劉勃興，劉 暢，王利麗，付 祥，吳同壘，劉 潔，高榮菊，張志強(qiáng)*，史秋梅*

(1.河北科技師范學(xué)院 河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 秦皇島 066004；2.河北省唐山市樂亭縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，河北 唐山 063600)

牛病毒性腹瀉病毒(bovine viral diarrhea virus，BVDV)屬于黃病毒科瘟病毒屬單股RNA囊膜病毒[1-3]。我國(guó)BVDV最早發(fā)現(xiàn)于1980年[4]，給我國(guó)肉牛和奶牛養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。DIAO等[5]對(duì)1987—2019年國(guó)內(nèi)牛群中的BVDV進(jìn)行了Meta分析，發(fā)現(xiàn)我國(guó)牛群BVDV的感染率約為36.0%，其中，新疆地區(qū)BVDV感染率(67.5%)最高，西北地區(qū)樣品中BVDV抗原陽(yáng)性率最高。BVDV感染牛臨床可出現(xiàn)消化道、呼吸道、生長(zhǎng)繁殖異常等癥狀，病情嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致病牛死亡，還可以造成無(wú)任何示病癥狀但危害更大的持續(xù)感染(persistently infected，PI)，據(jù)估計(jì)，70%～90%的BVDV感染病例無(wú)臨床表現(xiàn)[6-8]。

BVDV的檢測(cè)方法大致可分為病原學(xué)檢測(cè)和血清學(xué)檢測(cè)兩類，其中BVDV抗體血清學(xué)檢測(cè)可輔助抗原檢測(cè)，有助于牛群中PI鑒定和評(píng)估接種疫苗牛群的免疫接種效果。目前BVDV的血清學(xué)檢測(cè)方法有ELISA、抗體中和試驗(yàn)和瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)等，其中ELISA是世界動(dòng)物衛(wèi)生組織推薦的BVDV檢測(cè)方法之一，也是在實(shí)驗(yàn)室診斷中的常用方法。我國(guó)BVDV抗體ELISA商品化檢測(cè)試劑盒的品牌和種類較少，導(dǎo)致BVDV抗體檢測(cè)成本較高。國(guó)內(nèi)對(duì)BVDV抗體ELISA檢測(cè)方法已開展了大量的研究，其中基于BVDV結(jié)構(gòu)蛋白E2[9-14]、Erns(E0)[9,15-17]這兩種囊膜蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白NS3[9,17]蛋白建立的間接ELISA方法居多，此外，抗BVDV納米抗體雙抗夾心ELISA[18]、PPA-ELISA[19]、Dot-ELISA[20]等ELISA類型也應(yīng)用于BVDV的抗體檢測(cè)。

為了解河北地區(qū)牛群BVDV抗體陽(yáng)性率，本研究構(gòu)建了BVDV HB-1株的Erns蛋白(gp48基因)的原核表達(dá)載體，并經(jīng)原核系統(tǒng)表達(dá)了Erns蛋白，以該蛋白為包被抗原建立BVDV抗體間接ELISA檢測(cè)方法，并應(yīng)用該方法檢測(cè)河北地區(qū)牛血清樣品的BVDV抗體陽(yáng)性率。

1 材料與方法

1.1 病毒株、質(zhì)粒和血清BVDV HB-1株，分離自河北肉犢牛腹瀉樣品，由本研究室保存；pET-28a質(zhì)粒、BVDV陽(yáng)性血清和陰性血清、牛傳染性鼻氣管炎病毒(IBRV)陽(yáng)性血清、牛布魯菌陽(yáng)性血清、牛輪狀病毒(BRV)陽(yáng)性血清、牛冠狀病毒(BCoV)陽(yáng)性血清、口蹄疫病毒(FMDV)陽(yáng)性血清均由河北省預(yù)防重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 引物的設(shè)計(jì)與合成根據(jù)BVDV HB-1株的Erns蛋白基因(gp48)序列，應(yīng)用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)用于Erns蛋白基因(gp48)擴(kuò)增的引物。E-BamHⅠ：5′-CGGGATCCGAGAACATAACGCA-ATGGAACTTGC-3′；E-SalⅠ：5′-GCGTCGACTGCATATGCCCCAAACCATGTC-3′。

