萬(wàn)志平 楊小安 鄧洪

目前，非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是世界上慢性肝病的最常見(jiàn)原因，影響著全球近25%的人口。NAFLD 是指排除酒精和其他明確的肝損害所致的、以彌漫性肝細(xì)胞大泡性脂肪變性為主要特征的臨床病理綜合征。其疾病譜包括單純性肝臟脂肪變性（NAFL）、非酒精性脂肪性肝炎（NASH）、肝硬化以及肝細(xì)胞癌。NASH 的病理表現(xiàn)有肝細(xì)胞脂肪變性、氣球樣變，巨噬細(xì)胞活化浸潤(rùn)等。肝臟中的巨噬細(xì)胞群由肝巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞衍生的浸潤(rùn)性巨噬細(xì)胞組成，它們根據(jù)接收到的信號(hào)分化為M1 型或M2 型巨噬細(xì)胞，表達(dá)相應(yīng)的分子標(biāo)志物，以調(diào)節(jié)肝臟炎癥反應(yīng)。肝細(xì)胞脂肪變性是NAFLD 的早期事件也是NASH 發(fā)生及進(jìn)展的前提條件，而巨噬細(xì)胞的活化與NASH 的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。目前巨噬細(xì)胞活化的機(jī)制仍未完全闡明。近年細(xì)胞外囊泡（EV）引起了研究人員的廣泛關(guān)注。EV 是一種微小的膜囊泡，具有脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu)，直徑為30～150 nm。絕大多數(shù)細(xì)胞都能分泌EV，而且來(lái)自不同細(xì)胞類(lèi)型的EV 可以將特征性蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸轉(zhuǎn)運(yùn)到受體細(xì)胞，從而發(fā)揮不同的生物學(xué)效應(yīng)。細(xì)胞間的通信除旁分泌途徑外，還可以由EV 介導(dǎo)，因此不能忽視EV 在NASH 發(fā)生、發(fā)展中的作用。本文探討由脂肪變性肝細(xì)胞分泌的EV對(duì)巨噬細(xì)胞活化的影響，為深入理解EV 在NASH發(fā)生、發(fā)展中的作用提供理論基礎(chǔ)。

材料與方法

一、NASH 動(dòng)物模型的構(gòu)建

10 只6～7 周齡（體質(zhì)量180～200 g）的雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠購(gòu)自廣州中醫(yī)藥大學(xué)，飼養(yǎng)于溫度可控的無(wú)病原體環(huán)境中，光照/黑暗循環(huán)12 h，能自由獲取食物和水。經(jīng)過(guò)1 周的適應(yīng)性喂養(yǎng)后，SD 大鼠按體質(zhì)量匹配分為常規(guī)飲食組（Control 組，n = 5）和高脂肪高膽固醇（HFHCD）飲食組（HFHCD 組，n = 5），分別予常規(guī)飼料和HFHCD 飼料喂養(yǎng)。24 周后Control 組和HFHCD組大鼠禁食過(guò)夜，施以安樂(lè)死后收集它們的肝臟，并儲(chǔ)存在-80 ℃冰箱。所有的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均經(jīng)過(guò)中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)（批件號(hào)：IACUC-AEWC-F2008032），并符合《動(dòng)物研究：體內(nèi)實(shí)驗(yàn)報(bào)告（ARRIVE）指南》以及美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南。

二、細(xì)胞模型的構(gòu)建

人肝癌細(xì)胞系（HepG2 細(xì)胞）培養(yǎng)在含有10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中。當(dāng)HepG2 細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)到80%時(shí)，將細(xì)胞鋪至6 孔板，分別添加不同濃度的棕櫚酸（PA）。按PA 含量分為6 組，即0 mmol/L 組、0.1 mmol/L 組、0.2 mmol/L組、0.3 mmol/L 組、0.4 mmol/L 組和0.5 mmol/L 組。24 h 后用油紅O 染色劑（Servicebio）染色觀察細(xì)胞內(nèi)脂滴沉積的情況。對(duì)于細(xì)胞活力檢測(cè)，則將細(xì)胞鋪至96 孔板，24 h 后用CCK-8 檢測(cè)試劑盒（TargetMol）檢測(cè)6 組細(xì)胞的活力。

人單核巨噬細(xì)胞（THP-1 細(xì)胞）培養(yǎng)在含有10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基中，在THP-1細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)到80%時(shí)，將原培養(yǎng)基更換為含有100 ng/mL 的佛波酯中，24 h 后THP-1 將會(huì)貼壁成為M0 型巨噬細(xì)胞。

