劉潤峰，候 振，黃星晨，肖 凱，楊濰菡，張俊俊，付 強

（廣西大學(xué) 亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護與利用國家重點實驗室，廣西 南寧 530004）

廣西沼澤性水牛是南方重要役畜，具有體質(zhì)強 健、耐粗飼、乳肉生產(chǎn)開發(fā)潛力大、適應(yīng)性強、繁殖率較低等特點。哺乳動物的精子發(fā)生過程由多個因素同時調(diào)控精子成熟[1]，受到各種內(nèi)源或外源因素的影響，哺乳動物的生精過程停滯在任何階段，都可能導(dǎo)致精卵結(jié)合異常[2]。精子獲能作為精卵結(jié)合的重要前提之一，對水牛繁育率有著極大影響。精子在附睪時已經(jīng)具有受精能力[3]，但精子獲能成熟受到了附睪中去能因子抑制[4]。當(dāng)精子穿過雌性生殖道，去能因子作用被消除，經(jīng)宮頸管進入子宮腔及輸卵管腔時，精子頭部的糖蛋白被生殖道分泌物中的α、β 淀粉酶降解，同時頂體膜結(jié)構(gòu)中膜電位和脂質(zhì)發(fā)生變化，降低頂體膜穩(wěn)定性，精子此時具備了與卵子結(jié)合的能力，這就是精子獲能[5]。精子成熟的標志之一是精子獲能[6]。

近年來，基于液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（LC-MS/MS）對蛋白質(zhì)和肽段的分離鑒定技術(shù)發(fā)展迅速，它能夠解決雙向電泳技術(shù)的缺陷，提高蛋白質(zhì)分離范圍，避免人為誤差。通過串聯(lián)質(zhì)譜標簽（Tandem mass tags，TMT）定量技術(shù)進行高通量、高精度的全蛋白質(zhì)組定量分析，是多樣品定量分析很好的選擇[7]。蛋白質(zhì)組學(xué)已被廣泛應(yīng)用于哺乳動物精子獲能研究[8]，并且發(fā)現(xiàn)一些蛋白質(zhì)通過磷酸化去調(diào)節(jié)精子成熟過程[9]。LAVOIE-OUELLET 等[10]利用對硝基苯磷酸二鈉（pNPP）檢測免疫沉淀精子蛋白磷酸酶EF 手性鈣結(jié)合域1（Protein phosphatase，EF-hand calcium binding domain 1，PPEF1）的磷酸酶活性，首次證明了PPEF1 在精子和睪丸生殖細胞中存在，揭示了精子獲能、透明帶結(jié)合和運動等生物學(xué)過程的關(guān) 系。 BAE 等[11]研 究 發(fā) 現(xiàn)，Ras 相 關(guān) 蛋 白（Ras-related proteins，Rab）是Ras單體G 蛋白超級家族的成員，在精子的頭和尾部均表達，可以用作與生育相關(guān)的潛在生物標簽，同時調(diào)節(jié)頂體外膜和質(zhì)膜的連接。MALDERA 等[12]研究發(fā)現(xiàn)，人類附睪中半胱氨酸豐富分泌蛋白1（Cysteine-rich secretory proteins 1，CRISP1）是一種在受精過程中具有重要功能的蛋白質(zhì)，通過與透明帶精子結(jié)合蛋白3（Zona pellucida sperm-binding protein 3，ZP3）結(jié)合，參與精子與透明帶融合的早期階段。同時還可與介導(dǎo)精卵融合的結(jié)合位點分化抗原簇9（Cluster of differentiation antigen 9，CD9）相互作用，促進精卵融合，但具體機制仍需探究。

