李衛(wèi)先，劉園園，李 達(dá)

(湖南中醫(yī)藥高等專科學(xué)校，湖南 株洲 412012)

缺血性腦血管疾病是當(dāng)前導(dǎo)致人類死亡和殘障的主要原因之一，補(bǔ)陽還五湯是臨床防治缺血性腦血管疾病引起的中風(fēng)及中風(fēng)后遺癥的常用有效方劑，出自清代醫(yī)學(xué)家王清任的《醫(yī)林改錯》，全方由黃芪、當(dāng)歸、赤芍、地龍、川芎、紅花、桃仁等7味中藥組成，在擴(kuò)張血管、增加腦血流量、降低血液黏滯性、抑制血小板聚集、抗腦栓血、抗衰老及調(diào)節(jié)免疫功能等方面都有廣泛作用[1]，由于中藥必須經(jīng)過炮制以后才能用于臨床而發(fā)揮應(yīng)有效用，而原方中黃芪、當(dāng)歸、赤芍、地龍、川芎除了有生品外，還有蜜炙和酒炙等炮制品，但原方并未闡明方中各藥所用的具體炮制品，而炮制品的選擇是提高復(fù)方療效的關(guān)鍵問題。為探討本方中各藥的最佳炮制品組合，本文對由黃芪、當(dāng)歸、赤芍、地龍、川芎等藥不同炮制品組方的補(bǔ)陽還五湯的抗腦缺血和耐缺氧和抗疲勞作用進(jìn)行比較研究，以確定本方臨床用于抗腦缺血損傷時，方中各藥運(yùn)用的具體炮制品，為指導(dǎo)中醫(yī)辨證施治，臨床合理用藥，提高方劑療效，發(fā)揮中醫(yī)個性化治療疾病的優(yōu)勢提供參考。

1 材料及儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)藥物

實(shí)驗(yàn)所用藥材黃芪、當(dāng)歸、赤芍、地龍、川芎、紅花、桃仁等均由湖南中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校附屬一醫(yī)院提供，按《中華人民共和國藥典》(2020版一部)鑒定為合格藥材。腦心通膠囊由陜西步長制藥有限公司生產(chǎn)。

1.2 試劑

cAMP與β-EP放免藥盒購自解放軍總醫(yī)院科技開發(fā)中心。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物

清潔級昆明種小鼠，雌雄各半，體質(zhì)量18～22 g；成年清潔級(SD)大鼠，雌雄各半，體質(zhì)量220～240 g，由湖南斯萊科景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動物許可證號SKY(湘)2013-0005，25 ℃室溫飼養(yǎng)。

1.4 儀器

上海光電醫(yī)用電子儀器有限公司，TGL-16H型高速離心機(jī)；上海核福光電儀器有限公司，SN-682型放射免疫計數(shù)器。

2 方法

2.1 樣品分組及提取

2.1.1 樣品分組 補(bǔ)陽還五湯按《方劑學(xué)》教材規(guī)定的劑量稱取。1組：各組成成分均為生品的補(bǔ)陽還五湯水煎液，由黃芪120 g、當(dāng)歸尾6 g、赤芍4.5 g、地龍3 g、川芎3 g、紅花3 g、桃仁3 g等藥物生品組方的補(bǔ)陽還五湯；2組：黃芪蜜炙，當(dāng)歸、赤芍、川芎、地龍均酒炙，其他藥物均為生品組方的補(bǔ)陽還五湯湯；3組：黃芪蜜炙，其他藥物均為生品組方的補(bǔ)陽還五湯；4組：當(dāng)歸、赤芍、川芎、地龍均酒炙，其他藥物均為生品組方的補(bǔ)陽還五湯。各藥用量同1組。

2.1.2 樣品提取 以上各組藥按量稱取各藥后，加蒸餾水2 000 mL，常溫(25 ℃)浸泡30 min，煮沸后文火煎30 min過濾藥液，加1 000 mL蒸餾水于藥渣中再煎煮25 min，合并兩次濾液，濃縮至補(bǔ)陽還五湯約2.0 g/mL，放入4 ℃冰箱備用。