三、大鼠肝組織病理和免疫熒光染色

HFHCD 組和Control 組大鼠肝組織經(jīng)石蠟包埋后制作3～5 μm 厚的石蠟切片，然后將石蠟切片脫水并用HE（Servicebio）或 Masson（Servicebio）染色劑染色。油紅O 染色為從-80℃冰箱取出肝組織制備冰凍切片，隨后用油紅O 染色劑（Servicebio）染色并用蘇木素復(fù)染。免疫熒光染色為冰凍切片在進(jìn)行封閉后，與抗CD68（1∶50，Proteintech）和CD86（1∶50，Santa Cruz）的抗體在4℃下孵育過(guò)夜，然后與熒光標(biāo)記的二抗（1∶500，Invitrogen）在室溫下孵育60 min。最后，切片用4′, 6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色劑核染，再滴入抗猝滅劑進(jìn)行封片后鏡檢拍照。

四、EV 分離與鑒定

根據(jù)既往文獻(xiàn)［12-13］報(bào)道的方法，從HepG2細(xì)胞培養(yǎng)液中分離EV ：將培養(yǎng)液以300×g 離心10 min 和2000×g 離心20 min 以去除細(xì)胞和細(xì)胞碎片，然后再以10 000×g 離心30 min 去除大囊泡，最后將培養(yǎng)液以100 000×g 超速離心70 min后沉淀EV，并在磷酸鹽緩沖液（PBS）中洗滌純化EV。通過(guò)透射電子顯微鏡（JEM-1200EX）和納米粒子跟蹤分析（NanoSight NS300）鑒定分離的EV。將經(jīng)PA 干預(yù)Hep2 細(xì)胞培養(yǎng)液中分離的EV設(shè)為PA組，未經(jīng)PA 干預(yù)Hep2 細(xì)胞培養(yǎng)液中分離的EV 設(shè)為Con組。

五、蛋白質(zhì)提取和蛋白免疫印跡法檢測(cè)

使用含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA 緩沖液（Thermo Fisher Scientific）從細(xì)胞及分離的EV 中提取總蛋白（以細(xì)胞裂解液為對(duì)照），然后對(duì)樣品進(jìn)行凝膠電泳后，轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜（PVDF）膜上，分別在抗CD63（1∶1000，Immunoway）、CD81 （1∶1000，Immunoway） 和TSG101（1∶1000，Immunoway）的抗體中4 ℃孵育過(guò)夜。然后加入辣根過(guò)氧化物酶（HRP）偶聯(lián)的二抗（1∶10 000，Abcam）常溫孵育60 min 后，使用化學(xué)發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)觀察蛋白質(zhì)條帶。

六、EV 攝取實(shí)驗(yàn)

用紅色熒光染料PKH26 標(biāo)記脂肪變性肝細(xì)胞分泌的EV 后，將其添加至M0 型巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)基，6 h 后棄上清，PBS 洗滌之后用DAPI 染核，然后在倒置熒光顯微鏡下觀察EV 被M0 型巨噬細(xì)胞攝取的情況。

七、EV 干預(yù)實(shí)驗(yàn)

用BCA 試劑盒檢測(cè)提取的EV 濃度，然后將EV 添加至M0 型巨噬細(xì)胞培養(yǎng)基，使其工作濃度為50 μg/mL。并在干預(yù)48 h 后收集細(xì)胞，用定量逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-qPCR）和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)M1 型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)。

八、細(xì)胞共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)

將脂肪變性肝細(xì)胞（PA 干預(yù)后的HepG2 細(xì)胞）與M0 型巨噬細(xì)胞在Transwell 小室中共培養(yǎng)，同時(shí)加或不加EV 抑制劑GW4869（PA+GW4869組或PA 組），并設(shè)未經(jīng)PA 干預(yù)的對(duì)照組（Con 組及Con+GW4869 組）。在48 h 后收集巨噬細(xì)胞，檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)的表達(dá)。

九、RNA 提取和RT-qPCR 檢測(cè)

使用TRIzol RNA 抽提試劑（Invitrogen）用于提取細(xì)胞RNA。應(yīng)用PrimeScriptRT Master Mix 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa）將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為模板DNA 后，再使用TB Green Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒（TaKaRa） 進(jìn)行RT-qPCR 反應(yīng)， 反應(yīng)體系的配制以及反應(yīng)流程均參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。采用2法分析計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)水平。所用基因的引物序列如下：IL-1β 正向5′-ATGATGGCTTATTACAGTGGCAA-3′、反向5′-GT CGGAGATTCGTAGCTGGA-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度131 bp；IL-18正向5′-TCTTCATTGACCAAGGAAATCGG-3′、反向5′-TCCGGGGTGCATTATCTCTAC-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度75 bp；TNF-α 正向5′-AGCCCATGTTGTAGCAAACC-3′、反向5′-TGAGGTACAGGCCCTCTGAT-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度134 bp；β-actin 正向5′-TGTGGATCGGTGGCTCCA TCCT-3′、反向5′-AAACGCAGCTCAGTAACAGTCC GC-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度137 bp。

