尹亞玲，姚藝新，王曉曉*，李祥蘭，孫 刻

(1.德陽市食品藥品檢驗檢測中心，四川 德陽 618000；2.康美藥業(yè)股份有限公司，廣東 普寧 515300)

赤芍為毛茛科植物芍藥PaeonialactiforcPali.或川赤芍PaeoniaveitchiiLynch的干燥根，具有清熱涼血、散瘀止痛的功效[1]?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，赤芍主要含有芍藥苷等為代表的單萜苷類，此外，還含有酚類、鞣質(zhì)和黃酮等化合物[2-3]。近年來，赤芍被廣泛應(yīng)用于治療心血管系統(tǒng)疾病，還具有抗腫瘤、保肝、鎮(zhèn)痛、降壓、抗?jié)兊人幚碜饔肹4-7]。目前的研究中，關(guān)于赤芍有效成分、指紋圖譜和藥理作用的研究較多，但關(guān)于赤芍中無機元素的研究報道較少。

無機元素雖然不是中藥治療疾病的主要藥效物質(zhì)，但卻對有效成分的積累和藥效的發(fā)揮起著重要的作用。高濃度的鎘處理對丹參有效成分的積累有一定的促進作用，適度的缺乏Cu和K可促進蒼術(shù)次生代謝產(chǎn)物的積累[8-11]。Zn、Ca和Fe元素是止血類中藥的共同特征無機元素；K和Mg元素能夠影響活血化瘀藥的藥性；Fe和Mn元素的含量差異是“寒涼溫熱”的藥性物質(zhì)基礎(chǔ)等[12-14]。因此，明確中藥中無機元素的組成和含量可為中藥的質(zhì)量評價提供科學(xué)依據(jù)。本研究擬以中江種植的赤芍作為研究對象，采用ICP-MS測定其中24種無機元素的含量，探索其無機元素的分布規(guī)律，為赤芍中無機元素組成和藥效關(guān)系研究提供參考。

1 儀器與試劑

電子天平(SX205，MS205DU，max=220 g/121 g，d=0.01 mg，梅特勒-托利多有限公司)；KQ-700DV數(shù)控超聲清洗儀(昆山市儀器超聲有限公司)；CEM微波消解儀(奧地利安東帕公司)；電熱消解儀(EHD-24，北京東航科技儀器有限公司)；ICP-MS 7900電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(安捷倫科技有限公司)。

多元素標準溶液(Al、As、Ba、Be、Ca、Cd、Co、Cr、Cs、Cu、Fe、Ga、Hg、K、Li、Mg、Mn、Na、Ni、Pb、Rb、Se、Sr、Ti、V、Zn)(100 μg·mL-1)由國家有色金屬及電子材料分析測試中心提供。Bi、Ge、In、Li、Sc和Tb的混合內(nèi)標溶液(安捷倫有限公司，10 μg·mL-1)，硝酸為離子級(成都市科隆化學(xué)品有限公司)；超純水由優(yōu)普超純水器(ULPHW-111-10T型，四川優(yōu)普超純科技有限公司)制備。37份藥材樣品均從四川中江縣集鳳鎮(zhèn)和石泉鄉(xiāng)采集，經(jīng)李茂森主任中藥師鑒定為毛茛科植物芍藥PaeonialactifloraPall.的根，樣品信息見表1。

表1 37份赤芍樣品來源

2 方法

2.1 多元素混合對照品溶液的制備

根據(jù)樣品中無機元素的水平分別配制三個水平濃度的混合對照溶液。用多元素混合標準母液，以5%優(yōu)級純HNO3為介質(zhì)配制質(zhì)量分數(shù)為0、0.5、2、5、10、20 ng·mL-1的溶液，供測定Hg使用；用質(zhì)量分數(shù)為0、5、20、50、80、120 ng·mL-1的溶液，供測定Ti、V、Co、Cu、Ga、As、Se、Rb、Cd、Pb用；其余無機元素供質(zhì)量分數(shù)為0、20、50、100、200、500 ng·mL-1的對照溶液使用。配制好的對照品溶液均過0.45 μm的微孔濾膜。