1.3 主要試劑病毒RNA快速提取試劑盒購(gòu)自北京艾德萊科技有限公司；SalⅠ、BamHⅠ限制性內(nèi)切酶購(gòu)自NEB公司；明膠、牛血清白蛋白 BSA-V、IPTG、羊抗小鼠IgG-HRP購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；SDS-PAGE Gel Kit、eECL Western blot Kit、His-Taggde Protein Purification Kit購(gòu)自北京康為世紀(jì)(CWBIO)生物科技有限公司；兔抗牛IgG/HRP血清、鼠抗His tag antibody購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；Gel Extraction Kit、Plasmid Mini KitⅠ購(gòu)自美國(guó)OMEGA公司；BVDV ELISA抗體檢測(cè)試劑盒購(gòu)自愛德士(IDEXX)瑞士生物科技有限公司

1.4 Erns(gp48)基因的PCR擴(kuò)增、序列分析及原核表達(dá)載體構(gòu)建與鑒定用病毒RNA快速提取試劑盒提取感染BVDV HB-1的MDBK細(xì)胞培養(yǎng)物中的病毒RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板，用合成gp48擴(kuò)增引物進(jìn)行PCR并回收純化。將目的基因克隆至pMD19-T載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD19-T-gp48，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)，挑取單菌落用gp48基因擴(kuò)增引物進(jìn)行PCR檢測(cè)，陽(yáng)性菌落送至生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。從NCBI下載BVDV參考株的Erns基因序列并用Lasergene.v7.1中Editseq軟件翻譯為氨基酸序列，用Megalign軟件進(jìn)行同源性比對(duì)并建立發(fā)育進(jìn)化樹。在確認(rèn)獲得的gp48序列無(wú)移碼突變后，將pET-28a和pMD19-T-gp48質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ和SalⅠ雙酶切，回收目的片段構(gòu)建pET-28a-gp48重組載體，轉(zhuǎn)化至BL21感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含卡那霉素的LB培養(yǎng)基，挑取單菌落進(jìn)行雙酶切與測(cè)序鑒定。

1.5 重組Erns蛋白的原核表達(dá)、純化及Western blot鑒定將pET-28a-gp48/BL21接種于含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基在37℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)至D600 nm值為0.4～0.6，加入IPTG至終濃度為1 mmol/L，37℃誘導(dǎo)6 h，離心收集菌液，用PBS重懸菌泥超聲破碎，收集上清和沉淀，用SDS-PAGE鑒定重組蛋白的表達(dá)形式并用His-Taggde Protein Purification Kit純化蛋白。以鼠抗His tag antibody(1∶1 000)為一抗，羊抗小鼠IgG-HRP血清(1∶5 000)為二抗，Western blot鑒定重組蛋白。

1.6 BVDV抗體間接ELISA檢測(cè)方法的建立及優(yōu)化采用方陣滴定法確定。蛋白包被質(zhì)量濃度分別為每孔包被20，40，80，160，320 ng，血清按照1∶25，1∶50，1∶100，1∶200，1∶400進(jìn)行稀釋?；谏鲜龅淖罴褩l件，分別進(jìn)行包被條件(37℃包被0.5，1.0，1.5，2.0 h，4℃包被過夜)、封閉液(5%脫脂奶、2% BSA和1%明膠)、封閉時(shí)間(37℃封閉0.5，1.0，1.5，2.0 h)、血清孵育時(shí)間(37℃孵育0.5，1.0，1.5，2.0 h)、二抗稀釋度(1∶5 000，1∶10 000，1∶20 000，1∶40 000，1∶80 000)、二抗孵育時(shí)間(37℃孵育0.5，1.0，1.5，2.0 h)和顯色時(shí)間(37℃顯色5，10，15，20 min)的條件優(yōu)化。

1.10 重復(fù)性試驗(yàn)分別驗(yàn)證建立的ELISA方法的批內(nèi)和批間重復(fù)性。批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)：分別用同批次的重組Erns蛋白包被并封閉后的ELISA板檢測(cè)4份BVDV陽(yáng)性和4份BVDV陰性的牛血清；批間重復(fù)性試驗(yàn)：分別用重組Erns蛋白包被并封閉后1，14，28 d的ELISA板檢測(cè)BVDV陽(yáng)性和BVDV陰性的牛血清。每個(gè)血清做3個(gè)平行孔，測(cè)定D450 nm值，計(jì)算不同批次內(nèi)的變異系數(shù)(CV)，評(píng)估本研究建立的ELISA方法的批間重復(fù)效果。

1.11 與商品化試劑盒比較試驗(yàn)以建立的間接ELISA方法和IDEXX BVDV的ELISA抗體檢測(cè)試劑盒同時(shí)檢測(cè)河北某牛場(chǎng)的90份牛血清，比較2種方法檢測(cè)結(jié)果并計(jì)算符合率，計(jì)算方法見表1。