蛋白質(zhì)是細胞功能和生命活動的重要載體，也是生物體內(nèi)遺傳信息表達的最后形式[13]。目前，在精子獲能相關(guān)研究中，還有一些關(guān)鍵蛋白質(zhì)未被發(fā)現(xiàn)和證實，獲能前后水牛精子蛋白質(zhì)組學(xué)差異的相關(guān)研究還很少。隨著組學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)被越來越多應(yīng)用于蛋白質(zhì)的分離與鑒定中。鑒于此，采用TMT 標記結(jié)合LC-MS/MS 方法探究獲能前后水牛精子的蛋白質(zhì)組學(xué)差異，分析獲能前后表達量差異的蛋白質(zhì)，并對這些蛋白質(zhì)進行信息挖掘和功能探究，為研究水牛的雄性生殖機制提供參考。

1 材料和方法

1.1 水牛精液

廣西沼澤型水牛的精子樣本來自廣西畜禽品種改良站。

1.2 主要試劑及儀器

1.2.1 主要試劑 胰蛋白酶（Trypsin）、二硫蘇糖醇（DTT）、硫脲（Thiourea）、蛋白酶抑制劑（Protease inhibitor）、CHAPS 均購自Sigma 公司；BCIP/NBT 堿性磷酸酶顯色試劑盒購自碧云天生物科技有限公司 ；甲 酸（Formic acid，F(xiàn)A）、三 氟 乙 酸（Trifluoroaceticacid，TFA）、丙 酮（Acetone）、乙 腈（Acetonitrile，ACN）、TMT 標 記 試 劑 盒 均 購 自Thermo Fisher Scientific 公 司；VAMP4 抗 體 購 自Abcam 公司；APOC3 及β-actin 內(nèi)參抗體購自Bioss公司。

1.2.2 主要儀器 液質(zhì)聯(lián)用儀Easy-nano LC-MS/MS（LTQ-Orbitrap Elite）購 自 Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 精子獲能處理

將水牛鮮精于4 ℃下2 000 r/min 離心10 min，PBS重懸精子沉淀制成精子懸液。Percoll離心精子懸液去除低活力精子，將精子濃度調(diào)為5×106個/mL，分為均等2份即獲能組和對照組。獲能組在平衡獲能培養(yǎng)基（0.48 mg/mL 咖啡因，10 mmol/L 肝素，pH值7.5～7.8）孵育1 h。移入新的離心管，吹打混勻，計算機輔助精液分析系統(tǒng)（Computer aided semen analysis，CASA）計算精子活力。另取出100 μL加入鈣離子載體A23187，在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)30 min觀察頂體反應(yīng)。其余上清液于1 500 r/min離心5 min，棄去上清液備用。將獲能組和對照組精子各取10 μL涂板，考馬斯亮藍染色，封片后觀察。

1.4 總蛋白質(zhì)提取及濃度測定

在對照組和獲能組精子沉淀中加入適量的細胞裂解液，振蕩重懸。冰浴超聲破碎30 min（每30 s間歇1 min）。4 ℃靜置2 h 后，向收集的上清液中加入4倍體積丙酮。-20 ℃沉淀蛋白質(zhì)，過夜后于4 ℃下12 000 r/min離心30 min，預(yù)冷丙酮洗沉淀3次，室溫自然干燥后，加裂解液復(fù)溶，SDS-PAGE檢測樣品蛋白質(zhì)。采用Bradford 法定量復(fù)溶后的蛋白質(zhì)溶液，并繪制標準曲線。將樣品放于冰箱-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 蛋白質(zhì)酶切和TMT標記

取獲能前后的精子蛋白質(zhì)樣品各100 μg，加入45 μL 100 mmol/L 的TEAB 溶液復(fù)溶，加入5 μL 200 mmol/L的TCEP，于55 ℃恒溫孵育1 h還原蛋白質(zhì)二硫鍵，再加入5 μL 375 mmol/L 的碘乙酰胺溶液，避光靜置30 min。加入6倍體積預(yù)冷丙酮，-20 ℃過夜后于4 ℃下8 000 r/min 離心30 min，再加入100 μL 100 mmol/L TEAB 復(fù)溶，加入2.5 μg 胰蛋白酶，37 ℃恒溫孵育16～24 h，使精子蛋白質(zhì)酶切成肽段。酶解結(jié)束后，按照TMT 試劑盒的說明，將TMT 標簽分別加入上述肽段中標記，其中，未獲能精子（對照組）標簽為TMT-112，獲能精子（獲能組）標簽為TMT-113。將標記后樣品等體積混合，真空抽干。