2.2 內(nèi)標溶液的制備

精密量取混合內(nèi)標液適量，用水稀釋制成每1 mL各含200 ng的混合溶液，即得。

2.3 ICP-MS的測定條件

等離子射頻功率1 550 W，等離子氣體15 L·min-1，輔助氣體流量1.03 L·min-1，霧化氣流量1.03 L·min-1，補償/稀釋氣體1 L·min-1，霧化室溫度2 ℃，蠕動泵速度0.1 rps。采樣深度8.0 mm，積分時間1 s，延遲時間1 s，重復(fù)次數(shù)3次；測量方式：標準曲線法；讀數(shù)方式：峰強。以73Ge、115In、209Bi為內(nèi)標，監(jiān)測信號的變動情況，能有效克服儀器信號的漂移和校正基體效應(yīng)。

2.4 供試品溶液制備

取赤芍樣品粉末0.2 g(過5號篩)，精密稱定，倒入聚四氟乙烯消解罐中，置于通風櫥，加入濃硝酸8 mL，放置過夜。第2天放入微波消解儀中，按設(shè)定的消解程序處理：先經(jīng)10 min由室溫升至130 ℃，并維持5 min消解，然后10 min由130 ℃升至165 ℃，并維持10 min消解，然后15 min由165 ℃升至180 ℃，并維持40 min消解。消解完畢后，冷卻至室溫，取出消解罐，在通風櫥中將消解罐中液體揮發(fā)至2～3 mL，轉(zhuǎn)移，用去離子水定容至50 mL。同步以濃硝酸8 mL做空白試驗，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾后上機測定。

2.5 標準曲線繪制

取多元素的混合標準品母液，依次測定24種無機元素的系列質(zhì)量濃度標準溶液，內(nèi)標進樣管始終插入內(nèi)標溶液。以標準品質(zhì)量濃度為橫坐標(X)，以重金屬元素分析峰信號值與內(nèi)標元素參比峰響應(yīng)值的比值為縱坐標(Y)，繪制標準曲線，得無機元素標準品的回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍。結(jié)果各無機元素在對應(yīng)范圍內(nèi)線性良好，詳見表2。

表2 24種無機元素標準曲線

2.6 樣品的重金屬元素測定

按照“2.4”項下方法制備供試品溶液。在設(shè)定的實驗條件下，測定37份樣品中24種無機元素的含量，結(jié)果采用SPSS 22.0進行統(tǒng)計分析。在方法學(xué)考察方面，參考項目組已發(fā)表的文章[15-16]。

3 結(jié)果與分析3.1 赤芍中無機元素的測定結(jié)果

赤芍中含有豐富的無機元素，其中24種無機元素的含量差異較大，根據(jù)無機元素在體內(nèi)的含量高低，可分為常量元素和微量元素。常量元素中，K的平均含量最高，質(zhì)量分數(shù)為3 797.10 mg·kg-1；其次含量較高的為Ca(1 041.17 mg·kg-1)、Mg(985.55 mg·kg-1)和Na(450.64 mg·kg-1)。微量元素中含量最高的是Fe(696.48 mg·kg-1)，其次是Cr(117.11 mg·kg-1)、Al(106.18 mg·kg-1)、Sb(86.05 mg·kg-1)；含量最低的是Hg(0.004 7 mg·kg-1)。

就重金屬而言，平均含量由高到低依次為Cu、Pb、As、Cd、Hg。在測定的37份赤芍樣品中，Cu在4.94～10.90 mg·kg-1，均值7.56 mg·kg-1；Pb在0.26～2.03 mg·kg-1，均值為0.80 mg·kg-1；As在0.12～2.00 mg·kg-1，均值為0.54 mg·kg-1；Cd在0.01～0.83 mg·kg-1，均值為0.26 mg·kg-1；Hg在0.001 0～0.021 6 mg·kg-1，均值為0.004 7 mg·kg-1。參照《中草藥重金屬限量國際標準ISO 18664：2015》以及《藥用植物及制劑進出口綠色行業(yè)標準》規(guī)定重金屬的限量標準，Pb≤5.0 mg·kg-1，Cd≤0.3 mg·kg-1，Hg≤0.2 mg·kg-1，As≤2.0 mg·kg-1，Cu≤20.0 mg·kg-1。37份赤芍樣品中，有12份樣品的Cd超標，超標率達33%，結(jié)果見表3。

