姚璇 鐘丹妮 彭運聰

（1.廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院兒科，廣西南寧 530021；2.三江縣人民醫(yī)院兒科，廣西柳州 545500）

尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉移酶（uridine diphosphate‐glucuronosyl transferase，UGT） 是1 種重要的Ⅱ相藥物代謝酶，UGT大家族中的UGT1是由染色體2q37 的1個UGT1 位點編碼，包含了第1外顯子（A1‐A13）和4個共同外顯子（2～5），分別組成9 種亞型，UGT1A1 是其中1 種，并且目前研究發(fā)現(xiàn)UGT1A1是參與調控膽紅素結合反應唯一的關鍵酶［1-2］。UGT1A1基因發(fā)生突變，可能會導致酶活性降低甚至消失，使膽紅素正常代謝過程受阻，膽紅素積聚而引起新生兒高膽紅素血癥［3］。UGT1A1變異可能存在人種和地區(qū)差異。柳州三江縣是多民族聚居地，以侗族為主，并且新生兒高膽紅素血癥發(fā)病率較高。本研究通過檢測三江縣侗族新生兒熱門基因變異位點，了解三江縣侗族新生兒UGT1A1基因變異情況，探討UGT1A1基因變異與三江縣侗族新生兒不明原因高未結合膽紅素血癥的關系，以便為當?shù)匦律鷥狐S疸病因診斷及治療提供更多遺傳學依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象

前瞻性選取2021 年1 月至2022 年1 月于三江縣人民醫(yī)院新生兒科診斷不明原因高膽紅素血癥的新生兒84 例為研究對象。其中男51 例，女33例；胎齡≥37 周，日齡2～14 d；出生體重2.5～4.0 kg；三代純系侗族。根據(jù)2014年制定的《新生兒高膽紅素血癥診斷和治療專家共識》［4］，當總膽紅素值大于相應小時齡的膽紅素光療值，以間接膽紅素增高為主，可診斷高膽紅素血癥。排除標準：ABO或Rh血型不合所致溶血性疾病、葡萄糖‐6‐磷酸脫氫酶缺乏、紅細胞增多癥、嚴重敗血癥、頭顱血腫等體內出血、低出生體重兒、小于胎齡兒、早產(chǎn)兒、巨大兒、圍生期缺氧窒息、低血糖、甲狀腺功能減退、地中海貧血者予以排除。另選取同期在三江縣人民醫(yī)院產(chǎn)科出生的健康新生兒60例納入健康對照組，其中男36例，女24例；胎齡≥37周，日齡2～14 d；出生體重2.5～4.0 kg；三代純系侗族。住院觀察3～5 d 后出院并隨訪至生后2周，膽紅素水平未達到“光療”標準。該研究已獲得醫(yī)院倫理委員會批準（2021KY‐E‐286）。

1.2 DNA提取

取兩組新生兒外周血2 mL 以EDTA 抗凝，用血液基因組DNA 提取試劑盒（天根生化科技有限公司）提取基因組DNA，置-20℃保存。

1.3 PCR反應及電泳鑒定

根據(jù)課題組前期研究設計上游引物：5'‐GTCACGTGACACAGTCAAAC‐3'，下 游 引 物：5'‐AAGTAGGAGAGGGCGAACC‐3'［5］，擴增片段主要為UGT1A1啟動子區(qū)TATA 盒和外顯子1 的DNA 片段，片段長度999 bp。

PCR 體 系（總 體 積50 μL）： 2×Es Taq MasterMix 25 μL，上下游引物各2 μL，DNA 模板500 ng，無酶水補充至50 μL。PCR 程序：94℃預變性2 min；94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環(huán)30 次；72℃再延伸2 min。產(chǎn)物置于4℃保存。