2.1.3 陽性對照藥制備 將腦心通膠囊去囊，取出內(nèi)容物并加入蒸餾水配成質(zhì)量濃度為0.4 g/kg的混懸液，備用。

2.2 補(bǔ)陽還五湯抗腦缺血、耐缺氧、抗疲勞實(shí)驗(yàn)

2.2.1 分組與給藥 將小鼠分為6組，雌雄各半，每組65只，即空白對照組，腦心通組，不同炮制品組方的補(bǔ)陽還五湯1、2、3、4組。適應(yīng)性飼養(yǎng)各組小鼠1周后，參照動物與人體等效換算標(biāo)準(zhǔn)換算[2]，給予相應(yīng)的藥物補(bǔ)陽還五湯組按13 g/(kg·d)量灌胃，腦心通膠囊組(0.4 g/kg)水溶液灌胃，空白對照組、給予等量生理鹽水，每天2次，連續(xù)2周。

2.2.2 小鼠斷頭后張口喘氣模型[3]各組隨機(jī)選取小鼠15只雌雄各半。每天2次，連續(xù)2周，各組分別灌胃相應(yīng)的藥物或生理鹽水，各組小鼠末次給藥30 min后于小鼠耳后2 mm處斷頭，造成腦部急性缺血缺氧，記錄各小鼠斷頭后張口喘氣動作的持續(xù)時間(s)。在觀察喘氣時間時，為避免主觀因素影響，采用單盲法，即記錄時間者不知動物給藥情況。

2.2.3 夾閉氣管致小鼠缺血缺氧模型[4]各組隨機(jī)選取小鼠15只雌雄各半。每天2次，連續(xù)2周，各組分別灌胃相應(yīng)的藥物或生理鹽水，各組小鼠于末次給藥2h后腹腔注射水合氯醛(300 mg/kg)麻醉，固定，頸部正中切口，分離氣管，連接心電監(jiān)護(hù)儀監(jiān)測心電圖(ECG)，然后夾閉氣管，立即記錄小鼠心電圖持續(xù)時間，以心電圖消失為心臟停搏指標(biāo)。

2.2.4 抗耐缺氧實(shí)驗(yàn)[5]各組隨機(jī)選取小鼠15只雌雄各半。每天2次，連續(xù)2周，各組分別灌胃生理鹽水或相應(yīng)的藥物，實(shí)驗(yàn)前各組小鼠禁食，末次給藥后30 min，將小鼠放入裝有20 g鈉石灰的250 mL廣口瓶中，觀察小鼠從進(jìn)入到死亡的時間。

2.2.5 游泳試驗(yàn) 各組隨機(jī)選取小鼠20只，雌雄各半，作好標(biāo)記。連續(xù)2周每天2次各組分別灌胃生理鹽水或相應(yīng)的藥物，第14天實(shí)驗(yàn)組和對照組小鼠均放入同一24 ℃恒溫水浴中游泳，觀察記錄小鼠被淹死時間。

2.3 腦缺血再灌注動物模型制備[6]

給藥2周后大鼠不禁水禁食12 h，用10%水合氯醛腹腔麻醉大鼠(0.3 mL/100 g)，頸部正中切口，鈍性分離左側(cè)頸總動脈(CCA)、左頸內(nèi)動脈(ICA)和左頸外動脈(ECA)，用微血管夾將頸總動脈在近分叉處夾閉，將直徑0.2 mm涂有硅酮的尼龍線從頸外動脈插入至頸內(nèi)動脈遠(yuǎn)端，阻斷大腦中動脈血流，然后將微血管夾取掉，將頸外動脈結(jié)扎，使大鼠腦缺血，(判斷遠(yuǎn)端結(jié)扎無血流的方法：大鼠臉呈蒼白色，瞳孔放大，翻正反射消失，說明產(chǎn)生前腦缺血)，留約1 cm的線頭于外側(cè)，于缺血2h時輕提尼龍線，使其球端回至頸外動脈內(nèi)，即可恢復(fù)大腦中動脈(MCA)血供。假手術(shù)組ICA不插線栓，僅分離血管。以上過程均在室溫恒定(24～25 ℃)情況下進(jìn)行，以利于評價腦缺血情況。動物清醒后出現(xiàn)對側(cè)前肢腕曲、肘曲、Horner綜合征、肩內(nèi)收、爬行時向?qū)?cè)傾斜為成功模型。

