增加的ECL 強(qiáng)度)，檢出限(LOD)為0.03 μM(S/N=3)。

為了進(jìn)一步探索傳感在生物樣品中的應(yīng)用，在反應(yīng)體系中加入10%的血清，用該方法測(cè)出的含量與CoA 分析試劑盒測(cè)得的含量進(jìn)行比較，獲得令人滿意的數(shù)據(jù)。

電化學(xué)發(fā)光(ECL)結(jié)合電化學(xué)和光學(xué)技術(shù)，具有操作簡(jiǎn)單、響應(yīng)快、低背景、高靈敏度和低儀器要求等優(yōu)點(diǎn)，但是它的實(shí)驗(yàn)過(guò)程復(fù)雜。

1.2 熒光分光光度法

熒光光譜法以其靈敏度高、選擇性好、檢出限低、簡(jiǎn)便易行等優(yōu)點(diǎn)，從而被廣泛應(yīng)用于輔酶A的檢測(cè)。

1.2.1 研究實(shí)例一

2007 年，Qian 等人在pH=6.80 緩沖溶液中使用銪(Eu3+)-四環(huán)素(TC)絡(luò)合物作為熒光探針，輔酶A 可顯著提高添加H5IO6后Eu3+-TC 絡(luò)合物在λ =612 nm 的熒光強(qiáng)度，增強(qiáng)的熒光強(qiáng)度與輔酶A 的濃度成正比。

在CoA-H5IO6-buffer-Eu3+-TC 系統(tǒng)中，當(dāng)H5IO6為3.59×10-5~6.46×10-5mol/L 時(shí)，ΔF達(dá)到最大并保持不變。在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，增強(qiáng)熒光值（ΔF） 和輔酶A 的濃度之間有一個(gè)很好的線性關(guān)系，線性范圍為6.08×10-8~ 1.84×10-5mol/L，檢出限為4.62×10-8mol/L。實(shí)際樣選用了成都天臺(tái)山藥業(yè)有限公司注射用輔酶A、人血清和豬肝，實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確。

1.2.2 研究實(shí)例二

2007 年，Li 等人建立了一種測(cè)定微量輔酶A(CoA)的熒光分光光度法。在pH=5.4 的緩沖溶液中，當(dāng)高碘酸(H5IO6)存在時(shí)，CoA 可以顯著增強(qiáng)添Tb3+- 環(huán)丙沙星(CIP)絡(luò)合物在545 nm 處的熒光強(qiáng)度，Tb3+離子的增強(qiáng)熒光強(qiáng)度與CoA 的濃度成正比。測(cè)定CoA 的線性范圍和檢出限分別為6.08×10-6~1.64×10-5和2.1×10-8mol/L。

Li 等人選擇CIP 作為Tb3+的配體，并研究了在H5IO6存在的情況下，CoA 作為協(xié)同配體對(duì)Tb3+熒光有增強(qiáng)作用。在335 nm 處激發(fā)后，在545 nm處測(cè)量熒光強(qiáng)度。檢測(cè)機(jī)理推測(cè)為CIP 可以與Tb3+離子形成穩(wěn)定的二元絡(luò)合物，在490 和545 nm 處觀察到Tb3+離子的特征峰，分別來(lái)自于Tb3+離子的5D4-7F6和5D4-7F5躍遷。

加入H5IO6后，(Tb3+-CIP)*的熒光強(qiáng)度明顯降低。H5IO6-(Tb3+-CIP)*-CoA 體系的熒光光譜與H5IO6-(Tb3+-CIP)*相似。但在CoA 作用下，H5IO6-(Tb3+-CIP)*的熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，Tb3+離子的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)與CoA 濃度成正比，說(shuō)明在H5IO6作用下，CoA 可以與(Tb3+-CIP)*絡(luò)合物形成非常穩(wěn)定的三元復(fù)合物。