2%瓊脂糖凝膠用Ⅰ型核酸染料染色，以DNA Marker 為分子量參照物，取PCR 產(chǎn)物5 μL，電壓120 V，電泳30 min。利用生物電泳圖像分析系統(tǒng)觀察DNA 電泳條帶。不符合要求的PCR 產(chǎn)物重新提取血液DNA，直至獲得電泳結果符合要求。

1.4 基因測序

經(jīng)電泳檢測過的所有合格的PCR 產(chǎn)物，送上海生工生物工程股份有限公司進行正向測序。應用Chromas軟件分析測序結果，測序結果比對基因文庫的UGT1A1基因序列，觀察波形，發(fā)現(xiàn)有堿基變異點的產(chǎn)物重新進行反向測序，以確保結果真實可靠。

1.5 統(tǒng)計學分析

用SPSS 20.0 軟件進行統(tǒng)計學分析。對符合正態(tài)分布的計量資料采用均數(shù)±標準差（±s）表示，兩組間比較采用成組t檢驗；計數(shù)資料采用率（%）或例數(shù)表示，對兩組等位基因頻率、基因型頻率比較采用卡方檢驗或Fisher 確切概率法；logistic回歸方程分析基因變異對新生兒高膽紅素血癥發(fā)生的影響因素；P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。采用SHEsis在線分析平臺進行Hardy‐Weinberg平衡檢驗［6］，P＞0.05為符合遺傳平衡。

2 結果

2.1 瓊脂糖凝膠電泳結果

經(jīng)PCR 擴增后得到的UGT1A1啟動子區(qū)TATA盒和外顯子1 的DNA 片段產(chǎn)物，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳結果呈單一條帶，PCR 擴增片段與目的片段長度（999 bp）相符，見圖1。

圖1 瓊脂糖凝膠電泳檢測結果 M為Marker；右側白色條帶為UGT1A1啟動子區(qū)TATA盒和外顯子1的DNA擴增片段（999 bp）。

2.2 一般情況

病例組與健康對照組的出生體重、胎齡、性別比較差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性，見表1。

表1 兩組新生兒一般資料比較

2.3 UGT1A1基因突變觀察結果

第1 外顯子區(qū)：在病例組中觀察到G71R 雜合突變30 例，純合突變3 例，突變頻率為39%（33/84）；在健康對照組觀察到雜合突變12 例，無純合突變，突變頻率為20%（12/60）。兩組均為錯義突變，具體情況詳見圖2。

圖2 UGT1A1 G71R（c.211G＞A）位點測序圖 箭頭所示為堿基突變位點。

2.4 兩組UGT1A1 基因突變類型分布及等位基因頻率分析

病例組UGT1A1G71R的AG基因型頻率顯著高于健康對照組（P=0.022），病例組UGT1A1G71R的A 等位基因頻率顯著高于健康對照組（P=0.010），見表2。

表2 兩組UGT1A1 G71R基因型及等位基因頻率的比較 ［例（%）］

2.5 UGT1A1 基因多態(tài)性對柳州三江縣新生兒高膽紅素血癥發(fā)生的風險評估

以是否發(fā)生高膽紅素血癥為因變量，是否發(fā)生UGT1A1G71R 突變?yōu)樽宰兞?，進行二元logistic回歸分析，結果顯示G71R錯義突變是新生兒發(fā)生高膽紅素血癥的危險因素，提示帶有G71R錯義突變（AA/AG）的新生兒發(fā)生高膽紅素血癥的風險是攜帶野生型（GG） 健康新生兒的2.588 倍（95%CI：1.199～5.586）。

2.6 UGT1A1 基因G71R 位點的Hardy‐Weinberg平衡檢驗

Hardy‐Weinberg 遺傳平衡檢驗結果顯示病例組和健康對照組的UGT1A1G71R 位點基因型均符合Hardy‐Weinberg 平衡（P＞0.05），說明人群代表性好，該基因位點基因型在研究人群中符合遺傳平衡。