表3 赤芍中24種無機元素的質(zhì)量分數(shù) (mg·kg-1)

續(xù)表3(mg·kg-1)

3.2 赤芍特征圖譜的建立

為了便于元素之間含量的比較分析，把一些無機元素含量差異極大的原始值同時擴大或縮小相同倍數(shù)至同一數(shù)量級，24種無機元素的相對含量略有差異，但其整體無機元素分布規(guī)律卻呈現(xiàn)相似的分布態(tài)勢。故質(zhì)量分數(shù)分布圖可作為赤芍的無機元素特征圖譜，見圖1、圖2。

圖1 37份赤芍中24種無機元素的特征圖譜

圖2 赤芍中24無機元素的平均特征圖譜

3.3 無機元素間相關(guān)性分析

無機元素之間存在一定的相互作用，在一定程度上能夠起到相互協(xié)同或拮抗的作用。為明確赤芍中具體的無機元素作用關(guān)系，本研究對24種無機元素含量進行了相關(guān)性分析。在正態(tài)性檢驗結(jié)果中僅Mg、Al、V、Cu、Zn、Se、Rb和Sr含量服從正態(tài)分布，因此采用Spearman等級相關(guān)系數(shù)法計算元素間相關(guān)系數(shù)；其中76對元素呈極顯著的正相關(guān)(P<0.01)：Sr與Na；Al、K、V、Mn、Co、Cu、Zn、Ga、As、Rb、Sr、Pb與Mg，Ti、V、Cr、Mn、Fe、Co、Cu、Zn、Ga、As、Rb、Pb與Al；Ca、V、Zn、Sr與K，Sr與Ca；V、Cr、Fe與Ti；Cr、Fe、Co、Zn、Ga、As、Pb與V；Fe、Co、Zn、Ga、As、Pb與Cr；Co、Ni、Zn、Se、Rb與Mn；Co、Ga、As、Pb與Fe；Cu、Zn、Ga、As、Se、Rb、Pb與Co；Se、Cd 與Ni；Zn、As、Rb與Cu；Ga、As、Rb、Sr、Pb 與Zn；As、Rb與Ga；As與Pb；Sr、Cd與Se。21對元素呈顯著正相關(guān)(P<0.05)：Cd-Na、As-K、Pb-K、Ca-Sb、Ca-Pb、V-Cu、Mn-Cr、Cu-Cr、Ba-Cr、Cu-Mn、As-Mn、Rb-Mn、Cd-Mn、Pb-Mn、Sr-Ni、Hg-Ni、Ga-Cu、Pb-Cu、Zn-Pb、Ba-Se、Pb-Ba。1對元素Na-Ti呈極顯著負相關(guān)(P<0.01)，4對元素Na-Fe、Ca-Cd、V-Cd、Fe-Cd呈顯著負相關(guān)(P<0.05)。正相關(guān)表明赤芍樣品中上述元素在被吸收累積過程中具有很好的協(xié)調(diào)作用；而負相關(guān)表明上述5對元素在被吸收積累過程中具有拮抗作用。見表4。

表4 24種無機元素的相關(guān)性分析

3.4 無機元素的主成分分析

為了研究赤芍樣品中各元素的分布規(guī)律，本研究對24個元素進行了主成分分析，前7個主成分的特征值均>1，且累積貢獻率達85.176%>80%，可以代表赤芍無機元素的整體信息，客觀反映樣品中無機元素的內(nèi)在質(zhì)量，故選擇前7個主成分因子進行分析。表5是經(jīng)方差最大正交旋轉(zhuǎn)后的因子載荷矩陣，用以鑒別有實際意義的因子。從中可以看出，與第1主成分密切相關(guān)的是元素Al、V、Fe，與第2主成分密切相關(guān)的是Ga、Ni、Co，并且系數(shù)都超過0.8，與第3、4、5、6、7主成分密切相關(guān)的無機元素分別是Se、Ca、Ti、Sb、Hg、Ba。因此，選擇Al、V、Fe、Ga、Ni、Co、Se、Ca、Ti、Sb、Hg和Ba作為赤芍的特征無機元素，即赤芍無機元素組成特征的構(gòu)成要素。見表6。