表1 符合率計(jì)算方法

1.12 臨床樣品的檢測(cè)用本研究建立的間接ELISA方法檢測(cè)河北地區(qū)牛場(chǎng)的血清樣品477份，統(tǒng)計(jì)并分析牛血清樣品的陽(yáng)性率。

2 結(jié)果

2.1 Erns(gp48)基因的PCR擴(kuò)增、序列分析及原核表達(dá)載體構(gòu)建與鑒定以提取的BVDV HB-1株感染細(xì)胞的RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，PCR擴(kuò)增gp48基因。結(jié)果顯示，在681 bp出現(xiàn)目的條帶，與預(yù)期結(jié)果一致(圖1A)。序列測(cè)定與比對(duì)分析結(jié)果顯示，BVDV HB-1株與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)國(guó)內(nèi)的BVDV-1型參考株的Erns氨基酸序列同源率為96.0%～99.1%，與國(guó)外BVDV-1型的Erns氨基酸序列同源率為92.4%～95.6%，與國(guó)內(nèi)外BVDV-2型的參考株Erns氨基酸序列同源率為79.1%～81.3%。進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示，BVDV HB-1株Erns氨基酸序列與國(guó)內(nèi)的BVDV-1型的Erns氨基酸序列屬于同一個(gè)大分支，且與相應(yīng)參考株距離較近，其次距離較近的BVDV株為國(guó)外的BVDV-1型參考株，而國(guó)內(nèi)外3株BVDV-2型的參考株處于另一個(gè)大分支且距離最遠(yuǎn)(圖2)。序列分析結(jié)果表明，BVDV HB-1株Erns氨基酸序列與國(guó)內(nèi)基因1型BVDV的同源性較高，具有作為診斷試劑研發(fā)實(shí)驗(yàn)材料的潛力。

M1.DL2000 DNA Marker;M2.DL5000 DNA Marker ;1.gp48 基因;2.陰性對(duì)照；3.pET-28a-gp48經(jīng) BamHⅠ/SalⅠ酶切產(chǎn)物;4.pET-28a

紅色代表本研究BVDV毒株；藍(lán)色代表國(guó)外BVDV毒株

構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET-28a-gp48經(jīng)BamHⅠ和SalⅠ雙酶切，得到約681 bp的基因片段和約5 300 bp的質(zhì)粒片段，與預(yù)期結(jié)果一致(圖1B)。測(cè)序結(jié)果顯示，基因序列無(wú)移碼、突變，表明成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-28a-gp48。

2.2 重組Erns蛋白的原核表達(dá)、純化及Western blot鑒定將pET-28a-gp48重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后用SDS-PAGE鑒定。結(jié)果顯示，在約33 kDa處有目的蛋白條帶，與預(yù)期蛋白大小一致，重組Erns蛋白以包涵體形式表達(dá)(圖3A)。用His-Taggde Protein Purification Kit純化蛋白，結(jié)果顯示，純化后僅在33 kDa出現(xiàn)目的條帶，無(wú)雜帶(圖3B)。Western blot鑒定結(jié)果顯示，在33 kDa處出現(xiàn)目的條帶(圖3C),表明成功獲得重組Erns蛋白，且試劑盒純化蛋白效果較好。

M.蛋白Marker;1.經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后菌體裂解物;2.菌體裂解物上清;3.菌體裂解物沉淀;4.陰性對(duì)照;5.純化前的Erns 蛋白;6.純化后的Erns 蛋白；7.陰性對(duì)照;8.重組 Erns

2.3 BVDV抗體間接ELISA檢測(cè)方法的建立及優(yōu)化以重組的Erns蛋白作為包被抗原建立的BVDV抗體間接ELISA檢測(cè)方法經(jīng)條件優(yōu)化試驗(yàn)，最終確定的Erns蛋白包被、封閉、血清、二抗(兔抗牛IgG/HRP血清)及顯色條件見表2。

表2 BVDV抗體間接ELISA檢測(cè)方法反應(yīng)條件優(yōu)化結(jié)果

2.4 臨界值的確定用優(yōu)化后的間接ELISA方法檢測(cè)臨床30份BVDV陰性血清，結(jié)果顯示，30份陰性血清D450 nm呈正態(tài)分布，經(jīng)計(jì)算臨界值為0.326，即待檢血清D450 nm高于0.326判定為陽(yáng)性，D450 nm低于0.326判定為陰性(圖4)。

