馮笑笑，張佩豪，張 悅，田思瑾，劉亞娟，姚大偉

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210095)

三氮脒(diminazene aceturate，DA)作為一種廣譜抗血液原蟲的芳香雙脒類衍生物藥物，因其特效以及價格低廉成為國內(nèi)治療犬巴貝斯蟲病的首選藥物[1]。但是，近年來隨著耐藥蟲株的不斷出現(xiàn)，臨床上DA很難徹底清除體內(nèi)的巴貝斯蟲，導(dǎo)致治療周期較長，而且復(fù)發(fā)率極高。目前，尚不清楚犬吉氏巴貝斯蟲(Babesiagibsoni)對DA產(chǎn)生耐藥性的機(jī)理，對于DA藥物作用機(jī)理的研究也相對較少。轉(zhuǎn)錄組學(xué)測序(RNA sequencing，RNA-Seq)技術(shù)[2]可從整體水平上對細(xì)胞中基因轉(zhuǎn)錄情況以及轉(zhuǎn)錄調(diào)控規(guī)律進(jìn)行研究。目前轉(zhuǎn)錄組學(xué)測序已在B.bigemina[3]、B.microti[4]、B.bovis[5]以及B.divergens[6]的研究中得到應(yīng)用。但是,關(guān)于犬吉氏巴貝斯蟲轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究報道較少，并沒有公開可用的轉(zhuǎn)錄組信息。為了更好的了解DA藥物與犬吉氏巴貝斯蟲之間的相互作用，本試驗對犬吉氏巴貝斯蟲進(jìn)行體外培養(yǎng)，DA藥物處理24 h后，提取樣品中總RNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)測序分析，探索、篩選與DA藥物作用相關(guān)的犬吉氏巴貝斯蟲基因，以提高對DA與巴貝斯蟲相互作用機(jī)制的了解，尋求潛在的藥物作用靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 蟲株來源犬吉氏巴貝斯蟲由本實(shí)驗室保存，接種于試驗犬保蟲。

1.2 主要試劑胎牛血清(FBS)、RPMI 1640培養(yǎng)液購自Gibco；青鏈霉素混合液(100×)、紅細(xì)胞裂解液購自Solarbio；DA購自上海麥克林生化科技有限公司。

1.3 帶蟲血樣的培養(yǎng)與處理采集保蟲犬血液2 mL，EDTA抗凝，3 000 r/min離心10 min。棄掉上層血清和白細(xì)胞層，收集下層的紅細(xì)胞。用PBS洗滌3次，紅細(xì)胞泥用10倍體積的完全培養(yǎng)液懸浮(RPMI1640培養(yǎng)基含40% FBS、1%青鏈霉素混合液(100×))。無菌采取健康犬血液2 mL EDTA抗凝，處理方法同上。將保蟲犬紅細(xì)胞懸液與健康犬紅細(xì)胞懸液等比例混合，放至24孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，每孔2 mL。每24 h吹打混勻紅細(xì)胞1次，取5 μL制備血涂片，經(jīng)瑞氏吉姆薩染色后在油鏡下觀察蟲體，計算紅細(xì)胞染蟲率。培養(yǎng)3 d后棄去上清800 μL。在試驗組添加含DA藥物的完全培養(yǎng)液800 μL，藥物終濃度為800 nmol/L，對照組添加完全培養(yǎng)液800 μL，每組3個重復(fù)。

1.4 紅細(xì)胞裂解處理DA藥物處理24 h后，取1.5 mL培養(yǎng)的紅細(xì)胞，加入3倍體積的紅細(xì)胞裂解液，渦旋混勻后，置于冰上15 min。期間渦旋混勻2次。4℃、450×g離心10 min，棄上清液。向沉淀中加入2倍體積的紅細(xì)胞裂解液，渦旋混勻。于4℃、450×g離心10 min，棄上清液。用500 μL DEPC水重懸，放至液氮迅速冷凍后，-80℃ 備用。對照組樣品處理方法相同。

