朱玥 潘玨宇 王佩佩 李楠 朱彤波

(四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院免疫教研室，四川 成都 610041)

根據(jù)2019年全球癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，結(jié)腸癌為全球第三大癌癥，發(fā)病率為10.2%，死亡率為9.2%，僅次于肺癌[1]。KRAS屬于RAS基因家族，其突變廣泛存在于多種癌癥中，結(jié)腸癌患者中約40%含有KRAS突變[2]。雖然近年來針對KRASG12C的藥物篩選取得了一定的進(jìn)展，但其作用效果與作用機(jī)制仍未明確[3]。故尋找與KRAS有交互作用，可選擇性誘導(dǎo)攜KRAS突變結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的信號蛋白仍非常重要。PKCι屬于非典型性蛋白激酶C(atypical protein kinase C，aPKC)，可通過磷酸化絲氨酸/蘇氨酸從而激活下游多條信號通路，有研究證明aPKC的異常激活與結(jié)腸癌生成有密切關(guān)系[3-5]。 Yes相關(guān)蛋白1(Yes-associated protein 1,YAP1)是Hippo信號通路的關(guān)鍵信號分子。已有研究表明，YAP1在包括結(jié)腸癌在內(nèi)的多種癌癥中均存在異常升高的表達(dá)[6]，可促進(jìn)癌癥細(xì)胞生長、遷移、上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)并誘導(dǎo)干細(xì)胞特性[7-9]。本研究通過化學(xué)抑制劑或shRNA分別對結(jié)腸癌細(xì)胞中的KRAS、PKCι進(jìn)行抑制，并在mRNA、蛋白、細(xì)胞水平觀察YAP1等信號分子在結(jié)腸癌細(xì)胞中的變化，探討PKCι在攜KRAS突變的結(jié)腸癌細(xì)胞生長中的作用及其與Hippo信號通路的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及主要試劑 細(xì)胞株HCT116、RKO、293T為四川大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院免疫教研室貯存細(xì)胞?？贵w：PKCι(BD Biosciences)，GAPDH,YAP1(CST, Cell Signaling Technology)，PDL1(Abcam)。脂質(zhì)體Lipofectamine?2000、胎牛血清、凱基凋亡試劑盒購于成都溶海康華生物科技有限公司，RPMI-1640、DMEM、YQ培養(yǎng)基購自成都晨飛生物技術(shù)有限公司，ATM(Aurothiomalate)購自Sigma公司。逆轉(zhuǎn)錄及RT-PCR試劑盒購于成都微克生物技術(shù)有限公司。本研究所用引物均為上海生工有限公司合成。質(zhì)粒pLL3.7-prkci、pLL3.7-kras為本課題組前期構(gòu)建的重組質(zhì)粒，包裝質(zhì)粒PSPA×2、PMD2G為課題組貯存質(zhì)粒。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組 以攜KRAS突變的HCT116和不攜KRAS突變的RKO結(jié)腸癌細(xì)胞為研究對象，用慢病毒shRNA-prkci和PKCι活性抑制劑(ATM)分別處理上述兩種細(xì)胞，即慢病毒shRNA-prkci組、ATM組，分別與Control組和shRNA-Control比較并檢測相應(yīng)指標(biāo)并觀察其變化。

1.2.2 慢病毒的制備 使用YQ培養(yǎng)基，以5×106/mL的密度將293T細(xì)胞接種于100 mm2培養(yǎng)皿中。細(xì)胞培養(yǎng)12 h，將含有shRNA序列的重組質(zhì)粒以及包裝質(zhì)粒使用脂質(zhì)體Lipofectamine?2000轉(zhuǎn)入293 T細(xì)胞。48 h后收取上清液，4℃、3000 r/min，離心15 min；0.45 μm PVDF過濾器過濾，EP管分裝(1 mL/管)置于-80℃?zhèn)溆谩hRNA序列信息：shRNA-prkci: 5′-GGTTGTTCCTGGTCATTGAGTA-3′,shRNA-kras:5′-GCAGTTGAGACCTTCTAATTGG-3′。