但在沒(méi)有H5IO6的情況下，添加CoA 后Tb3+-CIP 體系的熒光強(qiáng)度變化不大。在H5IO6存在的情況下，pH 值對(duì)(Tb3+-CIP)* 和(Tb3+-CIP)*-CoA 體系的熒光強(qiáng)度有顯著影響。H5IO6-(Tb3+-CIP)*CoA(F)和H5IO6-(Tb3+-CIP)*(F0)體系的熒光強(qiáng)度隨pH 值的變化而變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在pH=5.4 時(shí)，ΔF(F-F0)達(dá)到最大值。

隨著H5IO6的加入量的增加(從0.1 mL 到0.7 mL)，(Tb3+-CIP)*(F0)的熒光強(qiáng)度開(kāi)始急劇下降，而CoA-(Tb3+-CIP)*(F)的熒光強(qiáng)度變化不大。當(dāng)H5IO6加入量＞1.5 mL 時(shí)，F(xiàn)明顯降低，F(xiàn)0變化不大。因此，選擇1.0 mL H5IO6(濃度為5.3 ×10-5mol/L)時(shí)，F(xiàn)0明顯下降，F(xiàn)保持恒定，ΔF值大大增強(qiáng)。

在H5IO6存在的情況下，反應(yīng)時(shí)間對(duì)(Tb3+-CIP)*和(Tb3+-CIP)*-CoA 體系的熒光強(qiáng)度有影響。螯合反應(yīng)在室溫下20 min 內(nèi)完成，熒光強(qiáng)度達(dá)到最高值，并保持至少180 min。因此，所有螯合反應(yīng)均在室溫下進(jìn)行30 min，所有測(cè)量均在室溫下3 h 內(nèi)完成。

實(shí)際樣選擇了由安徽豐元藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的注射用輔酶A，并用酶法進(jìn)行了對(duì)照；豬肝樣品用加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果令人滿意。

1.2.3 研究實(shí)例三

近年來(lái)，雜原子摻雜被認(rèn)為是改善CDs 光學(xué)性質(zhì)和提高CDs 量子產(chǎn)率(QY)的一種有前途的方法。特別是氮(N)原子由于與碳原子大小相似，可以與碳原子發(fā)生強(qiáng)烈的結(jié)合，因此，N- 摻雜的CDs(N/CDs)具有更高的熒光量子產(chǎn)率(QYs)。

而硫(S)原子可以調(diào)節(jié)態(tài)密度，提供發(fā)射陷阱態(tài)(ETSs)，這導(dǎo)致電子被激發(fā)來(lái)修正帶隙能。因此，S 摻雜可以使CDs 的最大熒光發(fā)射波長(zhǎng)變長(zhǎng)，提高CDs 的熒光強(qiáng)度。

2017 年，Hu 等人提出了一種S 和N 共摻雜熒光碳點(diǎn)(S,N/CDs)的制備方法。該方法以2 種天然物質(zhì)(菱角和洋蔥)為前體，通過(guò)對(duì)菱角和洋蔥的水加熱，得到了單分散、高熒光的S,N/CDs(直徑約為3.5 nm)。S,N/CDs 表面的羧基可以與Cu(II)離子結(jié)合，導(dǎo)致S,N/CDs 的發(fā)光猝滅，而輔酶A (CoA)可以恢復(fù)(S,N/CDs)的發(fā)光，基于S,N/CDs 上述的特性，提出了一種新穎的熒光探針以用于CoA 高靈敏度的測(cè)定。

在最佳條件下，線性范圍和檢出限分別是0.03~40 μM 和0.01 μM。S 和N 被用作雜原子來(lái)合成S 和N 共摻雜的CDs (S,N/CDs)，S,N/CDs-Cu(II)作為熒光探針檢測(cè)CoA 時(shí)的熒光機(jī)制。

S,N/CDs 在370 nm 光激發(fā)下發(fā)射出很強(qiáng)的藍(lán)綠色熒光，加入Cu(II)離子后，藍(lán)綠色熒光明顯減弱。這一結(jié)果驗(yàn)證了Cu(II)離子可以猝滅S,N/CDs 的發(fā)光，因?yàn)镃u(II)離子很容易與S,N/CDs 表面的羧基和羥基螯合，形成無(wú)輻射絡(luò)合物[(S,N/CDs-Cu(II)]。無(wú)輻射絡(luò)合物的形成，改變了S,N/CDs 表面的缺陷和激子分布，導(dǎo)致了熒光猝滅，使發(fā)光達(dá)到“關(guān)閉”狀態(tài)。

