張璇 馬里程 孫龍嘯 張磊

腺樣囊性癌（ACC）又稱圓柱瘤或圓柱瘤型腺癌，ACC 占涎腺腫瘤的5%～10%，在涎腺惡性腫瘤中占24%。涎腺ACC（SACC）是生長(zhǎng)緩慢但惡性程度高的涎腺上皮性腫瘤，好發(fā)于腮腺、頜下腺、舌下腺以及腭腺等小涎腺，具有局部侵襲性強(qiáng)、血行性轉(zhuǎn)移率高、長(zhǎng)期預(yù)后差等典型生物學(xué)特征。鉑類藥物作為ACC 的一種治療方法已被廣泛探索，但收效甚微。研究表明，組蛋白去乙?；敢种苿℉DACi）-亞依洛尼酰胺異羥肟酸和順鉑（DDP）的聯(lián)合治療通過激活細(xì)胞衰老來消耗腫瘤干細(xì)胞并有效降低ACC 原代細(xì)胞的腫瘤活性。有研究表明，沉默長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA）X 非活性特異轉(zhuǎn)錄本（XIST）抑制非小細(xì)胞肺癌的生長(zhǎng)并提高DDP 藥物的敏感性。lncRNA XIST 參與了胃癌細(xì)胞耐藥的發(fā)生，而其在SACC 中的作用尚未見報(bào)道。有研究表明，在多種癌癥中miRNA（miR）- 429 表達(dá)下調(diào)，發(fā)揮抑癌作用，但其在ACC 中的作用未見報(bào)道。miR-429是參與口腔鱗癌DDP 耐藥的關(guān)鍵miRNA。本研究旨在探索干擾lncRNA XIST 是否能通過上調(diào)miR-429 來影響SACC 細(xì)胞的生長(zhǎng)和對(duì)DDP 的敏感性。

材料與方法

一、材 料

人SACC 細(xì)胞系SACC-83、ACC-2 和正常下頜下腺細(xì)胞HSG 均購于中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)學(xué)院細(xì)胞資源中心。1640 培養(yǎng)基、胎牛血清均購于Sigma 公司，TRIzol 購于Ambion 公司，RT 試劑盒購于TaKaRa 公司。Lipofectamine 2000 購于Invitrogen 公司，shRNA-XIST、 shRNA-NC、mimic-NC、miR-429 mimic、 NC inhibitor 和miR-429 inhibitor由廣州銳博生物科技有限公司合成。CCK-8 試劑盒、Quick Mutation基因定點(diǎn)突變?cè)噭┖泻蚑UNEL 試劑盒均購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司。雙螢光素酶報(bào)告基因載體、螢光素酶檢測(cè)試劑盒均購于Promega 公司?？贵w購于Cell Signaling Technology公司。

二、方 法

1. 細(xì)胞培養(yǎng)

將人SACC 細(xì)胞系SACC-83、ACC-2 和正常下頜下腺細(xì)胞HSG 以及DDP 耐藥 SACC-83/DDP細(xì)胞置于RPMI-1640 培養(yǎng)基中，加入 10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素和100 μg/mL 鏈霉素，放進(jìn)37 ℃、5% CO飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。親代的SACC-83 細(xì)胞持續(xù)暴露于DDP 12 個(gè)月，通過增加DDP 濃度從 0.5 μg/mL 直至細(xì)胞獲得10 μg/mL的耐藥性。

2. 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及實(shí)驗(yàn)分組

SACC-83 細(xì)胞和SACC-83/DDP 細(xì)胞中相關(guān)質(zhì)粒根據(jù)脂質(zhì)體2000 轉(zhuǎn)染試劑操作說明進(jìn)行轉(zhuǎn)染。在探究lncRNA XIST 對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和藥物敏感性的作用時(shí)，將兩種shRNA-XIST（shRNA-XIST#1：5′-GU GCGUACAGUGCUGUACAGCAU-3′，shRNA-XIST#2：5′-GCTGACTACCTGAGATTTAAG-3′）及其對(duì)照shRNA-NC（5′-UACGCUCAGCAUGUGUCACUC-3′）質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)SACC-83 細(xì)胞，分別記作SACC-83組、shRNA-NC 組、shRNA-XIST#1 組和shRNA-XIST#2組；將上述干擾效力更顯著的組別進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)、記作shRNA-XIST 組，并將shRNA-XIST 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)SACC-83/DDP 細(xì)胞，記作SACC-83/ DDP組、SACC-83/DDP+shRNA-NC組和SACC-83/DDP +shRNA-XIST 組； 將mimic-NC（5′-UUCUCCGAAC GUGUCACGUTT-3′）和miR-429 mimic（5′-UGCCAA AAUGGUCUGUCAUAAU-3′）轉(zhuǎn)染進(jìn)SACC-83 細(xì)胞，記作mimic-NC 組和miR-429 mimic 組；在探究lncRNA XIST 通過miR-429 對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和藥物敏感性的調(diào)節(jié)作用時(shí)，將shRNA-XIST 和miR-429 inhibitor（5′-ACGGUUUUACCAGACAGUAUUA-3′）及其對(duì)照（5′-CAGUACUUUUGUGUAGUACAAA-3′）轉(zhuǎn)染進(jìn)SACC-83 細(xì)胞，記作shRNA-XIST+ miR-429 inhibitor 組及shRNA-XIST+NC inhibitor 組。

