王國康，李 麗，賈妙妙，馮賀龍，曾 馳，羅青平，溫國元*

(1.湖北省農(nóng)業(yè)科學院 畜牧獸醫(yī)研究所，湖北 武漢 430064；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部畜禽細菌病防治制劑創(chuàng)制重點實驗室，湖北 武漢 430064；3.畜禽病原微生物學湖北省重點實驗室，湖北 武漢 430064；4.武漢輕工大學 生物與制藥工程學院，湖北 武漢 430023)

禽副黏病毒廣泛存在于各種動物中，包括哺乳動物、鳥類、爬行動物和魚類等?；谘t細胞凝集抑制(HI)、神經(jīng)氨酸酶抑制(NI)和序列分析，禽副黏病毒可分為18種血清型。禽副黏病毒血清Ⅱ型(APMV-2)于1956年首次發(fā)現(xiàn)于加利福尼亞州尤卡帕[1]。此后，世界各地便陸續(xù)從雞、火雞和野鳥體內(nèi)分離出APMV-2毒株[2]。該病原的致病力較弱，主要引起感染禽類的輕度呼吸道疾病、火雞產(chǎn)蛋下降等。

APMV-2為單股負鏈RNA病毒，屬副黏病毒科(Paramyxoviridae)禽副黏病毒屬(Avbulavirus)[3]。APMV-2基因組長度符合“6堿基原則”，從3′端到5′端依次編碼核衣殼蛋白(NP)、磷蛋白(P)、基質(zhì)蛋白(M)、融合蛋白(F)、血凝素-神經(jīng)氨酸酶蛋白(HN)和大聚合酶蛋白(L)6個結(jié)構(gòu)蛋白[4]。

在眾多APMV血清型中，APMV-1，又稱新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)對禽類的危害最大。其引發(fā)的新城疫(Newcastle disease,ND)具有較高的發(fā)病率和病死率，給世界禽類養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大損失[5-6]。該病的防控以免疫預(yù)防為主，常用的疫苗有滅活疫苗和弱毒活疫苗兩種[7]。其中低毒力活疫苗以其使用方便和毒副作用小等優(yōu)點在我國應(yīng)用最為廣泛，為ND的防控起到了關(guān)鍵作用。隨著分子生物學的飛速發(fā)展，利用反向遺傳操作技術(shù)，以NDV作為活疫苗載體的新型禽用疫苗研發(fā)成為了研究熱點[8]。但在家禽養(yǎng)殖過程中，由于ND疫苗免疫頻次過高，導(dǎo)致家禽體內(nèi)普遍存在較高水平的NDV抗體，嚴重干擾了NDV載體疫苗的免疫效果[9-11]。

研究表明，APMV-2不與NDV抗體存在交叉反應(yīng)，APMV-2在宿主體內(nèi)復(fù)制受到NDV抗體的影響較小[12]。同時，APMV-2可在雞胚增殖，能在雞的氣管、肺、大腦、脾臟等部位中穩(wěn)定復(fù)制，其致病力較弱[13-15]。APMV-2有作為禽用疫苗載體的潛力。與研究較為透徹的NDV相比，APMV-2毒株的分離鑒定、致病力及反向遺傳操作系統(tǒng)的研究報道很少[8,16]。本研究通過APMV 2型全基因組序列的比對優(yōu)化和全人工合成，利用反向遺傳操作技術(shù)，拯救獲得了新的APMV-2 Y2株，為該病原的致病機理研究及新型禽用疫苗研發(fā)提供了技術(shù)平臺。

1 材料與方法

1.1 毒株、質(zhì)粒和菌株pACNR質(zhì)粒購自北京BioVector NTCC典型培養(yǎng)物保藏中心；痘病毒MAV-T7、倉鼠腎細胞(BHK-21) 、pACNR-T7、pcDNA3.1(+)、pVAX1載體質(zhì)粒均由本實驗室保存；大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞購自寶生物工程(大連)有限公司；APMV-2多克隆抗體由本實驗室制備保存。

1.2 主要試劑與材料2×Phanta Max Master Mix (Dye Plus)、2×Rapid Taq Master Mix購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；In-Fusion HD Cloning Kit購自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司；DNA Gel Extraction Kit和Plasmid Mini Kit Ⅰ購自O(shè)MEGA公司；QIAprep Spin Miniprep Kit購自QIAGEN公司；Hanks液、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、TPCK胰蛋白酶均購自Gibco公司；Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑購自Invitrogen公司；FITC標記的羊抗雞IgG購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；SPF雞胚購自北京梅里亞維通實驗動物技術(shù)有限公司。