1.5 轉(zhuǎn)錄組測序流程將-80℃保存的樣品送至深圳華大基因科技服務(wù)有限公司完成轉(zhuǎn)錄組測序。采用DNBSEQ測序平臺，DNBSEQ測序流程為mRNA文庫構(gòu)建、測序、數(shù)據(jù)分析。由于數(shù)據(jù)庫中沒有關(guān)于犬吉氏巴貝斯蟲的轉(zhuǎn)錄組信息，因此本試驗采用無參比對。測序得到的原始測序序列用過濾軟件SOAPnuke v1.4.0進(jìn)行統(tǒng)計，并使用trimmomatic v0.36進(jìn)行質(zhì)量過濾，獲得Clean reads，將樣品的Clean reads與組裝得到的Unigene庫進(jìn)行序列比對。

1.6 差異基因轉(zhuǎn)錄水平驗證采集保蟲犬血液和臨床患犬吉氏巴貝斯蟲病的病犬的血液樣品2 mL，制備紅細(xì)胞懸液，然后用DA處理，處理方法同1.3。取處理后的血液樣品100 μL，加入1 mL RNAiso plus，按照說明書方法提取樣品中總RNA，10 μL反轉(zhuǎn)錄體系中加入500 ng總RNA按照PrimeScript RT Master Mix(Perfect Real Time)說明書方法將上述RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

篩選轉(zhuǎn)錄水平差異較大的基因CL118，根據(jù)測得的基因序列，采用Primer Primer (Version 5.0)軟件設(shè)計引物，上游引物CL 118-F：5′-CCGGATTACGGGACAGAGTTA-3′，下游引物CL 118-R：5′-TAGTTCCAATGGAGCCGTCC-3′，擴(kuò)增片段大小為72 bp。根據(jù)犬吉氏巴貝斯蟲18S rRNA基因保守序列設(shè)計引物，上游引物B.com 151-F：5′-TGTTGCAGTTAAAAAGCTCGTAGTTG-3′，下游引物B.com 151-R：5′-TCCATGCTGAAGTATTCAAGACACA-3′，擴(kuò)增片段大小為152 bp。以上引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。在25 μL反應(yīng)體系中加入2.5 μL cDNA，按照TB Green?Premix Ex Taq試劑說明書進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)在7300 Real-time PCR System中進(jìn)行。以CL118作為靶基因，犬吉氏巴貝斯蟲18S rRNA基因作為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法進(jìn)行相對定量分析，以未用藥物處理組作為對照，檢測DA藥物作用后犬吉氏巴貝斯蟲CL118基因轉(zhuǎn)錄水平。

2 結(jié)果

2.1 測序數(shù)據(jù)與組裝結(jié)果的比對統(tǒng)計從Clean reads質(zhì)量統(tǒng)計表(表1)可以看出：6個樣品過濾后的序列數(shù)在3 643～4 256萬條之間，測序質(zhì)量值大于20(Q20)的堿基占所有堿基的92%以上，測序比對效率均值在86%左右，測序數(shù)據(jù)質(zhì)量良好，滿足后續(xù)分析要求。

表1 Clean reads質(zhì)量統(tǒng)計

2.2 轉(zhuǎn)錄組功能注釋結(jié)果

2.2.1GO數(shù)據(jù)庫分析 通過轉(zhuǎn)錄組測序后的轉(zhuǎn)錄組基因數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選，根據(jù)Nt數(shù)據(jù)庫注釋共篩選出77個有關(guān)巴貝斯蟲屬的基因，將篩選后的基因進(jìn)行GO數(shù)據(jù)庫注釋分類，基因注釋信息如圖1所示。屬于生物過程的有74個，其中與細(xì)胞過程(39個)和代謝過程(29個)的unigenes較多，而生物之間的種間相互作用(2個)、生物調(diào)節(jié)(1個)、刺激反應(yīng)(1個)、定位(1個)以及生物調(diào)節(jié)過程(1個)的unigenens較少。屬于分子功能有77個，其中與結(jié)合活性(31個)、結(jié)構(gòu)分子活性(22個)、催化活性(17個)、翻譯調(diào)節(jié)活動(6個)的unigenes較多，而與蛋白質(zhì)標(biāo)簽(1個)相關(guān)的unigenens較少。屬于細(xì)胞組分有92個，二級分類分別為細(xì)胞結(jié)構(gòu)實(shí)體(43個)、細(xì)胞內(nèi)部組分(38個)和含蛋白質(zhì)復(fù)合物(11個)。