加入CoA 后，Cu(II)離子從S,N/CDs-Cu(II)絡(luò)合物中分離出來(lái)，CoA 分子中的硫醇基團(tuán)與Cu(II)離子發(fā)生強(qiáng)烈結(jié)合，形成更穩(wěn)定的Cu(II)鍵，使S,N/CDs 的發(fā)光恢復(fù)到“打開(kāi)”狀態(tài)。

為進(jìn)一步證實(shí)上述猝滅機(jī)制，檢測(cè)了不同濃度Cu(II)離子存在時(shí)S,N/CDs 的熒光壽命。加入猝滅劑后，如果熒光壽命降低，則為動(dòng)態(tài)猝滅；如果熒光壽命不變(τ0/τ=1)，該系統(tǒng)是靜態(tài)猝滅。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，熒光壽命發(fā)生了微小變化，說(shuō)明Cu(II)猝滅S,N/CDs 熒光是一個(gè)靜態(tài)猝滅過(guò)程，因?yàn)樗纬闪艘粋€(gè)穩(wěn)定的無(wú)輻射絡(luò)合物。

隨著CoA 濃度的增加，S,N/CDs 的熒光信號(hào)逐漸恢復(fù)。體系的熒光強(qiáng)度的增強(qiáng)值與輔酶A 濃度顯示了良好的線性關(guān)系，線性范圍為0.03~40 μM，檢測(cè)限為0.01 μM。實(shí)際樣為豬肝，加入的標(biāo)準(zhǔn)為1.50×10-7mol/g，回收為3.00×10-7mol/g，回收率為102.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.4%。

該法的最大特點(diǎn)是在加入添加銅(II)離子后，熒光信號(hào)逐漸減少，在約6 min 時(shí)達(dá)成平衡，6 min后保持不變，猝滅熒光時(shí)間令人滿意。在S,N/CDs-Cu(II)中加入輔酶A 后，熒光迅速在1 min后恢復(fù)，反應(yīng)時(shí)間非常短，但線性范圍較窄。

迄今為止，各種熒光探針，如熒光染料、熒光蛋白、熒光無(wú)機(jī)或有機(jī)納米顆粒，已經(jīng)成功開(kāi)發(fā)和應(yīng)用。在制備的熒光探針中，如碳點(diǎn)(CDs)，是一種新型的零維碳納米材料，因其制備簡(jiǎn)單、獨(dú)特的光學(xué)性質(zhì)和高耐光性、低生物毒性和優(yōu)良的生物相容性等獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)，而受到了廣泛的關(guān)注。

1.2.4 研究實(shí)例四

2020 年，Long 等人設(shè)計(jì)了一種新型的白胡椒衍生比率型碳點(diǎn)(CDs)，量子產(chǎn)率為10.4%，作為高校特異檢測(cè)CoA 的熒光納米傳感器。

首先，將16 種金屬離子(40 μM)分別添加到CDs 溶液中，只有當(dāng)Cu2+加入后，CDs 的原始熒光強(qiáng)度在520 nm 處猝滅。當(dāng)Cu2+的濃度從0 逐漸增加到65 μM 時(shí)，CDs 的熒光強(qiáng)度在520 nm 逐漸下降；當(dāng)Cu2+的濃度從65 μM 不斷增加到80 μM 時(shí)，CDs 的熒光強(qiáng)度并沒(méi)有發(fā)生明顯的減少，同時(shí)，最大發(fā)射波長(zhǎng)發(fā)生藍(lán)移。

