王錦祥，孫世坤，陳巖峰，陳冬金，桑 雷，謝喜平

(福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，福建 福州 350013)

兔巴氏桿菌病是由多殺性巴氏桿菌感染兔引起的一種傳染性疾病，該病是兔的常發(fā)病和多發(fā)病。臨床上，患兔主要表現(xiàn)為呼吸道癥狀，如咳嗽、流漿液性或膿性鼻涕，也可表現(xiàn)為中耳炎和結(jié)膜炎等病癥[1-2]。該病常年發(fā)生，所有品種和日齡的兔均易感，是危害兔產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要疾病[1-2]。F型多殺性巴氏桿菌首次分離自火雞[3]，前期研究表明該菌主要感染禽類，且對禽具有強(qiáng)致病性，能引起禽霍亂[4-5]。2004年，JAGLIC等[6]首次證實(shí)F型多殺性巴氏桿菌也存在于兔群中，且該菌通過皮下和滴鼻2種途徑攻毒均能引起試驗(yàn)兔的死亡[7]。2012年，張娜等[8]首次報(bào)道在我國山東的兔群中分離到F型多殺性巴氏桿菌，該分離菌對兔的致病性也很強(qiáng)，攻毒后對仔兔的呼吸道能造成嚴(yán)重的病理損害，并導(dǎo)致仔兔死亡。此后的研究表明，F(xiàn)型多殺性巴氏桿菌在我國不同地區(qū)的兔群中均有流行，且該菌的感染與兔的呼吸道疾病直接相關(guān)[9]。由此可見，F(xiàn)型多殺性巴氏桿菌對兔具有很強(qiáng)的致病性，如果其在兔群中廣泛流行必將阻礙兔產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。因此，建立F型多殺性巴氏桿菌的快速檢測方法，掌握該菌在兔群中的流行情況，有助于實(shí)現(xiàn)對該菌的有效防控，對保障兔產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要意義。目前，用于F型多殺性巴氏桿菌的實(shí)驗(yàn)室檢測方法有細(xì)菌分離鑒定[8]、雙重PCR方法[10]和多重PCR方法[11]，還未見LAMP方法的報(bào)道。本試驗(yàn)針對編碼F型多殺性巴氏桿菌莢膜抗原的fcbD基因的保守序列設(shè)計(jì)了外引物和內(nèi)引物，建立了檢測兔源F型多殺性巴氏桿菌的LAMP快速檢測方法，為兔源F型多殺性巴氏桿菌的快速檢測提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 菌株兔源A型、D型和F型多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocida,P.multocida)、支氣管敗血波氏桿菌(Bordetellabronchiseptica,B.bronchiseptica)、肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumonia,K.pneumonia)、大腸桿菌(Escherichiacoli,E.coli)和金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,S.aureus)等臨床分離株由本實(shí)驗(yàn)室分離保存。

1.2 主要試劑Brain Heart Infusion購自O(shè)xoid公司；EasyPure Bacteria Genomic DNA Kit(EE161-01)購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；熒光及可視化LAMP試劑盒(200921W)購自北京天恩澤基因科技有限公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成根據(jù)GenBank登錄的編碼F型多殺性巴氏桿菌莢膜抗原的fcbD基因(AF302467)，利用在線軟件PrimerExplorer V5(http://primerexplorer.jp/e/)設(shè)計(jì)了2對特異性引物。外引物序列為fcbD-F3：5′-GCCTGTTTGGTCAATCAGAA-35′/fcbD-B3：5′-GTTGTGGTGCCATATCGC-3′；內(nèi)引物序列為fcbD-FIP：5′-TTGCACAATGGTAAGTAAGTTTTCCACAA-ACTACCCATTTGAAGTC-3′/fcbD-BIP：5′-GGA-TATCAATTGTGTGCAGTCAGATCGAGACA-AAATCATACTTTGC-3′。引物由鉑尚生物技術(shù)(上海)有限公司合成。

1.4 LAMP方法的建立按照EasyPure Bacteria Genomic DNA Kit說明書，提取兔源F型多殺性巴氏桿菌的基因組DNA。以提取的基因組DNA為模板，利用針對F型多殺性巴氏桿菌fcbD基因的特異性LAMP引物建立檢測F型多殺性巴氏桿菌的LAMP方法。LAMP方法反應(yīng)體系為：4×熒光及可視化LAMP MagicMix 5 μL，基因組DNA 1 μL，外引物fcbD-F3/fcbD-B3(10 μmol/L)各0.4 μL，內(nèi)引物fcbD-FIP/fcbD-BIP(10 μmol/L)各3.2 μL，滅菌ddH2O 6.8 μL，共計(jì)20 μL。LAMP方法反應(yīng)條件為：65℃ 90 min。反應(yīng)結(jié)束后，觀察反應(yīng)產(chǎn)物的顏色，并將反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.5 LAMP方法的優(yōu)化將反應(yīng)體系中混合引物的終濃度保持為3.4 μmol/L不變，將外引物和內(nèi)引物的濃度比設(shè)為1∶3，1∶4，1∶5，1∶6，1∶7和1∶8，將反應(yīng)溫度設(shè)為62，63，64，65，66，67，68℃，將反應(yīng)時(shí)間設(shè)為30，45，60，75，90，105 min，對LAMP方法進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳的反應(yīng)條件。

