王賢婧，胡 蓉，喻 娟，彭清華*

(1.湖南中醫(yī)藥大學，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007)

青光眼最典型的特征為視神經(jīng)萎縮和視野缺損，被稱為“全球第二大不可逆致盲眼癥[1]”。從病理學層面看，凡隸屬于青光眼類別的眼疾，其首要病因均源自于視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞(RGCs)及其軸突不可逆的持續(xù)凋亡[2]。高眼壓(IOP)是目前臨床上青光眼最關(guān)鍵的診斷要點及治療靶點[3-4]。本研究團隊在實踐中發(fā)現(xiàn)，臨床存在某些青光眼患者，即使在眼壓降低到正常水平后，仍存在視神經(jīng)的損傷[5]。因此，如何保護RGCs，以控制視神經(jīng)持續(xù)性損傷，為青光眼視神經(jīng)病變防治領(lǐng)域的研究熱點與難點。

絞股藍又稱七葉膽，是葫蘆科絞股藍屬(Gynostemma Blume Bijdr)的多年生草質(zhì)藤本攀援植物[6]。明代李時珍《本草綱目》中首次記載了絞股藍，其除被譽為“神草”“第二人參”外，“長生不老藥”及“南方人參”亦是其別稱。絞股藍皂苷不僅在調(diào)節(jié)微循環(huán)、清除自由基方面有積極作用，還具備抗炎、抗氧化及預防腫瘤的作用。此外，在提高人體的非特異性免疫力方面[7-9]效果顯著。實驗研究顯示，在缺氧-復氧刺激下由于含氧量減少、缺血損害，從而引起體外海馬切片神經(jīng)細胞中Ca2+超載、線粒體膜通透性增加及脂質(zhì)過氧化。而在絞股藍皂苷作用下此現(xiàn)象反而減輕，在脂質(zhì)過氧化腦損傷過程中絞股藍皂苷有一定的保護作用[10]。

研究發(fā)現(xiàn)，在實驗中給雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎(BCCAO)的大鼠日均口服400 mg/kg絞股藍皂苷，結(jié)果顯示，在后期氧自由基可顯著被消化，從而使抗氧化功能大幅提高，降低了脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生，改善了氧化性DNA的損傷，有效活化抑制了BCCAO大鼠腦胼胝體中的星形膠質(zhì)細胞，這提示絞股藍皂苷可能改善慢性腦灌注不足引起癡呆等疾病[11]。多項研究表明，絞股藍中的有效成分確實對神經(jīng)起到保護作用，但目前的研究主要針對腦缺血和缺血再灌注損傷，包括帕金森病、阿爾茨海默病等疾病展開。絞股藍在視神經(jīng)保護方面的研究未得到足夠的重視，因此本實驗由抑制星形膠質(zhì)細胞入手，研究絞股藍皂苷對慢性高眼壓SD大鼠模型的視神經(jīng)保護作用，以期為青光眼視神經(jīng)病變患者找到更安全有效的藥物治療方法，為進一步探究中醫(yī)藥保護視神經(jīng)提供參考性案例。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 健康的雄性SD大鼠60只(實驗動物質(zhì)量合格證：1107272011004989)，2～3月齡，由湖南中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供，體質(zhì)量180～200 g。本次實驗符合《湖南省實驗動物管理條例》。

1.1.2 藥品與試劑 絞股藍皂苷(陜西冠捷生物科技有限公司，濃度≥98%，編號：No.GY20200323)；mRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(中國北京康為世紀，批號：CW2569)；EDTA(中國大連美倫，批號：MB2514)；UltraSYBR(中國北京康為世紀，批號：CW2601)；核酸染料(中國北京普利萊，批號：PB11141)。