添加Cu2+(65 μM)進(jìn)入CDs 溶液(2.0 mg/mL)中，最大紫外吸收波長(zhǎng)(261、310 和343 nm)沒(méi)有變化，吸收強(qiáng)度降低，而熒光壽命從4.31 ns 降低到4.19 ns。猝滅機(jī)理推測(cè)為CDs 表面基團(tuán)(如-COOH、-OH、-NH2)與Cu2+之間存在親和作用而發(fā)生靜電相互作用，無(wú)輻射電子轉(zhuǎn)移進(jìn)而導(dǎo)致熒光猝滅。輔酶A含有巰基、磷酸基和氨基，由于其易與Cu2+結(jié)合形成更穩(wěn)定的絡(luò)合物，迫使Cu2+從CDs 中分出來(lái)，此時(shí)CDs 表面不再含有Cu2+，CDs 的熒光得到恢復(fù)。

與預(yù)期一樣，Long 等人觀察到在CDs-Cu2+溶液中加入CoA 后，熒光強(qiáng)度和熒光壽命得到恢復(fù)。生物硫醇(如Hcy、GSH、Cys)也有硫醇基團(tuán)，前人報(bào)道由于硫醇基團(tuán)與金屬離子(如Hg2+、Cu2+)有很強(qiáng)的結(jié)合作用，形成穩(wěn)定的S-Hg2+/S-Cu2+絡(luò)合物，但硫代反應(yīng)型熒光傳感器的特異性較差。

而論文中的CDs-Cu2+很少對(duì)生物硫醇有反應(yīng)，更不用說(shuō)其它沒(méi)有巰基的氨基酸?？梢酝茰y(cè)，輔酶A 比生物硫醇有著更強(qiáng)的結(jié)合CDs-Cu2+的能力，生物硫醇不能還原猝滅的熒光。因此，在濃度范圍(0~150 μM)內(nèi)，相對(duì)熒光強(qiáng)度比(F520/F668)與CoA濃度呈極好的線性相關(guān)關(guān)系，檢出限＜8.75 nM。

為了探索白胡椒衍生CDs 的實(shí)用性，該方法選取了2 個(gè)豬肝樣品，回收率為93.3%~108.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.3%~4.5%。

1.3 酶反應(yīng)法

1988 年，K.M.Knights 等人研究了一種單步酶反應(yīng)，即由細(xì)菌產(chǎn)生的酰基輔酶A 合成酶催化棕櫚酸和輔酶A 形成棕櫚酰輔酶A。在必要的輔助因子存在的情況下，酶促反應(yīng)依賴于輔酶A 的濃度。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，棕櫚酰輔酶A 的形成依賴于ATP、MgCl2、輔酶A 和?；o酶A 合成酶的存在。

當(dāng)脫磷酸輔酶A、乙酰輔酶A 或取代輔酶A(CoA-SS-CoA)作為酰基受體時(shí)，反應(yīng)并沒(méi)有繼續(xù)下去(沒(méi)有棕櫚酰輔酶A 形成)。優(yōu)化出的實(shí)驗(yàn)條件為pH=8.4、6.2 mM MgCl2、0.05% Triton X-100 和10 min 孵育。

該方法在1~250 pmol 范圍內(nèi)定量輔酶A 時(shí)得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線，相關(guān)系數(shù)和變異系數(shù)分別為0.999和4.2%。棕櫚酰輔酶A 的形成雖然與輔酶A 濃度線性相關(guān)，但未表現(xiàn)出化學(xué)計(jì)量關(guān)系，因此，需要一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的曲線來(lái)定量組織提取物中的輔酶A。

當(dāng)加入150 pmol/mL~12.5 nmol/mL 范圍內(nèi)的勻漿時(shí)，從大鼠肝臟勻漿(6.6%)中輔酶A 的回收率為99.1±3.6%(平均值±SD,n=5)。此外，在等物質(zhì)的量濃度輔酶A 的反應(yīng)混合物中加入乙酰輔酶A、脫磷輔酶A 或CoA-SS-CoA，沒(méi)有顯著的的棕櫚酰輔酶A 形成。