圖1 犬吉氏巴貝斯蟲藥物處理后差異表達(dá)基因GO分類

2.2.2KEGG數(shù)據(jù)庫分析 將篩選后的基因進(jìn)行KEGG代謝通路注釋，主要聚集在細(xì)胞過程、環(huán)境信息處理、遺傳信息處理、代謝和有機(jī)系統(tǒng)類別中。如圖2所示，其中參與細(xì)胞過程的相關(guān)基因共有15個，其二級分類分別為真核細(xì)胞群落(2個)、細(xì)胞生長與死亡(5個)、運(yùn)輸與分解代謝(6個)以及細(xì)胞運(yùn)動(2個)；參與環(huán)境信息處理代謝途徑的相關(guān)基因有7個，均屬于信號傳導(dǎo)(7個)類；參與遺傳信息處理的相關(guān)基因共有36個，其二級分類分別屬于翻譯(29個)、轉(zhuǎn)錄(2個)、蛋白質(zhì)折疊、分類以及降解(5個)；與代謝相關(guān)的基因共有3個，其二級分類分別為概述代謝圖(1個)、能量代謝(1個)以及碳水化合物代謝(1個)；與有機(jī)系統(tǒng)相關(guān)的基因共有22個，其二級分類的代謝途徑分別為內(nèi)分泌系統(tǒng)(8個)、免疫系統(tǒng)(5個)、成熟過程(3個)、環(huán)境適應(yīng)(3個)、敏感度系統(tǒng)(2個)以及循環(huán)系統(tǒng)(1個)。

圖2 吉氏巴貝斯蟲藥物處理后差異表達(dá)基因KEGG分類

2.3 不同樣本差異基因表達(dá)分析本試驗在篩選的過程中，將錯誤發(fā)現(xiàn)率FDR(flase discovery rate)<0.01、差異倍數(shù)(flod change,FC)≥2為篩選標(biāo)準(zhǔn)。其中，F(xiàn)C表示2個樣本(組)間表達(dá)量的比值。測序結(jié)果顯示，DA作用后犬吉氏巴貝斯蟲CL118基因轉(zhuǎn)錄水平顯著下調(diào)。該基因在目前有記載的犬吉氏巴貝斯蟲基因數(shù)據(jù)庫中尚無相關(guān)報道和注釋，該基因與GenBank數(shù)據(jù)庫中已知的線蟲Parastrongyloidestrichosuri(LM523569)基因序列同源性約90%，該基因與GenBank數(shù)據(jù)庫中已知的盤尾絲蟲Onchocerca(VDN00566)氨基酸序列同源性約71%。

2.4 基因表達(dá)驗證結(jié)果為驗證轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)的可靠性，采用相對實(shí)時熒光定量PCR方法進(jìn)一步驗證，檢測犬吉氏巴貝斯蟲CL118基因相對18S rRNA內(nèi)參基因的轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果如圖3樣品A組所示，試驗室保存蟲株經(jīng)DA處理后的CL118基因轉(zhuǎn)錄水平顯著性下調(diào)，該結(jié)果與RNA-Seq的分析結(jié)果相一致，說明CL118基因在DA處理后基因轉(zhuǎn)錄水平確實(shí)下調(diào)。

A.實(shí)驗室保存蟲株；B～D.臨床收集待測蟲株;與對照組比較，*示P<0.05;**示P<0.01

采集臨床其他患犬吉氏巴貝斯蟲病的病犬血液，檢測DA藥物處理后CL118基因的轉(zhuǎn)錄水平，所有臨床樣品CL118基因的轉(zhuǎn)錄水平都下調(diào)(降低為未經(jīng)藥物處理組的22.6%～61.2%)。結(jié)果表明，犬吉氏巴貝斯蟲在DA處理后蟲體CL118基因轉(zhuǎn)錄水平顯著下調(diào)。

3 討論

轉(zhuǎn)錄組學(xué)是從整體水平對基因在蛋白合成中所發(fā)揮的功能以及基因的結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，以揭示在生物應(yīng)對特定的疾病或其他因素時在分子水平上的變化規(guī)律。這對于研究寄生蟲的致病機(jī)制、疫苗的開發(fā)以及藥物靶標(biāo)的篩選都發(fā)揮重要的作用。有研究報道，由羅氏巴貝斯蟲所引起的犬巴貝斯蟲病與人的惡性瘧原蟲病的臨床癥狀相似[7]，因此參考瘧疾的研究模型來用作犬巴貝斯蟲的研究的同時[8]，也有研究將巴貝斯蟲與瘧原蟲轉(zhuǎn)錄組以及基因組進(jìn)行比對[9-10]，以發(fā)現(xiàn)兩者的異同。