1.2.3 細(xì)胞處理 以3×105/mL的密度接種細(xì)胞于六孔板。用ddH2O 配制ATM濃度為1 M，使用終濃度為0.1 mM ATM分別處理細(xì)胞36 h和48 h后,進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR(qRT-PCR)和WB 實(shí)驗(yàn)。同時用制備的慢病毒液感染HCT116和RKO細(xì)胞10 h后換液，收樣前觀察熒光強(qiáng)度為70%以上，表明感染成功。最后根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑谙鄳?yīng)的時間段內(nèi)處理收樣。

1.2.4 免疫印跡法(Western blot) 使用RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，使用碧云天BSA試劑盒定量后，加入Loading buffer，金屬浴100℃煮樣10 min，使蛋白變性。電泳條件為80 V 30 min后調(diào)節(jié)電壓為120 V，繼續(xù)1 h。轉(zhuǎn)膜條件為300 mA 1.5 h，使用0.22 μm孔徑PVDF膜。5%脫脂牛奶室溫封閉1 h。一抗封閉4℃過夜，二抗室溫孵育1 h，使用TBST洗滌三次(5 min/次)后曝光檢測。

1.2.5 qRT-PCR檢測 采用Trizol法(Invitrogen)提取細(xì)胞總RNA，使用RT reagentKit with Gdna Eraser試劑盒逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。使用TB green Premix Ex Taq試劑盒于實(shí)時熒光PCR儀上檢測靶基因的相對表達(dá)量，引物序列見表1。

表1 qPCR引物序列

1.2.6 Annexin V-FITC/PI 標(biāo)記凋亡細(xì)胞 使用不含EDTA胰酶將細(xì)胞消化后，PBS洗3次(PBS需提前預(yù)冷)，每管的染料配方為500 μL 1×buffer+5 μL Annexin V-FITC/PI，使用染料混合液重懸細(xì)胞后，冰上避光孵育15 min；上機(jī)檢測。

1.2.7 免疫熒光技術(shù)及共聚焦顯微鏡成像分析 將處理后的細(xì)胞移除培養(yǎng)基，4%多聚甲醛固定15 min，去除固定液后0.3% Tritonx-100通透10 min，5%BSA封閉1 h，封閉完成后依次孵育一抗2 h、二抗1 h，移除二抗后以1 μg/mL DAPI溶液染核5 min，移除DAPI溶液后封片，共聚焦顯微鏡觀察拍照。

2 結(jié)果

2.1 PKCι的抑制可誘導(dǎo)KRAS突變結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡 與對照組凋亡率3%相比，PKCι抑制劑ATM處理可使HCT116凋亡率升高至16%左右，同樣，在使用shRNA抑制PKCι表達(dá)后，HCT116凋亡率由6%升高至10%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而對于不攜KRAS突變的RKO細(xì)胞，對照組、ATM處理組與shRNA對照組、處理組凋亡率分別為6%、7%、8%、9%左右，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖1。

圖1 流式細(xì)胞儀檢測抑制PKCι對KRAS突變結(jié)腸癌細(xì)胞生長的影響

2.2 PKCι可影響KRAS突變結(jié)腸癌細(xì)胞的YAP1表達(dá)水平 Western blot(圖2A)與免疫熒光(圖2B)實(shí)驗(yàn)均證明，在HCT116細(xì)胞中，ATM抑制PKCι活性，可顯著下調(diào)YAP1的表達(dá)(P<0.05) ；而在不攜帶KRAS突變的RKO細(xì)胞中這些抑制作用則不明顯，提示在KRAS突變的結(jié)腸癌細(xì)胞中，YAP1的表達(dá)水平及活性可能受PKCι調(diào)控。

圖2 抑制PKCι對KRAS突變結(jié)腸癌細(xì)胞YAP1表達(dá)的影響

2.3 PKCι-YAP1信號軸受KRAS調(diào)控 在攜KRAS突變的HCT116細(xì)胞中使用shRNA抑制PKCι表達(dá)后，可顯著抑制YAP1表達(dá)水平(P<0.05)；且KRAS表達(dá)被敲低后，PKCι與YAP1的表達(dá)均明顯下調(diào)(圖3)。提示在KRAS突變結(jié)腸癌細(xì)胞中，PKCι可影響YAP1的表達(dá)，且PKCι與YAP1均受到KRAS的調(diào)控。突變的KRAS通過激活PKCι-YAP1信號以維持結(jié)腸癌細(xì)胞生長。