1.1.3 主要儀器 Tono-Pen(American Reichert，型號：AVAI)；熒光定量RCP儀(American Thermo)；熒光PCR板、紫外分光光度計(American Thermo，批號：SPL0960)；電泳儀(中國北京六一儀器廠，批號：DYY2C)、水平瓊脂糖電泳槽(中國北京六一儀器廠，批號：DYCP-31DN)；臺式冷凍離心機(中國湖南湘儀儀器有限公司，批號：H165OR)。

1.2 方法

1.2.1 慢性高眼壓模型建立 參照文獻[12]中的方法，取右眼為手術(shù)眼，用燒灼鞏膜淺層靜脈的方法制作慢性高眼壓模型。取健康SD大鼠60只，隨機抽取1/6作為A組：空白組，余下50只大鼠用于建立慢性高眼壓模型。分別于造模前30 min、造模后30 min、造模后7 d和造模后14 d測量右眼眼壓。平均眼壓高于22 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)的大鼠即為造模成功。若造模后眼壓未上升，或上升后又回落，則進行第二次造模。如果第二次造模也不成功，則將造模失敗的大鼠從研究中排除。

1.2.2 給藥方法 將最終造模成功的50只大鼠均給予噻嗎洛爾滴眼液降眼壓治療，并按隨機數(shù)字表法隨機分為5組，每組10只。陰性對照組：生理鹽水灌胃；低劑量組：絞股藍皂苷25 mg/(kg·d)灌胃；中劑量組：絞股藍皂苷50 mg/(kg·d)灌胃；高劑量組：絞股藍皂苷100 mg/(kg·d)灌胃；陽性對照組：維生素B1和維生素B12治療。所有組別每天清晨灌胃，連續(xù)灌胃14 d。

1.2.3 取材 對健康SD實驗大鼠連續(xù)灌胃14 d，將大鼠處死后立即摘除雙眼眼球；隨后在顯微鏡下分離出大鼠視網(wǎng)膜，將眼前節(jié)及玻璃體去除后，使用顯微鏡剝離出大鼠視網(wǎng)膜組織，一部分立即保存于-80 ℃冰箱中，以供qPCR檢測STAT3 mRNA、JAK2 mRNA。

1.2.4 PCR檢測 從組織中使用Trizol(Thermo，美國)提取出總RNA。隨后，以紫外分光光度計測定分離出的RNA質(zhì)量與數(shù)量。用5 μg的總RNA合成cDNA，隨后用于進行定量RT-PCR。應用DDCT方法(2-△△Ct)計算模型組與治療組之間的相對差異。正向和反向引物如下：R-actin：F：ACATCCGTAAAGACCTCTATGCC；R：TACT-CCTGCTTGCTGATCCAC；產(chǎn)物長度223 bp；R-STAT3：F：ATGTCCTCTATCAGCACAACC；R：GACTCTTCCCACAGGCATCGG；產(chǎn)物長度112 bp；R-JAK2：F：TACTTCCTGACCTTTGCCGTTG；R：AGGTTTGATTTATCTTTCGGCTT；產(chǎn)物長度224 bp。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 眼壓

造模前，各組的眼壓不具有統(tǒng)計學意義。造模后30 min，陰性對照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組和陽性對照組的眼壓較造模前顯著升高，提示造模成功。造模后1周和2周，陰性對照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組和陽性對照組的眼壓均高于空白組。見表1。

表1 造膜前后各組眼壓對比

2.2 慢性高眼壓大鼠模型中視網(wǎng)膜STAT3 mRNA、JAK2 mRNA相對表達量的變化情況

慢性高眼壓大鼠模型造模成功后，連續(xù)灌胃兩周，PCR結(jié)果顯示，與陰性對照組相比，低劑量組、中劑量組、高劑量組、陽性對照組STAT3 mRNA、JAK2 mRNA相對表達量均明顯降低，且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與陽性對照組比較，高劑量組下降最為顯著(P<0.05)；其次為中劑量組(P<0.05)，低劑量組無明顯差異(P>0.05)；進行各治療組組間比較發(fā)現(xiàn)中、高劑量組間存在顯著差異(P<0.05)。以上結(jié)果說明絞股藍皂苷可抑制STAT3 mRNA、JAK2 mRNA的表達，且高劑量絞股藍的抑制效果最明顯，見表2。擴增曲線見圖1、圖2、圖3、圖4。