2.4 分組與給藥

將大鼠隨機(jī)分成假手術(shù)組，模型組，腦心通組，不同炮制品組方的補(bǔ)陽還五湯1、2、3、4組等7組，每組30只，各組大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，參照動物與人體等效換算標(biāo)準(zhǔn)換算[2]，給予相應(yīng)的藥物補(bǔ)陽還五湯組按13 g/(kg·d)量灌胃，腦心通膠囊組(0.4 g/kg)水溶液灌胃，空白對照組、模型組與假手術(shù)組均給予等量生理鹽水，均于造模手術(shù)前14日開始給藥，持續(xù)至造模后第3天，每天2次。

2.5 觀察指標(biāo)

2.5.1 血漿cAMP(環(huán)磷酸鳥苷)與β-EP(β-內(nèi)啡肽)的測定 各組選取造模成功的大鼠10只摘眼球取血1.5 mL，預(yù)置于50 μLEDTA·2Na抗凝劑的試管內(nèi)，搖勻后置冰浴中，1 h內(nèi)離心(3 000 r/min，10 min)。取上清液0.1 mL移入試管，加入無水酒精2 mL，振搖1 min，靜置5 min后離心(3 000r/min，10 min)，取上清液移入洗凈、烘干的青霉素小瓶內(nèi)，剩余殘渣加75%酒精1 mL，振搖均勻以打碎塊狀物后再離心(3 000 r/min，10 min)，合并上清液于青霉素小瓶內(nèi)，烘干后置于4 ℃保存待測cAMP；另取1.5 mL血加入預(yù)置有30 μL抑肽酶，30 μL EDTA.2Na抗凝劑的試管內(nèi)，迅速低溫離心(4 000 r/min，10 min)取上清液，移入EP管，20 ℃保存待測β-EP。采用放射免疫計數(shù)器檢測，全部程序按藥盒說明書進(jìn)行。

2.5.2 血漿中β-血栓球蛋白(β-TG)、血小板因子-4(PF4)、血漿纖維蛋白原以及血液中白細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞總數(shù)、血小板總數(shù)的含量測定 各組選取造模成功的大鼠10只，10%水合氯醛(3.5 mL/kg)腹腔注射麻醉，腹主動脈取血后分離血清及血漿，用競爭性抑制法酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)技術(shù)測定血漿中β-血栓球蛋白(β-TG)、血小板因子-4 (PF4)、血漿纖維蛋白原的含量。另從各組選取造模成功的大鼠10只，從腹主動脈取血后，分別加入裝有EDTA-2Na、肝素鈉以及枸櫞酸鈉的抗凝管中搖勻，采用流式細(xì)胞術(shù)測定白細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞總數(shù)、血小板總數(shù)。

3 結(jié)果

3.1 補(bǔ)陽還五湯有效部位對小鼠各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)持續(xù)時間的影響

對張口喘氣時間的影響。表1結(jié)果顯示：與空白組比較，各組灌胃給予不同炮制品組方的補(bǔ)陽還五湯2周后，小鼠斷頭后張口喘氣時間均能不同程度延長(P<0.05)，與生品組(1組)比較，不同炮制品組方的補(bǔ)陽還五湯2、3、4、腦心通膠囊組均能顯著延長小鼠斷頭后張口喘氣時間(P<0.05)，其中以2組效果強(qiáng)于3、4、腦心通膠囊組(P<0.05)，3組與4組、腦心通膠囊差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

耐缺氧和游泳實(shí)驗(yàn)。表1結(jié)果顯示：與空白組比較，各組灌胃給予不同炮制品組方的補(bǔ)陽還五湯2周后，小鼠耐缺氧時間及游泳試驗(yàn)死亡時間均不同程度延長(P<0.05)，與生品組(1組)比較，不同炮制品組方的補(bǔ)陽還五湯2、3、4、腦心通膠囊組均能顯著延長小鼠耐缺氧試驗(yàn)及游泳試驗(yàn)死亡時間(P<0.05)。其中以2組效果強(qiáng)于3、4、腦心通膠囊組(P<0.05)，3組與4組、腦心通膠囊無顯著性差異(P>0.05)。

