秦 雪，馮 瑞，李 琦，李曉宇，鄭 鵬，趙 騫

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030)

奶牛機(jī)體組織中氨基酸代謝產(chǎn)生的氨、經(jīng)呼吸道進(jìn)入體內(nèi)的氨、以及瘤胃和腸道微生物分解生成的氨均可進(jìn)入血液形成血氨。一般來說，吸收的氨進(jìn)入消化道的外周靜脈血液中，與內(nèi)臟器官外周靜脈血液匯聚后經(jīng)血液循環(huán)運(yùn)輸?shù)介T靜脈，最終流入肝臟。在肝臟中經(jīng)尿素循環(huán)生成無毒的尿素，經(jīng)血液循環(huán)運(yùn)送至腎臟隨尿液排出[1]。奶牛分娩以后，為了提高產(chǎn)奶量，通常飼喂高蛋白飼料，飼料的蛋白質(zhì)組成不合理或蛋白質(zhì)水平較高都會(huì)使動(dòng)物肝臟的脫氨基作用和腎臟的排泄增加，導(dǎo)致動(dòng)物的血氨濃度明顯增加。血液中的氨通過簡(jiǎn)單的擴(kuò)散進(jìn)入到奶牛的生殖器官，會(huì)改變子宮和輸卵管的內(nèi)環(huán)境，使奶牛出現(xiàn)受胎率下降、繁殖力降低的現(xiàn)象[2-4]。然而，目前尚不清楚氨離子在子宮中的生理和病理作用。

奶牛的胚胎附植需要處于活化狀態(tài)的胚泡和處于接受態(tài)的子宮相互作用，使胚胎滋養(yǎng)層和子宮內(nèi)膜建立聯(lián)系，成功進(jìn)行附植[5-6]。子宮內(nèi)膜的接受態(tài)是指子宮內(nèi)膜處于一種允許胚泡黏附，直至完成胚胎附植的狀態(tài)。胚胎的成功植入取決于具有容受性的子宮內(nèi)膜和具有侵入性胚胎之間的同步協(xié)調(diào)反應(yīng)[6-8]。因此，本試驗(yàn)使用氯化氨處理子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞，研究氨離子對(duì)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞凋亡及其容受性的影響，為進(jìn)一步明確血氨對(duì)胚胎附植期間的奶牛子宮的影響，探明血氨降低奶牛繁殖力的機(jī)理等提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 氯化氨濃度的篩選解凍牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞(實(shí)驗(yàn)室保存)[5]，使用DMEM/F12(Hyclone)+ 10% 胎牛血清(FBS)(Gibco)+ 1% 雙抗(10 000 U/mL的青霉素和10 g/L的鏈霉素，Biosharp，中國)，在37.5℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。細(xì)胞生長到80%以上時(shí)，傳代到60 mm培養(yǎng)皿內(nèi)，培養(yǎng)24 h后，使用氯化氨(Sigma)處理24 h，觀察細(xì)胞形態(tài)的變化。氯化氨的濃度為0，1，5，10，15，25 mmol/L。同時(shí)使用96孔培養(yǎng)板培養(yǎng)細(xì)胞，使用CCK8檢測(cè)不同濃度的氯化氨對(duì)細(xì)胞活力的影響。

1.2 細(xì)胞活力測(cè)定使用CCK8試劑盒，按照說明書的操作步驟檢測(cè)細(xì)胞活力。具體步驟為：將細(xì)胞傳代到96孔培養(yǎng)板內(nèi)(每孔104個(gè)細(xì)胞)，培養(yǎng)12 h后加入氯化氨，24 h后加入10 μL的CCK8試劑，37℃孵育2 h，然后在450 nm波長下檢測(cè)，根據(jù)D450 nm值計(jì)算細(xì)胞活力。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與處理解凍牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞，使用DMEM/F12 + 10% FBS + 1% 雙抗，在37.5℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。細(xì)胞生長到80%以上時(shí)，傳代到60 mm培養(yǎng)皿內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。24 h后，將培養(yǎng)皿分為2組，每組使用3個(gè)60 mm培養(yǎng)皿，分別為對(duì)照組和氨離子組(使用5 mmol/L氯化氨處理)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，用于接下來的試驗(yàn)分析。