圖1 STAT3 mRNA擴增曲線

圖2 JAK2 mRNA擴增曲線

圖3 STAT3 mRNA溶解曲線

圖4 JAK2 mRNA溶解曲線

表2 STAT3 mRNA、JAK2 mRNA的相對表達量

3 討論

青光眼本質(zhì)上是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元的退行性疾病，與AD/PD/MS有一些相似的神經(jīng)生物學特征，但該病的發(fā)病機制主要是高眼壓導致RGCs軸突原發(fā)性損害，并繼發(fā)神經(jīng)免疫炎癥，進而導致視神經(jīng)損傷[13]。各種免疫細胞、小膠質(zhì)細胞、星形膠質(zhì)細胞、米勒細胞、毛細血管和血-視網(wǎng)膜屏障將RGCs層層包圍，以上任一成分發(fā)生了病理改變后均可導致RGCs及其軸突的不可逆損傷，進而導致臨床上青光眼的發(fā)生與發(fā)展[14-16]。

STAT3/JAK2在視網(wǎng)膜星形膠質(zhì)細胞中表達，是星形膠質(zhì)細胞激活過程中主要的細胞內(nèi)信號通路[17]。研究發(fā)現(xiàn)，外表呈星形的膠質(zhì)細胞在急性高血壓眼損傷后早期開始激活，其細胞形態(tài)和細胞間結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化，細胞內(nèi)STAT3/JAK2信號通路在損傷后早期即在膠質(zhì)細胞中被激活，膠質(zhì)細胞激活后視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞則表現(xiàn)出更明顯的損傷[18]。視神經(jīng)損傷后，RGCs生存的微環(huán)境會發(fā)生改變，誘發(fā)RGCs的繼發(fā)性凋亡，從而引起不可逆的視力喪失[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，絞股藍皂苷可抑制視網(wǎng)膜中STAT3 mRNA和JAK2 mRNA的擴增，從而抑制神經(jīng)免疫性炎癥反應，進而闡明了絞股藍皂苷對RGCs的保護作用及其作用機制。

在治療消化系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)領(lǐng)域的多種疾病上，絞股藍效果較好，不僅安全且性價比也極高。絞股藍的多功能藥用價值主要源于其成分中的一種植物化合物——絞股藍皂苷，屬達瑪烷型四環(huán)三萜類，其活性與人參皂苷近似。研究表明，絞股藍皂苷具有抗炎、抗氧化、抗衰老、降脂、調(diào)節(jié)免疫等作用[7-8，20-22]。目前的研究主要針對腦缺血和缺血再灌注損傷，包括帕金森病、阿爾茨海默病等疾病展開[10-11]。而絞股藍在保護視神經(jīng)方面的作用卻鮮有關(guān)注，因而需要深入探究。利用構(gòu)造的慢性高眼壓大鼠模型，研究絞股藍皂苷對視神經(jīng)產(chǎn)生的保護作用，尋找治療多發(fā)性硬化這類脫髓鞘疾病的有效技術(shù)方案，對臨床視神經(jīng)保護意義重大。

本研究證明，絞股藍皂苷可抑制視網(wǎng)膜中STAT3和JAK2的mRNA擴增，從而抑制星形膠質(zhì)細胞的激活，抑制RGCs的凋亡進而保護視神經(jīng)，且絞股藍高劑量組抑制效果最佳。本研究結(jié)果有望為臨床上的青光眼視神經(jīng)病變患者找到更安全有效的藥物治療方法，并為中醫(yī)藥保護視神經(jīng)的深入研究提供有益參考。絞股藍皂苷保護視神經(jīng)的具體作用機理及作用機制將是進一步研究的方向。