結(jié)果表明，在所述實(shí)驗(yàn)條件下，使用的二硫蘇糖醇濃度并不促進(jìn)硫酯向輔酶A 的轉(zhuǎn)化。將該方法應(yīng)用于大鼠肝組織勻漿、線粒體和肝細(xì)胞游離濃縮物濃度的測(cè)定，驗(yàn)證了該方法的有效性。

使用終點(diǎn)磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶測(cè)定時(shí)，大鼠肝臟的輔酶A 含量約為156 nmol/g。當(dāng)使用K.M.Knights 等人的技術(shù)測(cè)定肝勻漿樣品中輔酶A 含量時(shí)，其值為106.9±21.8 nmol/g。

兩種方法測(cè)得肝臟中輔酶A 的濃度之間的差異可以根據(jù)動(dòng)物的代謝狀態(tài)(喂或不喂)的差異來(lái)解釋。與從腎移植供體獲得的樣本(91.9±6.2 nmol/g)相比，死后獲得的人肝組織輔酶A 含量降低(66.1± 3.7 nmol/g)，表明死后輔酶A 丟失。然而，在-80 ℃儲(chǔ)存5 周之前和之后進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，輔酶A 的損失最小，之前為89.5 nmol/g，而之后為83.6 nmol/g。

此分析方法為測(cè)定肝勻漿和分離的線粒體和肝細(xì)胞懸浮液中的輔酶A 提供了一種非常靈敏的技術(shù)手段。

1.4 色譜法

高效液相色譜(HPLC)是最常用的分離方法，可與不同的檢測(cè)器相結(jié)合。

1996 年，A. H.Lokkerbol 等人建立一套分析CoA 代謝所涉及各種輔酶A-酯底物和產(chǎn)物的分析體系，建立檢測(cè)17 個(gè)短鏈輔酶A 酯的高效液相色譜體系。

所有HPLC 分析均在室溫下進(jìn)行，采用十八烷基硅膠柱，磷酸鈉緩沖液和乙腈梯度洗脫。使用0.2 M、pH=5.0 磷酸鈉緩沖液-乙腈(100∶5)洗脫液，在22 min 即可完成測(cè)定，但待分析混合物中的dPCoA 酯的分辨率沒(méi)有達(dá)到效果。

用甲醇代替乙腈作為有機(jī)溶劑進(jìn)行洗脫，不僅能改善峰形，還能使乙酰乙酰輔酶A 和乙酰輔酶A 達(dá)到較好的分離效果。

實(shí)驗(yàn)選用pH=5.0 緩沖液-甲醇(100∶20)組成的洗脫液，輔酶A 和乙酰輔酶A 的k'（容量因子） 值分別為1.3 和3.8，10 min 內(nèi)完成分離(流速為1.5 mL/min)。此外，使用含甲醇的洗脫液，即使有機(jī)溶劑含量的微小變化，也不會(huì)導(dǎo)致保留時(shí)間的顯著變化。

研究了CoA 酯注入濃度與檢測(cè)器輸出量之間呈良好的線性關(guān)系，范圍在0.5~10 nmol 之間，檢出限為2.5 pmol。

雖然色譜法經(jīng)典，但往往需要濃縮過(guò)程來(lái)提高檢測(cè)的靈敏度，從而導(dǎo)致樣品嚴(yán)重受損。而且，該方法也相對(duì)復(fù)雜，需要昂貴的儀器和訓(xùn)練有素的技術(shù)人員來(lái)操作。

1.5 毛細(xì)管電泳

毛細(xì)管電泳(CE)在分離方法方面優(yōu)點(diǎn)很多，如試劑和樣品用量小，分離效率高，節(jié)省時(shí)間等。CE 也有一定的局限性，尤其是在靈敏度高的檢測(cè)中，所用的毛細(xì)管內(nèi)徑很小(50-75 μm),只允許體積小的樣本被注入系統(tǒng)中。由于毛細(xì)管體系的樣品注入量低(以納升為單位)，CE 常與高靈敏度檢測(cè)器聯(lián)用。

紫外光譜法（UV） 以其低成本、易操作等優(yōu)點(diǎn)，可與色譜等先進(jìn)技術(shù)結(jié)合起來(lái)，而成為一種檢測(cè)手段。