十、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)

巨噬細(xì)胞在室溫下在黑暗中用 PE 偶聯(lián)的抗CD86（eBiosciences）染色30 min。 隨后用含有2%胎牛血清的PBS 洗滌并重懸細(xì)胞，最后通過(guò)流式細(xì)胞儀分析CD86細(xì)胞的比例。原始數(shù)據(jù)通過(guò)CytExpert 軟件進(jìn)行分析。

十一、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、NASH 動(dòng)物模型中M1 型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)升高

用HFHCD 飼料喂養(yǎng)SD 大鼠24 周后，大鼠肝組織出現(xiàn)了明顯的脂肪堆積、肝細(xì)胞氣球樣變，并可見(jiàn)部分纖維化，表明NASH 動(dòng)物模型構(gòu)建成功，見(jiàn)圖1A～C。大鼠肝組織免疫熒光染色可見(jiàn)HFHCD 組CD68CD86細(xì)胞數(shù)較Control 組增多（t = 2.990，P = 0.017），表明NASH 肝臟內(nèi)M1 型巨噬細(xì)胞發(fā)生活化，見(jiàn)圖1D、E。

圖1 NASH 動(dòng)物模型中M1 型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)

二、脂肪變性肝細(xì)胞通過(guò)分泌EV 促進(jìn)M1 型巨噬細(xì)胞活化

分別用0～0.5 mmol/L 的PA 干預(yù)HepG2 細(xì)胞24 h 后進(jìn)行油紅O 染色，結(jié)果顯示0.3 mmol/L 以上的PA 可使HepG2 細(xì)胞發(fā)生明顯脂肪變性，即成功構(gòu)建了脂肪變性肝細(xì)胞模型，見(jiàn)圖2A。由于高濃度的PA 干預(yù)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞活力下降，通過(guò)分別測(cè)定0～0.5 mmol/L PA 干預(yù)后的HepG2 細(xì)胞活力（結(jié)果依次為100.0%、95.8%、93.4%、90.6%、86.8%和81.7%），表明0.3 mmol/L 最為合適（不低于90%），見(jiàn)圖2B。將脂肪變性肝細(xì)胞與M0 型巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)，同時(shí)加或不加GW4869，RTqPCR 結(jié)果可見(jiàn)PA 組M1 型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物IL-1β（q = 10.360，P ＜ 0.001）、IL-18（q = 6.441，P =0.008）較Con 組升高，而PA+GW4869 組的M1 型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物與Con+GW4869 組間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 均＞ 0.05），見(jiàn)圖2C。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)可見(jiàn)PA 組CD86細(xì)胞比例較Con 組升高（q= 4.428，P = 0.038），而PA+GW4869 組CD86細(xì)胞比例與Con+GW4869 組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞ 0.05），表明脂肪變性肝細(xì)胞能通過(guò)分泌EV促進(jìn)M1 型巨噬細(xì)胞活化，而EV 抑制劑可阻斷這種促進(jìn)作用，見(jiàn)圖2D、E。

圖2 脂肪變性肝細(xì)胞分泌的EV 對(duì)M1 型巨噬細(xì)胞活化的影響

三、脂肪變性肝細(xì)胞分泌的EV 特征

用0.3 mmol/L PA 干預(yù)HepG2 細(xì)胞24 h 后，收集細(xì)胞上清，提取EV 進(jìn)行鑒定。電鏡觀察可見(jiàn)Con組與PA組的EV 均呈典型的茶托杯狀囊泡結(jié)構(gòu)，見(jiàn)圖3A。粒徑分析結(jié)果顯示2 組的EV 大小主要為30～150 nm，但PA組EV 的直徑稍大于Con組（t = 7.631，P = 0.003），且濃度也高于Con組，見(jiàn)圖3B、C。另外，蛋白免疫印跡法顯示2 組提取物均表達(dá)EV 的標(biāo)志物CD63、CD81 和TSG101，表明脂肪變性肝細(xì)胞的上清液存在EV，并且能夠被提取，見(jiàn)圖3D。