1.3 APMV-2 Y2株基因組序列的優(yōu)化對GenBank數(shù)據(jù)庫已公布的12條APMV-2基因序列(登錄號分別為：KT071756、KT071757、KT071755、HQ896023、HQ896024、EU338414、HM159993、HM159994、HM159995、LC187305、LC187306、NC_039230)進行同源性分析，綜合選擇與其余11株序列同源性最高的毒株之一作為參考株。比對參考株核苷酸變異較多的部分，將相應(yīng)位置的核苷酸序列更改為其他APMV-2的一致序列，獲得1株新的APMV-2株(命名為Y2株)的全基因組序列。將優(yōu)化好的Y2株基因組序列分為9段送至武漢轉(zhuǎn)導(dǎo)生物實驗室有限公司進行序列合成。

1.4 引物設(shè)計根據(jù)Y2株的全基因組序列，設(shè)計Overlap PCR引物，用于擴增人工合成的9個小片段，隨后將9個小片段融合成AP-H1、AP-H2和AP-H3，同時，每個融合片段的正向引物和反向引物的5′端需要載體兩末端同源序列，依次連接至載體。設(shè)計擴增Y2株NP、P、L基因的引物，為NP、P、L基因片段加入同源臂、酶切位點和Kozak序列，NP、P、L基因片段的正向引物和反向引物的5′端需要克隆載體兩末端同源序列。設(shè)計載體線性化引物，用于質(zhì)粒pACNR-T7、T7-H1、T7-H12和pcDNA3.1(+)的線性化。引物序列見表1。

表1 構(gòu)建重組質(zhì)粒所需引物

1.5 全長cDNA克隆及輔助質(zhì)粒的構(gòu)建分別以人工合成的重組質(zhì)粒為模板，利用表1中的Overlap PCR引物，擴增9個小片段AP1-AP9。以AP1、AP2和AP3的PCR回收產(chǎn)物為模板，AP1-F/AP1-R、AP2-F/AP2-R和AP3-F/AP3-R(其中AP1-R、AP2-F/AP2-R和AP3-F稀釋至0.1 μmol/L)為引物，經(jīng)過重疊PCR擴增獲得融合片段AP-H1，以同樣的方法獲得另外兩個融合片段AP-H2和AP-H3。以T7-F/T7-R為引物，將載體質(zhì)粒pACNR-T7線性化，采用In-Fusion克隆的方式，將融合片段AP-H1連接至質(zhì)粒pACNR-T7，得到重組質(zhì)粒T7-H1。在T7-H1的基礎(chǔ)上，再依次將AP-H2和AP-H3連入，最終獲得全長質(zhì)粒T7-Y2(圖1)。

圖1 重組質(zhì)粒T7-Y2的構(gòu)建示意圖

以全長質(zhì)粒T7-Y2為模板，F(xiàn)ZNP-F/ FZNP-R、FZP-F/FZP-R、FZL-F/FZL-R為引物，分別擴增Y2株的NP、P、L基因序列。用引物pcDNA-F/pcDNA-R通過PCR方法，將質(zhì)粒pcDNA3.1(+)線性化。利用限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ+EcoR Ⅰ對質(zhì)粒pVAX1進行雙酶切。采用In-Fusion克隆的方式，將NP、P基因序列連接至質(zhì)粒pVAX1，將L基因序列連接至質(zhì)粒pcDNA3.1(+)，獲得輔助質(zhì)粒pVAX-NP、pVAX-P和pcDNA-L。

1.6 APMV-2 Y2株的拯救采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，將全長質(zhì)粒T7-Y2和3個輔助質(zhì)粒(pVAX-NP、pVAX-P和pcDNA-L)，按照4∶2∶1∶1的質(zhì)量比混勻，加入預(yù)先感染痘病毒MAV-T7的BHK-21細胞。37℃孵育6 h后用HBSS洗滌3次，加入細胞培養(yǎng)液(DMEM+2%雙抗)。待細胞病變達到80% ～ 90%時，反復(fù)凍融3次，離心取上清，以0.22 μm 濾膜除去痘病毒，接種9日齡SPF雞胚。以紅細胞凝集(HA)試驗，對拯救病毒進行初步鑒定。

1.7 APMV-2 Y2株的PCR鑒定將HA陽性的尿囊液在SPF雞胚上傳3代后，收集尿囊液，提取病毒總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以AP5-F/AP5-R為引物，按2 × Rapid Taq Master Mix說明書進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物送往生工生物工程(上海)股份有限公司測序鑒定。