1.5.1 研究實(shí)例一

2003 年，Liu 等人首次用254 nm 的紫外檢測(cè)-毛細(xì)管電泳法對(duì)12 種不同的CoA 進(jìn)行了分離和定量。所有12 個(gè)CoAs (輔酶A、戊二酰輔酶A、甲基丙二酰輔酶A、琥珀酰輔酶A、甲基巴豆酰輔酶A、異丁酰輔酶A、氧化輔酶A、乙酰輔酶A、巴豆酰輔酶A、n-丙酰輔酶A、乙酰乙酰基輔酶A、丙二酰輔酶A)均在-30 kV 條件下，在含有0.1% β- 環(huán)糊精的100 mM NaH2PO4運(yùn)行緩沖液中被完全分離。總分離時(shí)間＜30 min，信號(hào)響應(yīng)在2個(gè)數(shù)量級(jí)(1~100 nmol)上呈線性，檢測(cè)限在皮物質(zhì)的量范圍內(nèi)。

研究了4 種不同緩沖濃度(25、50、75 和100 mM)來(lái)比較12 種CoAs 的分離效率和峰間分辨率。通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，CoAs 的分離對(duì)磷酸鹽濃度非常敏感。隨著緩沖液濃度的增加，各CoA 的洗脫順序不變，分離效率和峰形均有較大提高。隨著緩沖液濃度在100 mM 以下逐漸降低，峰寬越來(lái)越寬，分辨率越來(lái)越差。CoAs 的遷移可能是通過(guò)氫鍵或絡(luò)合物的形成與磷酸基密切相關(guān)。

優(yōu)化出磷酸鹽(pH = 6.0)最佳濃度為100 mM。然而，在高緩沖濃度下，高壓會(huì)產(chǎn)生大量的焦耳熱，最終影響分離效率，導(dǎo)致電流擊穿。為了解決這個(gè)問(wèn)題，在整個(gè)分離過(guò)程中，使用了冷卻系統(tǒng)使分離柱保持在15 ℃。

此外，經(jīng)過(guò)3 次運(yùn)行后，緩沖溶液兩邊的離子強(qiáng)度不再平衡，導(dǎo)致分辨率較差。因此，每3 次運(yùn)行就替換1 次緩沖液，以保持良好的分離條件。

緩沖液pH 在可電離分析物的分離中起著重要的作用，因?yàn)樗鼪Q定了每一種分析物的電離程度，同時(shí)也影響著毛細(xì)管壁的表面。

檢測(cè)了8 個(gè)CoA 化合物的pH 值，范圍為3.5~7.0，隨著緩沖液pH 值的增加，分離功率也隨之增加。然而，當(dāng)緩沖pH 值＞6.5 時(shí)，遷移時(shí)間急劇增加。因此，為了在合理的時(shí)間內(nèi)獲得較好的分離效果，優(yōu)化pH 值，最佳pH=6.0。

沒(méi)有任何添加劑，CoAs 是無(wú)法分離的。Liu 等人檢測(cè)了各種添加劑，如SDS，β-CD，PVP，PEO。經(jīng)過(guò)一系列的設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，Liu 等人發(fā)現(xiàn)只有β-CD可以有效的分離所有的CoAs。為了在最小的基線噪聲和合理的洗脫時(shí)間(＜25 min)內(nèi)實(shí)現(xiàn)良好的分離，接下來(lái)的研究中將β-CD 濃度維持在0.1%。利用毛細(xì)管電泳研究了β-CD 輔助分離對(duì)手性和非手性分子的影響。

高效毛細(xì)管電泳-紫外檢測(cè)法測(cè)定輔酶A 的線性范圍為1~100 nmol，相關(guān)系數(shù)為0.988，檢出限為55 pmol。實(shí)際樣為大鼠肝臟，測(cè)得輔酶A 的濃度為10.35±1.14 nmol/g。