圖4 30份陰性血清D450 nm的正態(tài)分布圖

2.5 特異性試驗(yàn)特異性試驗(yàn)結(jié)果顯示，除BVDV陽(yáng)性血清樣品(D450 nm=1.204)檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，其余病原陽(yáng)性血清檢測(cè)結(jié)果(D450 nm<0.326)均為陰性(圖5),表明本研究建立的間接ELISA抗體檢測(cè)方法具有較強(qiáng)特異性，能特異性檢測(cè)出BVDV陽(yáng)性血清。

圖5 特異性試驗(yàn)結(jié)果

2.6 敏感性試驗(yàn)用建立間接ELISA方法分別檢測(cè)不同稀釋度的BVDV陽(yáng)性血清。結(jié)果顯示，經(jīng)1∶1 600稀釋BVDV陽(yáng)性血清后檢測(cè)結(jié)果仍為陽(yáng)性(圖6)，表明本研究建立的間接ELISA抗體檢測(cè)方法具有較高的敏感性。

圖6 敏感性試驗(yàn)結(jié)果

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)用4份BVDV陽(yáng)性血清和4份BVDV陰性血清分別進(jìn)行批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗(yàn)。結(jié)果顯示，8份血清檢測(cè)數(shù)據(jù)的批內(nèi)CV為1.88%～9.61%，批間CV為0.82%～9.36%，重復(fù)性試驗(yàn)的CV均低于10%(表3)，表明本研究建立的間接ELISA抗體檢測(cè)方法具有較好的重復(fù)性。

表3 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果(n=8) D450 nm

2.8 與商品化試劑盒比較試驗(yàn)分別用建立的間接ELISA方法和IDEXX BVDV 的ELISA抗體檢測(cè)試劑盒對(duì)河北某牛場(chǎng)的90份牛血清進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示,IDEXX試劑盒檢出陽(yáng)性樣品72份，陰性樣品18份，本研究建立的方法檢出陽(yáng)性樣品72份，陰性樣品18份。2種方法的總符合率為93.33%，陽(yáng)性符合率92.00%，陰性符合率71.43%(表4)。結(jié)果表明，本研究建立的方法與IDEXX試劑盒符合率較高，具有較高的準(zhǔn)確性。

表4 與商品化試劑盒比較結(jié)果

2.9 臨床樣品的檢測(cè)結(jié)果應(yīng)用建立的間接ELISA方法檢測(cè)河北地區(qū)牛場(chǎng)的血清樣品。結(jié)果顯示，接種BVDV疫苗免疫牛場(chǎng)的牛血清樣品BVDV抗體檢測(cè)陽(yáng)性率為30.43%～92.86%，而未接種BVDV疫苗免疫牛場(chǎng)的牛血清樣品BVDV抗體檢測(cè)陽(yáng)性率為0%～100%(表5)，表明建立的BVDV抗體ELISA檢測(cè)方法能應(yīng)用于臨床樣品檢測(cè)。在接種疫苗免疫的牛場(chǎng)BVDV抗體陽(yáng)性率明顯高于未接種疫苗免疫的牛場(chǎng)，未接種BVDV疫苗免疫的牛場(chǎng)檢測(cè)出BVDV抗體陽(yáng)性血清，表明存在BVDV感染。

表5 臨床樣品檢測(cè)結(jié)果(n=477)

3 討論

BVDV-1b基因型是全球檢出率最高的BVDV基因型，在我國(guó)，該基因型也是BVDV主要流行的基因型之一，因此，該基因型常作為疫苗和診斷試劑的試驗(yàn)株。Erns是BVDV的囊膜蛋白之一，在病毒吸附宿主細(xì)胞、抑制宿主IFN的產(chǎn)生等方面有著重要的作用[21]。更重要的是，Erns可誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生中和抗體，據(jù)報(bào)道，在PI動(dòng)物的血清中Erns抗體質(zhì)量濃度可高達(dá)50 μg/L[22]。因此，Erns是BVDV疫苗和診斷試驗(yàn)研制的靶位蛋白之一。本試驗(yàn)BVDV HB-1株分離自河北肉犢牛腹瀉樣品，基因型為我國(guó)主要流行的基因型BVDV-1b，具有作為診斷試劑研發(fā)的潛力。進(jìn)一步對(duì)HB-1株的Erns氨基酸序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)BVDV HB-1株的Erns氨基酸序列與NCBI上國(guó)內(nèi)BVDV-1型的參考株同源率為96.0%～99.1%，同源性極高，可作為BVDV抗體ELISA檢測(cè)方法的包被抗原。因此，本研究構(gòu)建了pET-28a-gp48，在BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行原核表達(dá)，成功獲得了重組Erns蛋白。