1.6 LAMP方法的特異性試驗(yàn)按照EasyPure Bacteria Genomic DNA Kit說明書，分別提取兔源A型、D型和F型多殺性巴氏桿菌、支氣管敗血波氏桿菌、肺炎克雷伯菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的基因組DNA。分別以這些細(xì)菌的基因組DNA為模板，同時(shí)設(shè)置陰性對照，應(yīng)用建立的LAMP方法進(jìn)行檢測，驗(yàn)證該方法的特異性。

1.7 LAMP方法的敏感性試驗(yàn)將兔源F型多殺性巴氏桿菌的基因組DNA進(jìn)行連續(xù)的10倍倍比稀釋，使LAMP反應(yīng)體系中的DNA模板濃度為1×108～1×100拷貝/μL，應(yīng)用建立的LAMP方法進(jìn)行檢測，驗(yàn)證該方法的敏感性。

1.8 LAMP方法的重復(fù)性試驗(yàn)取60份已知結(jié)果的病死兔肺臟樣品，平均分為3組，每組20份(A型多殺性巴氏桿菌樣品3份、D型多殺性巴氏桿菌樣品3份、F型多殺性巴氏桿菌樣品3份、支氣管敗血波氏桿菌樣品2份、肺炎克雷伯菌樣品2份、大腸桿菌樣品2份、金黃色葡萄球菌樣品2份和陰性樣品3份)。按照EasyPure Bacteria Genomic DNA Kit說明書分別提取上述樣品的基因組DNA，應(yīng)用建立的LAMP方法分3批次檢測這些樣品，根據(jù)檢測結(jié)果統(tǒng)計(jì)批內(nèi)和批間變異系數(shù)，評估該方法的重復(fù)性。

1.9 臨床樣品的檢測取90份來自福建省不同地區(qū)養(yǎng)兔場病死兔的肺臟樣品，按照EasyPure Bacteria Genomic DNA Kit說明書分別提取上述樣品的基因組DNA。應(yīng)用本試驗(yàn)建立的LAMP方法和已報(bào)道的雙重PCR方法[10]同時(shí)檢測這些樣品，比較兩種檢測方法的結(jié)果，評估該LAMP方法的臨床實(shí)用性。

2 結(jié)果

2.1 F型多殺性巴氏桿菌fcbD基因的擴(kuò)增結(jié)果顯示，擴(kuò)增結(jié)果可通過肉眼判讀，陽性樣品的產(chǎn)物為藍(lán)色，而陰性樣品的產(chǎn)物為淺藍(lán)色(圖1)。進(jìn)一步將擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，陽性樣品的擴(kuò)增產(chǎn)物為特征性的階梯狀條帶，而陰性樣品則無此特征性條帶(圖1)。

M.DL2000 DNA Marker;1.F型多殺性巴氏桿菌;2.陰性對照

2.2 LAMP方法的優(yōu)化在LAMP方法建立的基礎(chǔ)上，對該方法的反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果顯示，反應(yīng)體系中引物終濃度保持為3.4 μmol/L不變，外引物和內(nèi)引物的濃度比為1∶6～1∶8時(shí)，該LAMP方法擴(kuò)增效果較優(yōu)，本試驗(yàn)取中間值即1∶7為該方法的最優(yōu)外引物和內(nèi)引物的濃度比(圖2)；當(dāng)反應(yīng)溫度為65℃時(shí)，該LAMP方法擴(kuò)增效果最優(yōu)(圖3)；當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為30 min時(shí)，該LAMP方法有擴(kuò)增，且該LAMP方法的擴(kuò)增效果隨擴(kuò)增時(shí)間的增加而增強(qiáng)，因有些臨床樣品中目的基因的含量可能較低，為了使該LAMP方法既有較好的擴(kuò)增效果(不產(chǎn)生假陰性)又能實(shí)現(xiàn)快速檢測的目的，本試驗(yàn)選取60 min作為最佳反應(yīng)時(shí)間(圖4)。綜上所述，該LAMP方法的最佳反應(yīng)條件確定為：外引物和內(nèi)引物的濃度比為1∶7，反應(yīng)溫度為65℃，反應(yīng)時(shí)間為60 min。