1.4 實(shí)時(shí)定量RT-PCR分析參照文獻(xiàn)[9]的方法，步驟為使用TRIzol(Invitrogen)試劑提取牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的總RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)p53、細(xì)胞色素C(Cyto-c)、促凋亡蛋白(Bax)、抗凋亡蛋白(Bcl-2)、Caspase-8、Caspase-9、Caspase-3、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、白血病抑制因子(LIF)、表皮生長因子(EGF)和β-actin的表達(dá)。檢測(cè)基因的引物序列見表1，由華大基因公司合成，內(nèi)參基因?yàn)棣?actin，用2-ΔΔCt法計(jì)算靶基因的表達(dá)水平。

表1 引物序列

1.5 免疫分析參照文獻(xiàn)[5]的方法，將處理后的細(xì)胞用PBS洗滌，用胰蛋白酶消化進(jìn)行收集，再次用PBS洗滌細(xì)胞2次，去除上清液后，加入150 μL RIPA裂解緩沖液進(jìn)行蛋白的提取。用BCA蛋白檢測(cè)試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。采用10% SDS-PAGE電泳分離蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)膜后，用5%脫脂奶粉封閉1 h，然后與一抗(p53、Bax、Cyto-c、Caspase-8、Caspase-9、Caspase-3、VEGF、LIF和β-actin；1∶1 000，Bioss公司，中國)在4℃過夜孵育。清洗膜3次，每次10 min，用二抗(HRP標(biāo)記，1∶3 000，Bioss公司，中國)在室溫下孵育1 h。洗滌3次，用ECL-Western blot檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)(Amersham Biosciences,USA)。用Image J軟件進(jìn)行灰度分析。

2 結(jié)果

2.1 氨離子對(duì)牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞形態(tài)的影響使用不同濃度的氨離子處理牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞，24 h后進(jìn)行觀察，細(xì)胞顯示凋亡特征，細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)空泡(圖1)，隨著氨離子濃度的增加，細(xì)胞凋亡逐步明顯。

A.～F.0，1，5，10，15，25 mmol/L

2.2 氨離子對(duì)牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞活力的影響使用CCK8檢測(cè)了不同濃度的氨離子對(duì)細(xì)胞活力的影響，結(jié)果顯示，隨著氨離子濃度的增加，細(xì)胞活力逐漸降低，5 mmol/L的氨離子顯著降低了細(xì)胞的活力(P<0.05)，因此，在后續(xù)試驗(yàn)中，使用5 mmol/L的氨離子作為處理濃度(圖2)。

相同字母表示組間差異不顯著，不同字母表示組間差異顯著。下同

2.3 氨離子對(duì)子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡基因表達(dá)的影響RT-PCR分析顯示，氨離子可顯著增加Bax、Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9的mRNA表達(dá)水平(P<0.05)，并顯著降低了Bcl-2/Bax比例，而Bcl-2和p53的mRNA表達(dá)并沒有顯著改變(P>0.05)(圖3)。Western blot分析顯示，氨離子顯著上調(diào)了Bax、Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9的蛋白表達(dá)水平(P<0.05)，對(duì)p53蛋白的表達(dá)無顯著影響(P<0.05)(圖4)。

圖3 氨離子對(duì)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞凋亡基因mRNA表達(dá)的影響

圖4 氨離子對(duì)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)的影響

2.4 氨離子對(duì)子宮容受性相關(guān)因子表達(dá)的影響RT-PCR分析顯示，氨離子顯著增加了LIF、VEGF和EGF 的mRNA表達(dá)水平(P<0.05)(圖5)。Western blot分析顯示，氨離子顯著上調(diào)了LIF和VEGF的蛋白表達(dá)水平(P<0.05)(圖6)。

圖5 氨離子對(duì)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞容受性相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響

圖6 氨離子對(duì)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞容受性相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

3 討論

本研究以奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞作為體外模型來研究氨對(duì)奶牛子宮的影響。用氨離子處理子宮內(nèi)膜細(xì)胞24 h后，細(xì)胞顯示凋亡特征，細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)空泡，隨著氨離子濃度的增加，細(xì)胞凋亡逐步明顯。