本研究以重組Erns蛋白作為包被抗原建立BVDV抗體間接ELISA檢測(cè)方法。經(jīng)條件優(yōu)化試驗(yàn)，最終確定ELISA反應(yīng)條件：重組Erns包被質(zhì)量濃度為40 ng/孔，包被溫度和時(shí)間為4℃過夜；封閉液為1%明膠溶液，封閉時(shí)間為2 h(37℃)；血清稀釋倍數(shù)為100倍，血清孵育時(shí)間為1 h(37℃)；二抗稀釋倍數(shù)為40 000倍，二抗孵育時(shí)間為0.5 h(37℃)；顯色時(shí)間為10 min(37℃)；臨界值為0.326(D450 nm)。進(jìn)一步對(duì)該方法的特異性、靈敏度和重復(fù)性進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示：該方法能特異性識(shí)別BVDV陽(yáng)性血清和陰性血清，而對(duì)BRV、IBRV、FMDV、BCoV、牛布魯菌共計(jì)5種在牛常見的細(xì)菌和病毒性病原陽(yáng)性血清檢測(cè)結(jié)果均為陰性，表明該方法具有較好的特異性；當(dāng)血清經(jīng)1∶1 600稀釋后結(jié)果仍為陽(yáng)性，表明該方法具有較高的靈敏度；批內(nèi)和批間重復(fù)試驗(yàn)的CV均低于10%，表明該方法具有較好的重復(fù)性。用IDEXX的BVDV抗體檢測(cè)試劑盒與本研究中建立的方法同時(shí)檢測(cè)某牛場(chǎng)的血清樣品，2種方法的總符合率為93.33%，陽(yáng)性符合率92.00%，陰性符合率71.43%。在國(guó)內(nèi)同樣基于Erns蛋白建立的BVDV抗體ELISA檢測(cè)方法中，本研究建立的方法敏感性與肖盛中等[15]和丁金花等[16]建立方法的敏感性(1∶1 600)相同，比陳瑞紅[9]建立方法的靈敏度(1∶640)高；重復(fù)性上，本研究和研究報(bào)道[9，15-16]的重復(fù)性數(shù)據(jù)相似，批內(nèi)和批間CV均小于10%；與其他方法進(jìn)行符合試驗(yàn)，本研究(93.33%)高于肖盛中等[15](86%)、丁金花等[16](88.67%)、陳瑞紅[9](88.1%)建立的方法。但陰性符合率(71.43%)偏低，與陰性樣品數(shù)量少有關(guān)。

應(yīng)用建立的間接ELISA方法初步對(duì)河北地區(qū)18個(gè)牛場(chǎng)的477份血清樣品進(jìn)行檢測(cè)。其中，18個(gè)牛場(chǎng)中有4個(gè)奶牛場(chǎng)，且均接種了BVDV滅活疫苗(占比100%，4/4)，而僅有2家肉牛場(chǎng)接種疫苗(占比11.76%，2/14)。在接種疫苗的牛場(chǎng)中，抗體陽(yáng)性率為30.43% ～ 92.86%，表明在接種疫苗的牛場(chǎng)中，BVDV抗體陽(yáng)性率和抗體水平存有不同，部分牛場(chǎng)的抗體陽(yáng)性率低于50%，需及時(shí)補(bǔ)免。BVDV滅活疫苗在我國(guó)上市時(shí)間較短，應(yīng)用的范圍較小，但奶牛場(chǎng)對(duì)該病的預(yù)防接種意識(shí)明顯高于肉牛場(chǎng)。在未接種疫苗的14個(gè)肉牛場(chǎng)中，陽(yáng)性血清占比明顯低于接種免疫后的牛場(chǎng)，其中6個(gè)肉牛場(chǎng)的陽(yáng)性血清占比為0%，僅有1個(gè)承德肉牛場(chǎng)的陽(yáng)性血清占比達(dá)100%，其余陽(yáng)性血清占比均低于50%。在未接種BVDV疫苗的牛場(chǎng)中檢測(cè)到BVDV抗體，表明該場(chǎng)可能存在感染BVDV或PI牛，應(yīng)結(jié)合RT-PCR等檢測(cè)方法進(jìn)一步確認(rèn)這些牛場(chǎng)的肉牛是否存在BVDV感染。