目前,DA是普遍公認(rèn)有效的抗蟲藥，還具有抗炎[11]和抗血壓[12]等作用。該藥作為抗原蟲常用藥已有60多年的歷史，長時間的使用已有耐藥蟲株的出現(xiàn)。目前對其耐藥性的作用機(jī)制研究較少。有研究表明[14]，通過體外培養(yǎng)可獲得犬吉氏巴貝斯蟲DA耐藥蟲株，而且耐藥蟲株與原蟲株有能量和糖酵解等代謝的差異。具有DA抗性的犬吉氏巴貝斯蟲分離株比自然感染的野生型蟲株具有更高的ATP濃度,表明其糖酵解途徑的活性并沒有改變。為此，本試驗通過對犬吉氏巴貝斯蟲對體外培養(yǎng)擴(kuò)增后用DA進(jìn)行藥物處理，以探究藥物對于蟲體基因轉(zhuǎn)錄水平的差異。

對于犬吉氏巴貝斯蟲并沒有該蟲株可查的全基因組數(shù)據(jù)參考，已知的生物信息量又很匱乏，很多并未公開數(shù)據(jù)，這給轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的分析帶來了困難。目前對沒有參考基因組的物種的研究，主要采取的方法是通過無參轉(zhuǎn)錄組測序進(jìn)行組裝，將獲得的數(shù)據(jù)與已知的蛋白數(shù)據(jù)庫(NR、Nt、Swiss-Prot、GO、KEGG)進(jìn)行比對，依托于強(qiáng)大的生物信息學(xué)平臺作為支撐，并根據(jù)“基因結(jié)構(gòu)相似，功能同源”的原理，對基因的功能進(jìn)行注釋，從而從基因水平上預(yù)測未知基因的功能并進(jìn)行有方向性的檢測。本試驗將犬屬Unigene篩除后，將獲得的9 699條Unigene數(shù)據(jù)進(jìn)行7大功能數(shù)據(jù)庫注釋(KEGG、GO、NR、NT、SwissProt、Pfam和KOG)，共有9 332條Unigene獲得了基因注釋，占All-Unigene的96.22%。被所有基因庫注釋的基因共有131條Unigene(1.35%)，有3.78%的Unigene未被注釋。對于沒有得到注釋的Unigene，有可能是吉氏巴貝斯蟲經(jīng)DA處理后有新基因，或由于數(shù)據(jù)庫現(xiàn)有的基因資源有限，基因功能注釋信息不豐富，從而造成部分序列暫時無法獲得對應(yīng)的功能注釋信息。

對轉(zhuǎn)錄組測序后的Nt進(jìn)行有關(guān)巴貝斯蟲屬注釋的篩選，共篩選出77個表達(dá)基因，通過比較其表達(dá)基因GO數(shù)據(jù)庫注釋，發(fā)現(xiàn)注釋富集基因最多的類別是細(xì)胞組分、分子功能和生物進(jìn)程。而差異表達(dá)基因在KEGG通路注釋中，顯示參與翻譯通路有關(guān)的基因較多，提示了DA處理后關(guān)于巴貝斯蟲屬的基因表達(dá)變化的方向和代謝途徑。

通過對基因轉(zhuǎn)錄水平顯著與否進(jìn)行基因篩選，發(fā)現(xiàn)CL118基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著性下調(diào)。對該基因進(jìn)行核酸數(shù)據(jù)庫和蛋白數(shù)據(jù)庫比對后發(fā)現(xiàn)其與Onchocercaochengi(VDN00566.1)氨基酸序列存在71%的相似度，與Parastrongyloidestrichosuri(LM523569.1)基因序列存在90%的同源性。對CL118基因轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行qPCR驗證，試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)犬吉氏巴貝斯蟲蟲株在DA處理后，CL118基因的轉(zhuǎn)錄水平均出現(xiàn)明顯下降，該結(jié)果與RNA-Seq的分析結(jié)果相一致。通過臨床驗證發(fā)現(xiàn)，經(jīng)DA處理后的臨床樣本蟲株的CL118基因的轉(zhuǎn)錄水平均出現(xiàn)下降，試驗結(jié)果與RNA測序結(jié)果相一致。其下調(diào)的原因可能是與DA藥物作用有關(guān)，有可能是DA藥物作用的靶點(diǎn)。