圖3 PKCι-YAP1信號軸受KRAS調(diào)控

3 討論

結(jié)腸癌是世界上發(fā)病率最高，致死率最高的癌癥之一，攜KRAS突變的結(jié)腸癌患者占結(jié)腸癌患者的40%[2-3]，KRAS作為致瘤子基因與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展[4-6]，調(diào)節(jié)細(xì)胞糖酵解過程[7]以及對表皮生長因子受體(EGFR) 抑制劑耐藥性有顯著相關(guān)性[10]，導(dǎo)致KRAS突變患者預(yù)后不良比例較高，常被作為預(yù)后不良的標(biāo)志[11]。目前針對KRAS突變的藥物篩選有了長足的進(jìn)步，針對KRASG12C的抑制劑已經(jīng)進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)階段[12-13]，但是其作用效果與安全性還有待進(jìn)一步闡明，針對KRAS突變腫瘤下游信號通路中與KRAS有交互作用信號蛋白的研究仍有重要意義。

蛋白激酶C(PKC) 是一個結(jié)構(gòu)相關(guān)的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族，在細(xì)胞增殖遷移以及維持細(xì)胞功能中起到重要的作用[14-15]。其中PKCι屬于非典型性PKC(aPKC) 家族的一員，在結(jié)腸癌中有顯著上調(diào)，在促進(jìn)腫瘤的形成與發(fā)展過程中起著重要的作用[16-17]。PKCι的表達(dá)水平與KRAS突變在肺腺癌(LAC)與胰腺導(dǎo)管癌(PDCA) 中有顯著的相關(guān)性[18-20]。在本研究中，發(fā)現(xiàn)KRAS突變的結(jié)腸癌細(xì)胞中PKCι表達(dá)水平明顯上升，在使用ATM或shRNA抑制PKCι的表達(dá)后，可特異性的誘導(dǎo)攜KRAS突變的結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡，證明KRAS突變與PKCι表達(dá)相關(guān)性在結(jié)腸癌中同樣存在。

YAP1是Hippo信號通路中的一個重要分子，可上調(diào)與細(xì)胞增殖、重編程、干細(xì)胞特性、上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化、以及抗凋亡相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子[21-24]，在腫瘤的發(fā)生與維持過程中起到重要的作用。YAP1可通過誘導(dǎo)ERK通路激活，通過調(diào)控AXL使癌細(xì)胞對于EGFR-TKI產(chǎn)生耐藥，這與KRAS突變導(dǎo)致的EGFR耐藥有著高度相似性，提示YAP1與KRAS突變之間存在某種聯(lián)系[25]。本研究的前期研究中發(fā)現(xiàn)在PDCA中KRAS突變可導(dǎo)致PKCι的表達(dá)水平的異常升高，PKCι的異常升高可抑制LATS導(dǎo)致YAP1的去磷酸化在細(xì)胞核中積累，從而起到激活多種轉(zhuǎn)錄因子促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長的作用[26]。本研究顯示，在KRAS突變結(jié)腸癌抑制PKCι同樣可導(dǎo)致YAP1的明顯下調(diào)以及細(xì)胞凋亡，提示KRAS突變條件下，PKCι對YAP1的調(diào)控在結(jié)腸癌中同樣存在。

本研究證明了在結(jié)腸癌細(xì)胞中PKCι為Hippo信號通路的調(diào)控因子，并影響YAP1分子的表達(dá)以及在其促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖的相關(guān)目標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄。同時PKCι與YAP1的表達(dá)增加以及PKCι對YAP1的調(diào)控依賴于KRAS在結(jié)腸癌中的突變。

4 結(jié)論

本研究選用攜KRAS突變HCT116和不攜KRAS突變的RKO結(jié)腸癌細(xì)胞株作為腫瘤細(xì)胞模型，通過shRNA敲低和使用活性抑制劑兩種處理方式從mRNA水平和蛋白表達(dá)水平等層面對KRAS、PKCι和YAP1之間調(diào)控關(guān)系的研究，最終發(fā)現(xiàn)PKCι、YAP1為KRAS突變結(jié)腸癌的潛在治療靶點(diǎn)，為KRAS突變結(jié)腸癌的藥物開發(fā)與治療提供了新的思路。