對小鼠夾閉氣管后心電持續(xù)時間的影響。表1結(jié)果顯示：與空白組比較，各組灌胃給予不同炮制品組方的補(bǔ)陽還五湯2周后，均能不同程度延長夾閉氣管后小鼠心電圖持續(xù)時間(P>0.05)，與生品組(1組)比較，不同炮制品組方的補(bǔ)陽還五湯2、3、4、腦心通膠囊組均能顯著延長夾閉氣管后小鼠心電圖持續(xù)時間(P>0.05)，其中以2組效果強(qiáng)于3、4、腦心通膠囊組(P<0.05)，3組與4組、腦心通膠囊無顯著性差異(P>0.05)。

表1 補(bǔ)陽還五湯有效部位對小鼠各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)持續(xù)時間的影響

3.2 補(bǔ)陽還五湯復(fù)方顆粒對腦缺血大鼠血漿β-TG、PF4、cAMP與β-EP的影響

對血漿β-TG、PF4含量的影響。由表2可知，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血漿β-TG、PF4含量顯著升高(P<0.01)。與模型組比較，不同炮制品組方的補(bǔ)陽還五湯1、2、3、4、腦心通膠囊組均能不同程度降低大鼠血漿β-TG、PF4含量(P<0.05)，且2、3、4、腦心通膠囊組均強(qiáng)于1組(P<0.05)，其中以2組效果強(qiáng)于3、4、腦心通膠囊組(P<0.05)，3組與4組、腦心通膠囊差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

對血漿cAMP與β-EP含量的影響。由表2可見，與假手術(shù)組比較，造模后大鼠血漿cAMP含量顯著降低，β-EP含量顯著增高，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，不同炮制品組方的補(bǔ)陽還五湯1、2、3、4、腦心通膠囊組血漿cAMP含量均不同程度升高(P<0.01)，β-EP含量不同程度降低(P<0.01)，且2、3、4、腦心通膠囊組均強(qiáng)于1組(P<0.05)，其中以2組效果強(qiáng)于3、4、腦心通膠囊組(P<0.05)，3組與4組、腦心通膠囊無顯著性差異(P>0.05)。

表2 血漿β-TG、PF4、cAMP與β-EP的測定

3.3 補(bǔ)陽還五湯復(fù)方顆粒對腦缺血大鼠血小板計數(shù)、血漿纖維蛋白原、白細(xì)胞計數(shù)、中性粒細(xì)胞計數(shù)的影響

對血小板計數(shù)及血漿纖維蛋白原含量的影響。由表3可知，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血小板計數(shù)及血漿纖維蛋白原含量均顯著升高(P<0.01)。與模型組比較，不同炮制品組方的補(bǔ)陽還對白細(xì)胞計數(shù)及中性粒細(xì)胞計數(shù)的影響。由表3可見，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠白細(xì)胞計數(shù)及中性粒細(xì)胞計數(shù)顯著升高(P<0.01)。與模型組比較，不同炮制品組方的補(bǔ)陽還五湯1、2、3、4、腦心通膠囊組大鼠白細(xì)胞計數(shù)及中性粒細(xì)胞計數(shù)均不同程度降低(P<0.05)，且2、3、4、腦心通膠囊組均強(qiáng)于1組(P<0.05)，其中以2組效果強(qiáng)于3、4、腦心通膠囊組(P<0.05)，3組與4組、腦心通膠囊差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表3 補(bǔ)陽還五湯復(fù)方顆粒對腦缺血大鼠血液指標(biāo)的影響

五湯1、2、3、4、腦心通膠囊組大鼠血小板計數(shù)及血漿纖維蛋白原含量均不同程度降低(P<0.05)。且2、3、4、腦心通膠囊組均強(qiáng)于1組(P<0.05)，其中以2組效果強(qiáng)于3、4、腦心通膠囊組(P<0.05)，3組與4組、腦心通膠囊差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