M.DL2000 DNA Marker;1～6.1∶3，1∶4，1∶5，1∶6，1∶7，1∶8

M.DL2000 DNA Marker;1～7.62，63，64，65，66，67，68℃

M.DL2000 DNA Marker;1～6.30，45，60，75，90，105 min

2.3 LAMP方法的特異性試驗(yàn)結(jié)果顯示，該LAMP方法僅對兔源F型多殺性巴氏桿菌有擴(kuò)增，對其他常見兔源病原菌包括，A型和D型多殺性巴氏桿菌、支氣管敗血波氏桿菌、肺炎克雷伯菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌以及陰性對照(滅菌ddH2O)均無擴(kuò)增(圖5)。結(jié)果表明，該LAMP方法特異性強(qiáng)。

M.DL2000 DNA Marker;1.F型多殺性巴氏桿菌;2.A型多殺性巴氏桿菌;3.D型多殺性巴氏桿菌;4.支氣管敗血波氏桿菌;5.肺炎克雷伯菌;6.大腸桿菌;7.金黃色葡萄球菌;8.陰性對照

2.4 LAMP方法的敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示，該LAMP方法的最低檢出限為1×102拷貝/μL，比雙重PCR方法的高10倍，表明該方法具有良好的敏感性(圖6)。

A,B.LAMP方法檢測結(jié)果;C.雙重PCR方法檢測結(jié)果 M.DL2000 DNA Marker;1～9.1×108～1×100 拷貝/μL的F型多殺性巴氏桿菌基因組DNA模板;10.陰性對照

2.5 LAMP方法的重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果顯示，3批次的檢測結(jié)果均與已知結(jié)果完全一致，表明該LAMP方法具有良好的重復(fù)性。

2.6 臨床樣品的檢測該LAMP方法檢出兔源F型多殺性巴氏桿菌陽性樣品6份，陰性樣品84份，檢測結(jié)果與雙重PCR方法的檢測結(jié)果完全一致，表明該LAMP方法準(zhǔn)確性高，該方法臨床實(shí)用性好。

3 討論

兔巴氏桿菌病是兔的重要疫病，該病能通過飛沫、污染的飼料和飲水等在兔群中快速傳播，各品種和日齡的兔均易感，危害嚴(yán)重[1-2]。已有研究表明，兔巴氏桿菌病主要由A型和D型多殺性巴氏桿菌引起[12-13]。然而，近年來F型多殺性巴氏桿菌感染兔的多發(fā)及該菌對兔表現(xiàn)出的強(qiáng)致病性使兔巴氏桿菌病的病因更加復(fù)雜，也使該病的確診更加困難。

LAMP首次建立于2000年，是一種新型的核酸快速擴(kuò)增方法[14]，該方法與傳統(tǒng)的PCR不同，可以在恒溫條件下實(shí)現(xiàn)核酸的擴(kuò)增，而不需要在變性、退火和延伸3個(gè)溫度條件下進(jìn)行，且該方法的擴(kuò)增結(jié)果可通過簡單的設(shè)備(紫外燈)判讀或通過肉眼直接判讀。因此，自LAMP建立以來已廣泛地應(yīng)用于畜禽疫病的快速檢測[15-17]。多殺性巴氏桿菌血清型眾多，根據(jù)莢膜抗原的不同可將其劃分為5種血清型(A、B、D、E和F)，且各血清型菌株之間無交叉免疫[18]。fcbD基因是F型多殺性巴氏桿菌的特異性基因，其編碼的是F型多殺性巴氏桿菌莢膜成分中的軟骨素[11]。已有研究表明，基于fcbD基因能建立特異的鑒定F型多殺性巴氏桿菌莢膜血清型的多重PCR方法和檢測兔源F型多殺性巴氏桿菌的雙重PCR方法[10-11]。由此可見，以該基因?yàn)槟康幕蚰芙⑻禺惖臋z測兔源F型多殺性巴氏桿菌的LAMP方法。

本試驗(yàn)根據(jù)fcbD基因的保守序列設(shè)計(jì)了2對引物，建立了檢測兔源F型多殺性巴氏桿菌的LAMP方法。該方法對常見兔源病原菌，包括A型和D型多殺性巴氏桿菌、支氣管敗血波氏桿菌、肺炎克雷伯菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均無交叉反應(yīng)，特異性強(qiáng)。此外，該方法還易于推廣應(yīng)用。由此可見，該方法的建立為兔源F型多殺性巴氏桿菌的快速檢測提供了依據(jù)。