3. 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測(cè)

采用TRIzol 試劑盒提取細(xì)胞中總RNA，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明合成cDNA。在ABI7500 qPCR 系統(tǒng)上根據(jù)SYBRGreen 核酸熒光染料進(jìn)行qPCR 檢測(cè)，記錄Ct 值。采用2法計(jì)算目的基因的RNA 水平。每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)操作3 次。

4. CCK-8 實(shí)驗(yàn)

將細(xì)胞接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，放進(jìn)細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據(jù)分組處理細(xì)胞后，分別在0、24、48 和72 h 加入CCK-8 溶液10 μL/孔，繼續(xù)放入培養(yǎng)箱中孵育2 h 后，在酶標(biāo)儀上設(shè)定波長(zhǎng)450 nm 檢測(cè)細(xì)胞的吸光值并繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，計(jì)算細(xì)胞活力=［（OD-OD）/ OD］×100%。每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)操作3 次。

5.克隆形成試驗(yàn)

在指定條件下處理細(xì)胞，并將其接種于12 孔板（100 個(gè)細(xì)胞/孔），培養(yǎng)2 周后，用0.05%結(jié)晶紫（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）染色細(xì)胞集落，并在熒光顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)操作3 次。

6. TUNEL 檢測(cè)

轉(zhuǎn)染48 h 后的細(xì)胞，加入50 μL 的TUNEL 反應(yīng)混合液，在黑暗室溫環(huán)境放置1 h。用DAB 染色后，再用蘇木精復(fù)染，沖洗，采用乙醇梯度脫水、二甲苯用來使玻片透明、封片。光學(xué)顯微鏡拍照計(jì)數(shù)。每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)操作3 次。

7. 蛋白免疫印跡法檢測(cè)

收集細(xì)胞，用PBS 清洗2 次，采用RIPA 溶液提取細(xì)胞中蛋白樣品并測(cè)定蛋白濃度。用SDSPAGE 分離20 μg 蛋白樣品，轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上封膜2 h，在4 ℃條件下孵育一抗（1∶1000）過夜。用TBST 洗膜3 次后，二抗（1∶2000）孵育1 h，ECL 發(fā)光試劑孵育PVDF 膜10～30 s 后立即放入ECL 成像儀中顯色。每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)操作3 次。

8. 雙熒光素酶報(bào)告檢測(cè)

使用脂質(zhì)體2000 轉(zhuǎn)染試劑將野生型和突變型lncRNA XIST 的熒光素酶表達(dá)載體（XIST WT 組和XIST MUT 組）與miR-429 mimic 及mimic-NC 分別轉(zhuǎn)染48 h 后，根據(jù)熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒操作說明進(jìn)行操作，并記錄結(jié)果。每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)操作3 次。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用GraphPad Prism 7.0 對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，均以 描述。多組間差異采用單因素和雙因素方差分析，采用Turkey進(jìn)行事后檢驗(yàn)。以P ＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、干擾lncRNA XIST 抑制SACC 細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡

RT-qPCR 檢測(cè)結(jié)果顯示，lncRNA XIST 在SACC細(xì)胞系中表達(dá)水平高于HSG 細(xì)胞（P ＜ 0.001，P =0.007，圖1A），以SACC-83 細(xì)胞表達(dá)水平最高，選其進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。與shRNA-NC 對(duì)照組相比，shRNA-XIST#1 組和shRNA-XIST#2 組lncRNA XIST 的表達(dá)水平降低（P = 0.001，P ＜ 0.001，圖1B），通過均值比較發(fā)現(xiàn)shRNA-XIST#2 組的抑制效果優(yōu)于shRNA-XIST#1 組（P = 0.020，圖1B），因此選取shRNA-XIST#2 組進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，并記作shRNA-XIST 組。CCK-8 法檢測(cè)結(jié)果顯示相對(duì)于shRNA-NC 對(duì)照組，shRNA-XIST 組在轉(zhuǎn)染48 h和72 h 后抑制細(xì)胞活力（P = 0.020，P ＜ 0.001，圖1C）；克隆形成試驗(yàn)結(jié)果顯示相對(duì)于shRNA-NC對(duì)照組，shRNA-XIST 組抑制了細(xì)胞增殖能力（P ＜0.001，圖1D）；TUNEL 檢測(cè)和蛋白免疫印跡法結(jié)果顯示相對(duì)于shRNA-NC 對(duì)照組，shRNA-XIST 組細(xì)胞凋亡率增加（P 均＜ 0.001，圖1E～H）。以上結(jié)果表明，敲降lncRNA XIST 可抑制SACC 細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡。