圖3 脂肪變性肝細(xì)胞分泌的EV 特征

四、脂肪變性肝細(xì)胞來(lái)源的EV 促進(jìn)M1 型巨噬細(xì)胞活化

用紅色熒光染料PKH26 標(biāo)記EV，并添加至M0 型巨噬細(xì)胞培養(yǎng)基后，在熒光顯微鏡可觀察到紅色信號(hào)出現(xiàn)在M0 型巨噬細(xì)胞內(nèi)，表明M0 型巨噬細(xì)胞可成功吸收脂肪變性肝細(xì)胞來(lái)源的EV，見(jiàn)圖4A。進(jìn)一步RT-qPCR 結(jié)果可見(jiàn)PA組M1 型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物IL-1β（t = 21.280，P ＜ 0.001）、IL-18（t = 13.830，P ＜ 0.001）、TNF-α（t =20.840，P ＜ 0.001）均高于Con組，見(jiàn)圖4B。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)可見(jiàn)PA組CD86細(xì)胞比例高于Con組（t = 46.680，P ＜ 0.001），表明脂肪變性肝細(xì)胞分泌的EV 能促進(jìn)M1 型巨噬細(xì)胞活化，見(jiàn)圖4C、D。

圖4 脂肪變性肝細(xì)胞來(lái)源的EV 對(duì)M1 型巨噬細(xì)胞活化的影響

討 論

隨著人們生活方式和飲食結(jié)構(gòu)的改變，NAFLD 患病率明顯升高，已成為嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的公共衛(wèi)生問(wèn)題。NASH 是NAFLD 啟動(dòng)向嚴(yán)重肝損害進(jìn)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，但目前仍然缺乏有效的藥物治療NASH，如何預(yù)防NASH 發(fā)生并尋找潛在治療靶點(diǎn)是臨床關(guān)注的熱點(diǎn)。盡管從NAFL 發(fā)展為NASH 的潛在機(jī)制尚不明確，但越來(lái)越多的研究表明，巨噬細(xì)胞的活化是NASH 發(fā)生和發(fā)展的重要事件。在NAFLD 進(jìn)展過(guò)程中，肝細(xì)胞的脂肪變性往往早于巨噬細(xì)胞的活化，脂肪變性肝細(xì)胞的分泌物質(zhì)可能會(huì)促進(jìn)巨噬細(xì)胞的活化。

近年來(lái)，越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)EV 可以作為細(xì)胞間的通信媒介，在疾病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮極其重要的作用。作為細(xì)胞間的通信媒介，EV 可以有效保護(hù)mRNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等生物活性物質(zhì)并將其轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞中發(fā)揮其生物學(xué)功能。已有研究者發(fā)現(xiàn)EV 可作為NAFLD 肝臟內(nèi)多種細(xì)胞間交流的重要媒介。例如巨噬細(xì)胞可將具有抗纖維化作用的EV 轉(zhuǎn)移到肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞內(nèi)，抑制 NAFLD 相關(guān)的纖維化。脂毒性肝細(xì)胞釋放的EV 可以促進(jìn)肝星狀細(xì)胞的活化和增殖，從而加速代謝相關(guān)性脂肪肝疾病的進(jìn)展。

本研究在HFHCD 飲食構(gòu)建的NASH 動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)，HFHCD 組大鼠肝臟內(nèi)肝細(xì)胞發(fā)生脂肪變性，M1 型巨噬細(xì)胞的標(biāo)志物表達(dá)上升。進(jìn)一步構(gòu)建脂肪變性肝細(xì)胞模型并分離鑒定其分泌的EV，然后通過(guò)共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)?zāi)M肝內(nèi)環(huán)境，證實(shí)脂肪變性肝細(xì)胞分泌的EV 可以促進(jìn)M1 型巨噬細(xì)胞的活化。而在施以EV 抑制劑之后，這種促進(jìn)作用則會(huì)受到阻斷。

綜上所述，脂肪變性肝細(xì)胞在NASH 進(jìn)展中的炎癥反應(yīng)，部分是其分泌的EV 導(dǎo)致的。脂肪變性肝細(xì)胞分泌的EV 被肝巨噬細(xì)胞攝取之后，釋放其中的促炎物質(zhì)，導(dǎo)致M1 型巨噬細(xì)胞活化。而活化的M1 型巨噬細(xì)胞分泌各種促炎因子，加重NASH 的炎癥反應(yīng)，甚至?xí)碳れo止的肝星狀細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨母涡菭罴?xì)胞，從而導(dǎo)致纖維化的發(fā)生，推動(dòng)了NASH 的進(jìn)展。本研究進(jìn)一步說(shuō)明脂肪變性肝細(xì)胞分泌的EV 在促進(jìn)M1 型巨噬細(xì)胞活化加重NASH 進(jìn)展的潛在機(jī)制，為預(yù)防NASH 發(fā)生提供理論基礎(chǔ)。