1.6 肽段預(yù)分離與純化

在標記后的肽段中加入90 μL A 液（2%ACN，pH 值10.0）復(fù)溶，使用毛細管反向色譜柱（XBribge C18，Waters公司）進行肽段預(yù)分離。流速0.5 mL/min，流動相B液成分為98%ACN（pH 值10.0），洗脫梯度設(shè)置為：0～10 min，100% A 液；10～55 min，0%～35%B液；55～65 min，35%～100%B 液。將洗脫產(chǎn)物收集并合并成8 個餾分，用脫鹽吸頭（Ziptip C18，Millipore公司）對樣品進行脫鹽處理。

1.7 LC-MS/MS分析

上述餾分用A 液（5%ACN 溶液，0.1%FA）復(fù)溶后用于LC-MS/MS 質(zhì)譜鑒定，色譜柱使用PepMap100 C18 柱（Thermo Fisher 公司），流速300 nL/min，B液（95%ACN溶液，0.1%FA）梯度設(shè)置：0～3 min，2%～15% B；3～23 min，15%～20% B；23～53 min，20%～32% B；53～57 min，32%～98% B；57～60 min，98% B。質(zhì)譜方法：一級質(zhì)譜分辨率設(shè)為70 000，質(zhì)子數(shù)和電荷數(shù)的比值（m/z）為300～1 800；二級質(zhì)譜分辨率設(shè)為17 500，歸一化碰撞能量為35%，m/z 為445.120 0。采用Proteome Discoverer 2.0軟件檢索數(shù)據(jù)，檢索使用的數(shù)據(jù)庫為Bos Taurus Uniprot數(shù)據(jù)庫。

1.8 數(shù)據(jù)檢索與生物信息學(xué)分析

定量差異倍數(shù)閾值為≥1.2 或≤0.83 時選取為差異表達蛋白質(zhì)（Differential expression proteins，DEPs），使用T檢驗篩選具有顯著性差異（P＜0.05）的蛋白質(zhì)。 通過DAVID 軟件進行GO（Gene ontology）分析，分別是生物學(xué)進程、細胞組分和分子功能。通過KEGG 在線數(shù)據(jù)庫對DEPs 參與的信號通路進行分析，利用STRING 10.0 軟件分析蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)，采用Cytoscape 軟件繪制蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)。

1.9 Western blot驗證

將篩選的差異蛋白質(zhì)進行Western blot 驗證。用SDS-PAGE 凝膠電泳分離獲能和非獲能精子的等量蛋白質(zhì)（30 μg），用轉(zhuǎn)膜儀（Bio-Rad 公司）將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上，轉(zhuǎn)膜后置于脫脂牛奶中，于搖床上封閉2 h，而后分別加入VAMP4 抗體、APOC3 抗體和β-actin 內(nèi)參抗體，4 ℃孵育過夜。隨后，用TBST 緩沖液清洗4 次，二抗孵育，顯色成像。

2 結(jié)果與分析

2.1 水牛精子獲能鑒定分析

通過鈣離子誘導(dǎo)的方法使獲能組精子發(fā)生頂體反應(yīng)。如圖1 所示，對照組精子中的糖蛋白被考馬斯亮藍染成藍紫色（圖1A）。獲能組精子由于頂體反應(yīng)使頂體膜破裂，糖蛋白流失，精子頭部呈現(xiàn)淺藍色（圖1B）。表明精子體外獲能成功并發(fā)生頂體反應(yīng)。