RT-PCR分析顯示，氨離子處理后，p53的mRNA和蛋白表達(dá)水平和對(duì)照組相比差異不顯著，可能是5 mmol/L的氯化氨沒有強(qiáng)烈的引起p53的激活。p53的mRNA和蛋白表達(dá)水平增加的趨勢(shì)，也說明氨離子通過增強(qiáng)p53磷酸化水平增加了凋亡細(xì)胞的比例，p53的激活導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯或上調(diào)促凋亡因子誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[10-11]。同時(shí)，Bcl-2/Bax比例顯著下降，進(jìn)一步說明氨離子可以誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的凋亡，并且引起線粒體損傷。因?yàn)榧?xì)胞凋亡途徑是Bcl-2和Bax相互平衡的結(jié)果[12-13]，在細(xì)胞穩(wěn)定時(shí)，抗凋亡蛋白Bcl-2促使凋亡蛋白沉默，從而阻止細(xì)胞凋亡；在應(yīng)激情況下，促凋亡蛋白Bax釋放并轉(zhuǎn)移到線粒體外膜，引起線粒體膜通透性增加及信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[14-15]。氨離子處理細(xì)胞后，Caspase-9和Caspase-3的表達(dá)和活化顯著增加，是因?yàn)锽ax誘導(dǎo)線粒體膜中Cyto-c釋放，下游因子Caspase-9和Caspase-3被細(xì)胞色素C激活，引起線粒體凋亡途徑而參與了細(xì)胞凋亡過程[16]。同時(shí)，氨離子處理細(xì)胞后，Caspase-8的表達(dá)顯著增加，是因?yàn)榧?xì)胞凋亡過程和外源性死亡受體通路有關(guān)，部分受體能夠與Caspase-8結(jié)合并激活，構(gòu)成了死亡誘導(dǎo)復(fù)合物，激活下游的Caspase-3和Caspase-9，進(jìn)一步介導(dǎo)死亡受體誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[17-18]。這些結(jié)果表明，氨離子通過Caspase依賴途徑誘導(dǎo)奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的凋亡。

子宮內(nèi)膜的容受性與內(nèi)膜薄厚程度、內(nèi)膜的形態(tài)和內(nèi)膜的體積有關(guān)，同時(shí)又通過旁分泌及自分泌途徑受很多生長因子的調(diào)控[19]，各個(gè)因子之間相互作用構(gòu)成一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)體系，共同調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜的各種變化，從而參與子宮內(nèi)膜容受性的形成[20-22]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)過氨離子處理后，VEGF的mRNA和蛋白表達(dá)顯著下降，表明氨離子顯著降低了子宮的容受性，因?yàn)閂EGF是子宮內(nèi)膜再生的必不可少的關(guān)鍵因子，VEGF影響血管生成和血管通透性，子宮內(nèi)膜容受性降低不利于胚胎著床[5]。LIF的mRNA和蛋白表達(dá)顯著降低進(jìn)一步說明氨離子降低了子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的容受性，因?yàn)長IF主要通過作用于子宮內(nèi)膜上皮調(diào)節(jié)母胎免疫，使之對(duì)胚胎容受，是胚胎著床所必須的[23-24]，LIF表達(dá)降低，進(jìn)一步導(dǎo)致LIF相關(guān)通路功能紊亂或者免疫抑制和免疫不平衡狀態(tài)，從而使子宮內(nèi)膜容受性降低[24]。在胚胎附植期間，VEGF聯(lián)系眾多信號(hào)通路，子宮內(nèi)膜微環(huán)境中的一些細(xì)胞因子，如 FGF、EGF和LIF等也可以通過自分泌和旁分泌的方式對(duì)VEGF的表達(dá)產(chǎn)生影響[25-27]，因此，氨離子引起子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的凋亡和容受性降低的機(jī)制還需要進(jìn)行更深入的研究。

綜上所述，氨離子可誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞發(fā)生凋亡，從而導(dǎo)致子宮容受性的降低。