圖1 敲降lncRNA XIST 對(duì)SACC 細(xì)胞增殖和凋亡的作用

二、干擾lncRNA XIST 提高了SACC-83 對(duì)DDP的敏感性

RT-qPCR 檢測(cè)結(jié)果顯示，相對(duì)于SACC-83 組，SACC-83/DDP 組中l(wèi)ncRNA XIST 表達(dá)水平升高；相對(duì)于SACC-83/DDP+shRNA-NC 組，SACC-83/DDP+shRNA-XIST 組降低了細(xì)胞中的lncRNA XIST表達(dá)水平（P 均＜ 0.001，圖2A）。CCK-8 法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)用高于20 μg/mL 的DDP 分別干預(yù)SACC-83組和SACC-83/DDP 組細(xì)胞后，SACC-83/DDP 組的細(xì)胞活力高于SACC-83 組的細(xì)胞活力（P ＜ 0.001，圖2B）；而相對(duì)于SACC-83/DDP+shRNA-NC 組，SACC-83/DDP+shRNA-XIST 組抑制了高于40 μg/mL DDP 干預(yù)的細(xì)胞活力（P = 0.003，P = 0.008，圖2B）。TUNEL 檢測(cè)和蛋白免疫印跡法結(jié)果顯示，相對(duì)于SACC-83 組，SACC-83/DDP 組細(xì)胞凋亡率下降；相對(duì)于SACC-83/DDP+shRNA-NC 組，SACC-83/DDP+shRNA-XIST 組促進(jìn)細(xì)胞凋亡（P = 0.002，P ＜ 0.001，圖2C～2D）。以上結(jié)果說明敲降lncRNA XIST 促進(jìn)了SACC 細(xì)胞對(duì)DDP 的敏感性。

圖2 敲降lncRNA XIST 對(duì)SACC-83 DDP 敏感性的作用

三、 lncRNA XIST 與miR-429 相互作用

通過LncBase Predicted v.2 預(yù)測(cè)lncRNA XIST和miR-429 的結(jié)合位點(diǎn)（圖3A）。RT-qPCR 檢測(cè)結(jié)果顯示，在SACC-83 細(xì)胞中miR-429 表達(dá)水平低于HSG 細(xì)胞（P 均＜ 0.001，圖3B）。相對(duì)于mimic-NC 組，miR-429 mimic 組在SACC-83 細(xì)胞中miR-429 水平上調(diào)（P ＜ 0.001，圖3C）。XIST MUT或XIST WT 與miR-429 mimic 或mimic-NC 共轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，與mimic-NC+XIST WT 相比，miR-429 mimic +XIST WT 組熒光素酶活性降低，而mimic-NC+XIST MUT 組和miR-429 mimic +XIST MUT 組則無明顯差異（P ＜ 0.001，圖3D）。并且RT-qPCR結(jié)果顯示，相對(duì)于shRNA-NC 組，shRNA-XIST 組上調(diào)了miR-429 表達(dá)水平（P ＜ 0.001，圖3E）。上述結(jié)果表明，在SACC 細(xì)胞中l(wèi)ncRNA XIST 靶向負(fù)調(diào)節(jié)miR-429 的表達(dá)。

圖3 lncRNA XIST 與miR-429 相互作用

四、下調(diào)miR-429 表達(dá)逆轉(zhuǎn)了shRNA-XIST對(duì)SACC 細(xì)胞增殖的抑制作用

在SACC-83 細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-429 inhibitor，相對(duì)于NC inhibitor組成功敲降miR-429的表達(dá)（P ＜ 0.001，圖4A）。通過CCK-8 法和克隆形成試驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于shRNA-XIST+NC inhibitor 組， shRNAXIST+miR-429 inhibitor 組細(xì)胞活力在72 h 增加，增殖能力上升（P = 0.02，P ＜ 0.05，圖4B～4C）。TUNEL 檢測(cè)結(jié)果顯示，相對(duì)于shRNA-XIST+NC inhibitor 組，shRNA-XIST+miR-429 inhibitor 組細(xì)胞凋亡率下降（P ＜ 0.001，圖4D）。蛋白免疫印跡法結(jié)果顯示，相對(duì)于shRNA-XIST+NC inhibitor 組，shRNA-XIST+miR-429 inhibitor 組抗凋亡蛋白水平上升，促凋亡蛋白水平下降（P 均＜ 0.001，圖4E）。以上結(jié)果表明敲降miR-429 表達(dá)可以逆轉(zhuǎn)shRNAXIST 對(duì)SACC 細(xì)胞增殖的抑制作用。