4 討論

腦梗塞在臨床上稱之為缺血性腦卒中，指的是腦部血液供應(yīng)障礙導(dǎo)致局部的腦組織出現(xiàn)受損現(xiàn)象，使患者出現(xiàn)腦組織缺血、缺氧壞死等現(xiàn)象[7]。中醫(yī)對該類疾病患者采取活血化瘀類藥物進(jìn)行治療，可取得一定療效，補(bǔ)陽還五湯具有補(bǔ)氣活血通絡(luò)的功效。有研究顯示，藥物經(jīng)酒炙后可增強(qiáng)活血通絡(luò)的作用，蜜炙后可增強(qiáng)補(bǔ)脾益氣的作用[8]。本次研究以小鼠斷頭后喘氣時間、鈉石灰廣口瓶中存活時間、恒溫水浴中游泳被淹死時間、小鼠夾閉氣管后心電持續(xù)時間，以及腦缺血后大鼠cAMP與β-EP、PF4、β-TG、血小板計數(shù)、大鼠白細(xì)胞計數(shù)、中性粒細(xì)胞計數(shù)及血漿纖維蛋白原含量為觀察指標(biāo)，探討黃芪蜜炙和當(dāng)歸、赤芍、川芎、地龍等藥酒炙組方的補(bǔ)陽還五湯抗腦缺血損傷及耐缺氧和抗疲勞作用。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，小鼠連續(xù)2周灌服不同炮制品組方的補(bǔ)陽還五湯后分別做耐缺氧及抗疲勞游泳實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)各組小鼠死亡時間與空白組比較均不同程度延長，均能不同程度提高小鼠耐缺氧與生存能力，但由黃芪蜜炙，當(dāng)歸、赤芍，川芎、地龍等藥酒炙組方的補(bǔ)陽還五湯組作用最強(qiáng)。β-EP是體內(nèi)作用最強(qiáng)的一種內(nèi)源性阿片肽，cAMP則是一種重要的具有生物活性的環(huán)核苷酸?，F(xiàn)代研究表明，缺血缺氧性腦損傷時，會促使神經(jīng)細(xì)胞膜去極化而釋放大量的β-EP，其濃度升高可以抑制ATP代謝，使cAMP生成減少，導(dǎo)致血管源性腦水腫，加重腦組織的損害[9]。本研究結(jié)果表明，造模后急性腦梗塞大鼠腦組織中cAMP明顯降低，而β-EP的含量明顯升高，通過不同炮制品組方的補(bǔ)陽還五湯灌胃治療后，發(fā)現(xiàn)各組均能不同程度升高急性腦梗塞大鼠腦組織中cAMP和降低β-EP含量，由黃芪蜜炙，當(dāng)歸、赤芍、川芎、地龍等藥酒炙組方的補(bǔ)陽還五湯作用最強(qiáng)，說明此組補(bǔ)陽還五湯對腦缺血大鼠血漿cAMP、β-EP的調(diào)節(jié)作用最強(qiáng)。本研究結(jié)果還顯示，大鼠腦缺血后，與血小板行為密切相關(guān)的血小板α顆粒內(nèi)的特異蛋白質(zhì)β-TG與PE4的含量會發(fā)生明顯變化，且大鼠血小板被大量激活，血液黏性增強(qiáng)，血流速度減慢，導(dǎo)致病灶局部缺血加重，模型組大鼠血漿PF4、β-TG 含量、血小板總數(shù)及血漿纖維蛋白原、白細(xì)胞總數(shù)及中性粒細(xì)胞計數(shù)顯著高于正常對照組，經(jīng)不同炮制品組方的補(bǔ)陽還五湯灌胃治療后，模型大鼠血清PF4、β-TG、血小板總數(shù)及血漿纖維蛋白原、白細(xì)胞總數(shù)及中性粒細(xì)胞含量均能不同程度降低，由黃芪蜜炙，當(dāng)歸、赤芍、川芎、地龍等藥酒炙組方的補(bǔ)陽還五湯作用最強(qiáng)。

綜上所述，補(bǔ)陽還五湯抗腦缺血損傷及耐缺氧與抗疲勞作用時，方中黃芪應(yīng)選用蜜炙品，當(dāng)歸、赤芍、川芎、地龍等藥物應(yīng)選用酒炙品。