圖1 獲能前后水牛精子的染色結(jié)果Fig.1 Staining results of buffalo sperm before and after capacitation

2.2 獲能前后水牛精子蛋白質(zhì)鑒定信息

經(jīng)TMT 標記后等體積混合，通過LC-MS/MS 分析，并進行2 次技術(shù)重復(fù)。結(jié)果顯示，經(jīng)2 次重復(fù)的韋恩分析，共采集到8 395 個Unique 肽，對應(yīng)于1 461 種蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)組理化性質(zhì)分析表明，水牛精子蛋白質(zhì)分子質(zhì)量主要分布在10～60 ku，等電點（pI）集中在5～8，主要是中性蛋白質(zhì)，肽段覆蓋率為14.13%，有31.10%的蛋白質(zhì)含有專一性肽段（圖2）。根據(jù)肽段數(shù)量統(tǒng)計，水牛精子中高豐度表達的蛋白質(zhì)分別是外膜致密纖維蛋白2（Outer dense fiber protein 2，ODF2），激 酶 錨 定 蛋 白4（A-kinase anchor protein 4，AKAP4）、微管β4 蛋白（Tubulin beta-4B，TUBB4B）。

圖2 獲能前后水牛精子的分子質(zhì)量（A）、等電點（B）、覆蓋率（C）、專一性肽段比例（D）Fig.2 Molecular weight（A），isoelectric point（B），coverage rate（C）and proportion of unique peptide（D）in buffalo sperm before and after capacization

質(zhì)譜共鑒定蛋白質(zhì)數(shù)為1 461 個，標記效率98.6%，其中成功標記蛋白質(zhì)數(shù)1 441 個。DEPs 閾值為≥1.2 或≤0.83，DEPs 數(shù)目為93 個，其中52 個顯著上調(diào)，41個顯著下調(diào)（表1）。

表1 獲能前后水牛精子蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定信息Tab.1 Identification information of protein mass spectrometry before and after buffalo sperm capacitation

2.3 獲能前后水牛精子DEPs GO分析

使用DAVID 軟件對DEPs 進行GO 分析，共有88 個蛋白質(zhì)存在注釋信息。從細胞組分（Cellular component）上看，有53個（56%）DEPs 定位在細胞質(zhì)中。其中定位在囊泡和囊泡膜上的DEPs 有20 個（71%）表現(xiàn)為下調(diào)（圖3A）。與細胞骨架有關(guān)的DEPs 中，12個下調(diào)，3 個上調(diào)。生物學(xué)進程（Biological processes）中也發(fā)現(xiàn)與細胞骨架有關(guān)的DEPs 明顯下調(diào)。參與精子發(fā)生的9 個DEPs，上調(diào)4個，下調(diào)5個，其中2 個與精子獲能有密切聯(lián)系（圖3B）。在分子功能（Molecular functions）中，參與鈣調(diào)素結(jié)合蛋白質(zhì)有3個下調(diào)蛋白質(zhì)（圖3C）。

圖3 獲能前后水牛精子表達差異蛋白質(zhì)GO分析Fig.3 GO analysis of differential expression protein in buffalo sperm before and after capacization

2.4 獲能前后水牛精子DEPs KEGG通路分析

為了獲得DEPs參與的信號通路，使用KEGG對DEPs 進行通路分析。KEGG 分析表明，DEPs 參與到56個相關(guān)的信號通路中，一些重要的信號通路如kinase muscle，CKM）與精子獲能過程的能量代謝聯(lián)系緊密。此外，還富集到2 個與精子獲能有關(guān)的重要信號通路，即過氧化物酶體增殖物激活受體信號通 路（Peroxisome proliferators-activated receptors，PPAR）和可溶性NSF 附著蛋白受體（Soluble NSF attachment protein receptor，SNARE）信號通路，載脂蛋白C3（Apolipoprotein c-3，APOC3）參與PPAR信號通路，囊泡相關(guān)膜蛋白4（Vesicle associated membrane protein 4，VAMP4）參與SNARE 互作通路，結(jié)果表明APOC3 和VAMP4 可能在精子獲能過程中發(fā)揮重要作用。