圖4 shRNA-XIST 通過miR-429 對(duì)SACC 細(xì)胞增殖和凋亡的作用

五、下調(diào)miR-429 表達(dá)逆轉(zhuǎn)了shRNA-XIST對(duì)SACC 細(xì)胞DDP 敏感性

CCK-8 法檢測(cè)結(jié)果顯示，在用高于40 μg/mL的DDP處理細(xì)胞時(shí)，相對(duì)于SACC-83/DDP+shRNAXIST+NC inhibitor組，SACC-83/DDP+shRNA-XIST+miR-429 inhibitor 組促進(jìn)了細(xì)胞活力（P = 0.004，圖5A）。TUNEL 檢測(cè)結(jié)果顯示，相對(duì)于SACC-83/DDP+shRNA-XIST+NC inhibitor 組，SACC-83/DDP+shRNA-XIST+miR-429 inhibitor 組抑制了細(xì)胞凋亡水平（P = 0.008，圖5B～5C）。蛋白免疫印跡法結(jié)果顯示，相對(duì)于SACC-83/DDP+shRNA-XIST+NC inhibitor 組，SACC-83/DDP+shRNA-XIST+miR-429 inhibitor 組抗凋亡蛋白水平上升，促凋亡蛋白水平下降（P = 0.002，P = 0.029，P ＜ 0.001，圖5D）。以上結(jié)果表明敲降miR-429 表達(dá)可以逆轉(zhuǎn)shRNAXIST 對(duì)SACC 細(xì)胞的耐藥作用。

圖5 shRNA-XIST 通過miR-429 對(duì)SACC 細(xì)胞DPP 敏感性的作用

討 論

ACC 是一種發(fā)生在分泌腺內(nèi)的惡性腫瘤，最常見于頭頸部的唾液腺。SACC 起源于導(dǎo)管、肌上皮、基底細(xì)胞，約占主要唾液腺惡性腫瘤的25%，約50%位于小腺體，是一種特殊的惡性腫瘤以其緩慢但滲透式的增長(zhǎng)而聞名，沒有明顯的邊界。lncRNA 和microRNA 在各種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中均發(fā)揮著復(fù)雜而廣泛的作用，包括影響腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移、凋亡及藥物敏感性。本研究發(fā)現(xiàn)lncRNA XIST 在SACC 細(xì)胞中表達(dá)水平上調(diào)，影響腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和對(duì)DDP 的耐藥性。

XIST 是一種由XIST 基因編碼的lncRNA，在哺乳動(dòng)物中負(fù)責(zé)X 染色體失活。lncRNA XIST 參與腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲、遷移以及對(duì)化學(xué)治療和放射治療的抵抗，如胃癌、膀胱癌和甲狀腺癌等。同時(shí)沉默lncRNA XIST 抑制非小細(xì)胞肺癌和胃癌的生長(zhǎng)并促進(jìn)對(duì)DDP 的敏感性。而本研究發(fā)現(xiàn)，在SACC 細(xì)胞系中，敲降lncRNA XIST 表達(dá)可以抑制細(xì)胞活力、克隆形成并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，同時(shí)提高了細(xì)胞對(duì)DDP 的敏感性。

lncRNA XIST 被證明可以調(diào)節(jié)多種miRNA，如miR144-3p、miR-137、miR-367、let-7 和miR-92b，從而調(diào)節(jié)Notch-1、PXN、ZEB2、BAG-1、Smad7 等多種基因的表達(dá)。通過LncBase Predicted v.2 預(yù)測(cè)lncRNA XIST 能夠和miR-429 結(jié)合。有研究表明，miR-429 在多種癌癥中發(fā)揮抑癌作用，但在ACC中的作用尚未見報(bào)道。miR-429 在口腔鱗癌DDP耐藥中發(fā)揮重要的作用。本研究發(fā)現(xiàn)miR-429 在SACC 細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，且能夠被lncRNA XIST 靶向負(fù)調(diào)控，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)lncRNA XIST 可通過靶向miR-429 參與SACC 細(xì)胞的生長(zhǎng)并影響DDP藥物敏感性。

綜上所述，本研究表明lncRNA XIST 在SACC細(xì)胞增殖、凋亡和藥物敏感性中起重要作用，為治療SACC 提供了診斷和治療的潛在靶點(diǎn)。