雖然CE-UV 可成功用于測(cè)定輔酶A，但其還存在一些固有的缺陷，如毛細(xì)管直徑小，容量受限，光程短，于紫外檢測(cè)器的靈敏度較低。

1.5.2 研究實(shí)例二

2010 年，Yongqing Jiang 小組報(bào)道了毛細(xì)管電泳-激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)植物組織中短鏈輔酶A 的分離與定量研究。

在各種組織中測(cè)量短鏈和長(zhǎng)鏈CoA 化合物的高效液相色譜(HPLC)和毛細(xì)管電泳-紫外(CE-UV)檢測(cè)已被報(bào)道，但這些技術(shù)不允許同時(shí)敏感地測(cè)定所有可能在植物組織中共存的CoA 及其衍生物。

在該文中建立了毛細(xì)管電泳結(jié)合激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)器(CE-LIF)定量測(cè)定植物組織中5 種短鏈CoAs。在優(yōu)化衍生化和電泳條件下，用熒光素-5-異硫氰酸酯(FITC)衍生CoAs 后使用75 mm (i.d.)、57 cm 的熔融石英毛細(xì)管和150 mM 硼酸鹽緩沖液(pH=9.00)作為背景電解質(zhì)進(jìn)行分離和定量，在皮物質(zhì)的量水平上，分離過(guò)程在25 kV 下進(jìn)行，不到13 min 就完成了。

衍生化時(shí)間、緩沖液濃度和pH 值對(duì)衍生化效率的影響也進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，5 種短鏈CoAs 檢出限達(dá)到0.26~1.37 nmol/L。

1.6 液質(zhì)聯(lián)用儀

2015 年，Neubauer 等人建立了一種基于液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)(LC-MS/MS)相結(jié)合的代謝物分析方法，解決了細(xì)胞內(nèi)輔酶A(CoA)、輔酶A 二硫和短鏈?；o酶A 硫酯的絕對(duì)定量問(wèn)題。

作者利用反相色譜分離方法，沒(méi)有使用離子對(duì)試劑(該方法的一個(gè)關(guān)鍵優(yōu)勢(shì))，就能分離出CoA 及其相應(yīng)的衍生物和同分異構(gòu)體。離子強(qiáng)度和水相的pH 值對(duì)色譜有很大的影響。在較低的pH 值和離子強(qiáng)度溶液中，出現(xiàn)大量的峰尾。為避免較高的pH 值和離子強(qiáng)度，常用乙腈作為有機(jī)相保證最佳的分離效率。

Neubauer 等人提出了用甲醇代替乙腈的色譜法，并結(jié)合ICP-MS 對(duì)CoA 進(jìn)行磷和硫的絕對(duì)定量分析。LC 與MS/MS 方法相結(jié)合，將其應(yīng)用于細(xì)胞提取物中CoA 的分析。

Neubauer 等人定義了CoA 定量的關(guān)鍵因素，即標(biāo)準(zhǔn)純度、溶液穩(wěn)定性和正確選擇內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)。觀察標(biāo)準(zhǔn)中iso-CoAs 的發(fā)生情況，通過(guò)優(yōu)化色譜，消除了它們對(duì)準(zhǔn)確定量的潛在負(fù)面影響。

由于游離輔酶A 是?；o酶A 標(biāo)準(zhǔn)品中不可避免的雜質(zhì)，因此，必須使用單獨(dú)的標(biāo)準(zhǔn)溶液對(duì)其進(jìn)行定量，并成功使用了含有CoAs 的全標(biāo)記U13C 細(xì)胞提取物作為內(nèi)標(biāo)物。

此外，內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)化使得研究代謝物(琥珀酰輔酶A 除外)的測(cè)量周期為30 h。利用市場(chǎng)上可以買到的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，制得標(biāo)準(zhǔn)溶液，測(cè)得100 mol/L 的輔酶A 的信噪比（S/N） 為14，檢出限為3.8 nM，檢測(cè)極限為12.5 nM，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為7.4%。