表5 主成分初始特征值和累積貢獻率

表6 旋轉(zhuǎn)的成分矩陣

4 討論

本研究采用ICP-MS法測定赤芍共37批次樣品中24種無機元素，明確了赤芍中無機元素的分布規(guī)律。赤芍以常量元素K、Mg、Ca、Na等較豐富，微量元素以Fe、Al、Cr、Sb等較為豐富。24種無機元素的相對含量存在一定的差異，但其整體無機元素分布規(guī)律卻呈現(xiàn)相似的分布態(tài)勢，故質(zhì)量分數(shù)分布圖可作為赤芍的無機元素特征圖譜。在相關(guān)性分析中，多數(shù)無機元素呈正相關(guān)，說明元素在被吸收累積過程中具有很好的協(xié)調(diào)作用；少量無機元素呈負相關(guān)，表明無機元素在被吸收積累過程中具有拮抗作用。此外，通過主成分分析，得出Al、V、Fe、Ga、Ni、Co、Ca、Ti、Sb、Hg和Ba為赤芍的特征無機元素。

無機元素的存在對中藥臨床療效有重大的影響作用，一方面直接參與調(diào)節(jié)人體的必須元素，影響機體功能，發(fā)揮不同功效。K、Mg、Na和Ca是人體必需的常量元素，F(xiàn)e、Se、Cr、Co、Ni、Ga和V這6種微量元素對人體健康有重要的調(diào)控作用；而Cd、Ti、Pb、Sb、Hg、Al則為有害微量元素。K能維持人體的滲透壓平衡，擴張血管，有助于受傷部位瘀血消散，參與細胞代謝和酶促反應(yīng)；Cr是胰島激素的輔助因子，Co是維生素B12的重要組成部分，主要功能是調(diào)節(jié)血糖代謝，促進蛋白質(zhì)代謝合成。Fe參與能量代謝和造血功能，Se的主要生物學(xué)功能是血液和組織中谷胱甘肽過氧化物酶的必須組成成分[17-18]。Al超標對兒童的影響主要表現(xiàn)為影響孩子骨骼的生長，孩子智力也會受到一定的影響；Cd對兒童的成長具有明顯的毒害作用[19]。無機元素作為生長因子之一，通過環(huán)境脅迫影響植物的次生代謝產(chǎn)物，間接影響中藥有效成分的積累。有關(guān)學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，適度缺乏Cu和K可促進蒼術(shù)的生長發(fā)育及次生代謝產(chǎn)物的積累[9，20-21]。龍膽中龍膽環(huán)烯醚萜類成分含量與土壤中K含量有關(guān)[22]，土壤中B、Fe含量提高，土壤中含有少量的Cu、Mn和Zn元素，可促進人參中人參皂苷的積累[23-24]。

重金屬元素及有害元素是安全性評價的重要指標，根據(jù)《綠色行業(yè)標準》的規(guī)定，37份赤芍樣品中5種重金屬元素中僅Cd超標，超標率為33%。有研究表明，不少藥用植物對重金屬元素都有富集作用。川芎和半夏對土壤中Cd富集性強，蔞蒿對Cd的富集系數(shù)>1，莖葉類藥材艾納香、青蒿、紅花、羊耳菊中Cd含量超標率也比較高[25-27]，說明Cd元素超標現(xiàn)象在我國不同產(chǎn)地及藥用部位的中藥材中普遍存在。雖然赤芍的Cd超標，但以水溶態(tài)為主的Cd能夠被水溶洗的方式去除，因此，芍藥在加工成白芍的過程在，經(jīng)過水洗和水煮，Cd含量已降低。為更客觀地評價赤芍的安全性，建議進一步研究Cd在赤芍加工為白芍和炮制過程的轉(zhuǎn)移率及殘留量。