3 討論

膽紅素是一種脂溶性激素，難溶于水，必須經(jīng)過肝臟生物轉化處理增加其水溶性再由膽汁等排出體外，UGT1A1是參與膽紅素代謝過程的關鍵酶，其基因5'端的第1外顯子編碼氨基末端，決定酶底物的特異性，3'端是4個共同外顯子，編碼羧基末端，是酶與膽紅素-尿苷二磷酸葡萄糖醛酸結合的位點。整個基因如果有發(fā)生變異，有可能會影響基因編碼的酶活性，從而影響膽紅素代謝，最終出現(xiàn)黃疸。截至目前，全球已發(fā)現(xiàn)163個變異位點［7］。此外，單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）位點變異對于mRNA穩(wěn)定性、氨基酸序列及酶的表達可能也存在影響。UGT1A1基因變異可能還具有人種和地區(qū)性差異。在高加索人種中，以羅馬尼亞和俄羅斯為例，UGT1A1變異以啟動子TATA 盒突變?yōu)橹?，分別有（TA）5、（TA）7和（TA）8［8-9］，而在黃種人中，例如中國和日本，UGT1A1變異則以G71R 突變?yōu)橹鳎?0-11］。除人種外還存在地區(qū)因素，例如同樣在亞洲大陸，地處南亞的印度UGT1A1變異主要表現(xiàn)為啟動子TATA 盒突變［12］，而在東亞的韓國則主要表現(xiàn)為G71R突變［13］。

G71R 突變?yōu)閁GT1A1基因第1 外顯子上的211位堿基出現(xiàn)G＞A 突變，使原編碼的氨基酸由甘氨酸變?yōu)榫彼?，導致UGT1A1葡萄糖醛酸化效率下降至野生型的47%［14］。本研究中病例組的G71R突變頻率（39%）高于廣西來賓地區(qū)（37.4%）［5］及那坡壯族地區(qū)（28.0%）［10］，略低于云南丘北少數(shù)民族縣（45%）［15］，說明G71R 是三江縣侗族新生兒高頻突變位點。病例組的A 等位基因頻率（21%）顯著高于健康對照組（10%）。上述結果均提示本研究人群UGT1A1基因的G71R 錯義突變與侗族新生兒膽紅素水平升高有關。另外Zhang等［16］的研究中侗族人群G71R 突變頻率則是18.9%，A等位基因頻率為9.9%，也進一步證實相同民族在不同地區(qū)基因突變頻率不同，這點可能是環(huán)境與遺傳因素共同作用的結果。結合logistic 回歸分析可認為UGT1A1G71R 突變型是廣西侗族新生兒發(fā)生高未結合膽紅素血癥的危險因素，攜帶突變體的侗族新生兒對高未結合膽紅素血癥有易感性。Hardy‐Weinberg遺傳平衡檢驗的結果提示該位點各基因型在研究人群中符合遺傳平衡，可能與該地區(qū)侗族提倡族內通婚（非近親婚配）有關，加上三江縣處于重山之中，自古交通往來不便，減少了與外來基因的交流，提示侗族G71R突變體的遺傳背景較為原始，遺傳信息上可能出現(xiàn)了遺傳穩(wěn)定性；另外在某些環(huán)境下，雜合子攜帶者或許比野生型攜帶者更適合當前的生存環(huán)境，這也可能是三江縣侗族新生兒中G71R雜合突變頻率較高的原因。因此G71R 錯義突變成為當?shù)囟弊錟GT1A1遺傳的高頻突變類型。

本次研究主要在UGT1A1啟動子區(qū)域及第1 外顯子，其余區(qū)域未涉及到，至于侗族新生兒是否存在其他高頻基因變異，有待擴大樣本進行下一步研究。本文研究的三江縣純系侗族新生兒UGT1A1基因變異情況對今后該地區(qū)制定UGT1A1高頻突變位點遺傳檢測和新生兒高膽紅素血癥發(fā)生早診斷、早治療有一定指導作用。