1.7 比值比色法

2016 年，Wu 等人介紹了一種利用金納米粒子(AuNPs)和雙鈾酰雙硫磷(BUBSS)作為光學(xué)探針，采用比色法測(cè)定CoA 的方法。

BUBSS 是一種雙核鈾酰絡(luò)合物，由2 個(gè)鈾酰離子和雙硫磷酚螯合反應(yīng)形成。首先，CoA 通過(guò)巰基被AuNPs 捕獲，形成CoA-AuNPs；然后，BUBSS 通過(guò)鈾酰離子與CoA-AuNPs 中的磷酸基團(tuán)發(fā)生配位反應(yīng)，將2 個(gè)CoA-AuNPs 結(jié)合在一起，這就引起CoA-AuNPs 聚合，并導(dǎo)致溶液的顏色從葡萄酒紅色變?yōu)樗{(lán)色。

基于在650 和525 nm 吸光度比值(A630/A525)變化的測(cè)定，建立了CoA 的比值比色法。線性范圍為0~1.2 μmol/L，檢測(cè)限為6 nmol/L。該方法成功地應(yīng)用于加標(biāo)肝臟樣品中CoA 的測(cè)定，回收率為99.4%~102.6%。

以上綜述的每一種方法都各有其優(yōu)缺點(diǎn)，本文對(duì)其進(jìn)行了分析。測(cè)定方法的線性范圍、檢出限和所用材料或技術(shù)見(jiàn)表1。

表1 幾種CoA 測(cè)定方法的比較Table 1 Comparison of some methods used for CoA determination

由表1 可以看出，熒光分光光度法具有方法簡(jiǎn)單、靈敏度高、選擇性高、檢測(cè)限低和成本低等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已成為一種最具吸引力的方法。

2 結(jié) 語(yǔ)

本文綜述了1988 年以來(lái)各種測(cè)定輔酶A 的方法，僅有13 篇文獻(xiàn)報(bào)道，說(shuō)明輔酶A 的檢測(cè)技術(shù)還待進(jìn)一步的開(kāi)發(fā)，希望該綜述能為有興趣的研究學(xué)者提供一些有用的參考。

本文詳細(xì)評(píng)價(jià)了各種技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)：

（1） 電化學(xué)法靈敏度差，不適合常規(guī)的痕量分析。

（2） 高效液相色譜法和毛細(xì)管電泳法具有檢測(cè)限低、較高的靈敏度和選擇性等優(yōu)點(diǎn)，但也存在儀器復(fù)雜、成本高、操作技術(shù)門檻高等缺點(diǎn)。

（3） 比色法是相對(duì)簡(jiǎn)單和廉價(jià)的選擇，但它們對(duì)量化痕量輔酶A 還不夠敏感。

（4） 液質(zhì)聯(lián)用儀的測(cè)定不僅耗時(shí)，衍生化，樣品還需專門地進(jìn)行預(yù)處理、水解等。

（5） 酶反應(yīng)法要求輔酶A 的濃度非常低，適合痕量分析，但難出現(xiàn)化學(xué)計(jì)量關(guān)系。

與上述各法相比，熒光分光光度法因其簡(jiǎn)單、方便、高靈敏度和高選擇性、低檢測(cè)限和低成本等優(yōu)點(diǎn)而得到了廣泛的應(yīng)用。

自從2007 年熒光法測(cè)定輔酶A 報(bào)道以來(lái)，越來(lái)越多的熒光探針相繼涌現(xiàn)。2020 年報(bào)道的白胡椒碳點(diǎn)法是所有檢測(cè)方法中線性范圍最寬、靈敏度最高的熒光法。因此，高靈敏度和選擇性的熒光探針在輔酶A 的熒光分光光度法的發(fā)展中起著關(guān)鍵的作用。

鑒于碳點(diǎn)是一類既有納米材料的獨(dú)特性能，又有催化或光學(xué)功能的零維碳材料，如何把碳點(diǎn)的這種雙功能特性巧妙地結(jié)合起來(lái)，創(chuàng)造出更多奇特功能的碳點(diǎn)，揭示其作用機(jī)制，并將其應(yīng)用于輔酶A的測(cè)定，是今后有待研究的新課題。