1.8 APMV-2 Y2株的間接免疫熒光檢測將BHK-21細胞傳至96孔板培養(yǎng)，待細胞密度達到約80%時，接種Y2株病毒尿囊液。感染72 h后棄去培養(yǎng)基，以APMV-2多克隆抗體為一抗，F(xiàn)ITC標記的羊抗雞IgG為二抗進行間接免疫熒光試驗，熒光顯微鏡下觀察檢測結(jié)果。

1.9 APMV-2 Y2株的生物學特性測定APMV-2 Y2株的最低致死劑量的平均致死時間(MDT)、1日齡雛雞的腦內(nèi)致病指數(shù)(ICPI)、HA和雞胚半數(shù)感染量(EID50)等試驗均參照文獻[17]方法進行。將APMV-2 Y2株以0.01 MOI接種于鋪有BHK-21細胞的96孔板中，在12，24，36，48，60，72，84，96 h 分別收取細胞培養(yǎng)上清，測定每個時間點的病毒TCID50，繪制重組病毒的生長曲線。

2 結(jié)果

2.1 APMV-2 Y2株全基因組序列的優(yōu)化及人工合成比較了GenBank登錄的12條APMV-2全基因序列的同源性。如圖2所示，登錄號為HQ896023、HQ896024、EU338414、 LC187305、LC187306和NC_039230的6個毒株與其余11株序列平均同源性最高，均為86.6%。選取登錄號為HQ896023的F8株為參考株，與其他11株序列KT071756、KT071757、KT071755、HQ896024、EU338414、HM159993、HM159994、HM159995、LC187305、LC187306和NC_039230的同源性分別為67.9%，67.9%，67.8%，100%，99.8%，94.4%，87.6%，67.6%，99.8%，99.8%和99.8%。

圖2 APMV-2各毒株的同源性分析

通過F8與其余11株的全基因組序列比對分析，將F8株的基因組序列優(yōu)化如下：第1 440位由T變?yōu)槎鄶?shù)序列共有的C，第2 142位由C變?yōu)槎鄶?shù)序列共有的T，第2 709位由T變?yōu)槎鄶?shù)序列共有的C，第5 552位由C變?yōu)槎鄶?shù)序列共有的T，第6 397位由A變?yōu)槎鄶?shù)序列共有的G，第6 868位由A變?yōu)槎鄶?shù)序列共有的G，第7 768位由G變?yōu)槎鄶?shù)序列共有的T，第11 753位由A變?yōu)槎鄶?shù)序列共有的C，第14 409位由G變?yōu)槎鄶?shù)序列共有的A，第14 480位由T變?yōu)槎鄶?shù)序列共有的C，末端加上APMV-2其他大部分毒株都具有的序列TTGCTTTGCTATTCCATGTCTGGT(表2)。經(jīng)武漢轉(zhuǎn)導(dǎo)生物實驗室有限公司合成后得到9個含有Y2株基因組片段的重組質(zhì)粒。

表2 參考株的序列優(yōu)化

2.2 全長質(zhì)粒及輔助質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定首先采用重疊PCR技術(shù)，分別將9個小片段連接為3個大片段AP-H1、AP-H2、AP-H3。然后采用In-Fusion克隆的方式，將3個大片段依次克隆至pACNR-T7載體質(zhì)粒，得到APMV-2 Y2株的全長cDNA克隆T7-Y2，利用限制性內(nèi)切酶BamH Ⅰ對重組質(zhì)粒T7-Y2進行酶切鑒定(圖3)，酶切結(jié)果與預(yù)期相符。利用限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ對輔助質(zhì)粒pVAX-NP和pVAX-P進行酶切鑒定(圖4)，利用限制性內(nèi)切酶Sal Ⅰ對pcDNA-L進行酶切鑒定(圖5)，酶切結(jié)果與預(yù)期相符，表明全長質(zhì)粒及3個輔助質(zhì)粒構(gòu)建成功。

M.DL15000 DNA Marker；1.T7-Y2 BamH Ⅰ單酶切產(chǎn)物

M.DL5000 DNA Marker；1，2.pVAX-NP Hind Ⅲ、pVAX-P Hind Ⅲ單酶切產(chǎn)物

M.DL15000 DNA Marker；1.pcDNA-L Sal Ⅰ單酶切產(chǎn)物

2.3 APMV-2 Y2株的拯救與鑒定鑒定成功的重組質(zhì)粒T7-Y2、pVAX-NP、pVAX-P和pcDNA-L共轉(zhuǎn)染至已經(jīng)感染有MAV-T7的BHK-21細胞，于96 h后收取細胞液，反復(fù)凍融3次后接種9日齡SPF雞胚，96 h后收取雞胚尿囊液，其HA效價為7～8 log2。將HA陽性的雞胚尿囊液在9日齡SPF雞胚連續(xù)傳代3次，測定其HA效價為8 ～ 9 log2。以引物AP5-F/AP5-R對尿囊液進行PCR擴增(圖6)，得到與預(yù)期相符的條帶，測序結(jié)果正確，表明Y2株拯救成功。APMV-2 Y2株感染BHK-21細胞后，進行間接免疫熒光檢測，如圖7所示，感染有APMV-2 Y2株的BHK-21細胞呈現(xiàn)典型的綠色熒光，陰性對照則未產(chǎn)生熒光。

M.DL2000 DNA Marker；1.PCR鑒定產(chǎn)物；2.陰性對照

A..感染APMV-2 Y2株的BHK-21細胞；B.陰性對照

2.4 APMV-2 Y2株的生物學特性按照OIE標準，對APMV-2 Y2株進行毒力測定，結(jié)果顯示，Y2株的MDT>168 h，ICPI為0.09，符合弱毒的特征。感染SFP雞胚后，尿囊液的病毒含量為108.83EID50/mL，HA效價為9 log2。

2.5 APMV-2 Y2株的生長曲線以0.01 MOI接種于鋪有BHK-21細胞的96孔板中，收集Y2株感染BHK-21細胞后8個時間點的細胞上清，測定病毒TCID50，繪制Y2株的增殖曲線(圖8)，顯示Y2株在感染BHK-21細胞60 h時達到最高滴度(103.24TCID50/mL)。

圖8 Y2株的細胞生長曲線

3 討論

ND作為禽類急性烈性傳染病之一，現(xiàn)已給禽類養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大損失[6,18]。為減少ND帶來的危害，大部分養(yǎng)殖戶對雞群進行ND疫苗接種10余次，多者甚至20次以上[9]。因此目前雞體內(nèi)普遍存在較高水平的ND抗體，對NDV載體的復(fù)制帶來干擾，嚴重影響了NDV載體疫苗在雞體內(nèi)的復(fù)制滴度和免疫原性。有研究表明，APMV-2不與NDV抗體存在交叉反應(yīng)，APMV-2在體內(nèi)的復(fù)制受到NDV抗體的影響較小[12]。同時，APMV-2與NDV相比，感染后只引發(fā)輕度呼吸道疾病、產(chǎn)蛋量下降的癥狀[19-20]。作為疫苗載體，與NDV相比，APMV-2具有安全性較高、不受ND抗體干擾等特點[19-20]。因此，APMV-2作為禽用疫苗載體具有較好的發(fā)展前景。

關(guān)于APMV-2的反向遺傳系統(tǒng)報道較少[15]。KIM等[21]將APMV-2的F和HN胞外區(qū)替換為NDV BC株F和HN胞外區(qū)，研究了F和HN蛋白在NDV和APMV-2的復(fù)制、組織嗜性和致病性方面的作用，證明了F和HN胞外區(qū)共同決定了NDV和APMV-2的細胞融合、組織嗜性和毒力表型。TSUNEKUNI等[12]分別以rAPMV-2、rAPMV-6和rAPMV-10為載體，利用反向遺傳技術(shù)，構(gòu)建了表達高致病性禽流感病毒血凝素基因(HPAIV HA)的重組病毒rAPMV-2/HA、rAPMV-6/HA和rAPMV-10/HA，分別免疫7周齡、已預(yù)免NDV的雛雞，免疫后14 d以致死劑量的HPAIV攻毒，結(jié)果顯示，106EID50免疫組rAPMV-2/HA、rAPMV-6/HA和rAPMV-10/HA的保護率分別為50%，50%和25%，107EID50免疫組rAPMV-2/HA、rAPMV-6/HA和rAPMV-10/HA的保護率分別為50%，50%和90%，而106EID50rNDV/HA免疫后對NDV預(yù)免雛雞保護率為0%，免疫劑量提高至107EID50也只能誘導(dǎo)部分保護。這些結(jié)果表明rAPMV-2、rAPMV-6和rAPMV-10作為禽用疫苗載體，特別是對于高頻次接種ND疫苗的商品雞是可行的。

本研究通過對序列比對和設(shè)計優(yōu)化，獲得了1株新的APMV-2毒株的全基因組序列，命名為Y2株。人工合成了Y2株的全基因組序列，并構(gòu)建出了全長質(zhì)粒T7-Y2和3個輔助質(zhì)粒pVAX-NP、pVAX-P和pcDNA-L。通過病毒拯救，成功獲得了重組病毒Y2株，證明了人工合成毒株基因組序列及拯救獲得新病毒的可行性，為開展相關(guān)研究提供了新的思路，也為APMV-2的致病機理研究及新型禽用疫苗的研發(fā)提供了依據(jù)。