表2 獲能前后水牛精子表達差異蛋白質(zhì)KEGG信號通路Tab.2 KEGG signaling pathway of differential expression protein list in buffalo sperm before and after capacization

2.5 獲能前后水牛精子蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)分析

水牛精子獲能差異蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)（圖4）分析結(jié)果表明，共有31 個蛋白質(zhì)存在互作關(guān)系，節(jié)點度數(shù)（Degree）平 均 值 為 3.86，節(jié) 點 中 介 性（Betweenness）平均值39.5。根據(jù)平均值設(shè)置參數(shù)，制作互作網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)這些差異表達蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)磷酸化、代謝調(diào)節(jié)作用以及糖的無氧氧化有關(guān)。調(diào)節(jié)通路的中心蛋白（Hub）有拓撲異構(gòu)酶2（Topoisomerase 2 alpha，TOP2A）、烯 醇 化 酶3（Enolase 3，ENO3）和烯醇化酶4（Enolase 4，ENO4），它們在維持互作網(wǎng)絡(luò)的穩(wěn)定性中起著中樞的作用。

圖4 獲能前后水牛精子DEPs的相互作用網(wǎng)絡(luò)Fig.4 The interaction network of DEPs before and after sperm capacitation in buffalo

2.6 獲能對水牛精子APOC3和VAMP4表達量的影響

為了檢驗組學(xué)定量數(shù)據(jù)的可靠性，通過Western blot對VAMP4和APOC3的表達水平進行分析。如圖5所示，VAMP4蛋白和APOC3蛋白均能檢測到雜交信號，其中獲能后精子中VAMP4 蛋白和APOC3 蛋白表達水平均顯著高于未獲能精子。Western blot 結(jié)果表明，VAMP4 和APOC3 在水牛精子的獲能過程中表達量逐漸升高（圖6）。在組學(xué)定量分析中，獲能精子中的VAMP4 蛋白和APOC3 蛋白表達量高于未獲能精子（圖7）。

圖5 獲能對水牛精子APOC3和VAMP4表達的影響Fig.5 Effects of capacitation on the expression of APOC3 and VAMP4 in buffalo sperm

圖6 獲能前后水牛精子APOC3和VAMP4相對表達水平Fig.6 Relative expression of APOC3 and VAMP4 in buffalo sperm before and after capacization

圖7 獲能前后水牛精子TMT標記定量結(jié)果Fig.7 Quantitative results of TMT labeling before and after buffalo sperm capacitation

3 結(jié)論與討論

本研究通過GO 分析發(fā)現(xiàn)，獲能前后水牛精子的DEPs 主要定位于細胞器與細胞質(zhì)中。由于精子細胞核在受精前需要維持遺傳信息的穩(wěn)定性，因此精子細胞核中的蛋白質(zhì)并不活躍[14]。受精時精子細胞核內(nèi)核心組蛋白（H3、H3.3、H2B、H2A、H2AX 和H4）激活并與卵子相互作用[15]，此時，細胞核內(nèi)的蛋白質(zhì)開始活躍。在KEGG 的分析結(jié)果中，APOC3 參與PPAR 信號通路，VAMP4 參與SNARE 信號通路。水牛精子獲能后，APOC3 和VAMP4 的表達量增高，表明APOC3和VAMP4與精子獲能密切相關(guān)。

APOC3 是肝臟和小腸分泌的一種與糖脂代謝有關(guān)的糖蛋白，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中成熟[16]，與脂質(zhì)代謝疾病相關(guān)[17-18]。前人研究表明，血液中極低密度脂蛋白（VLDL）的代謝率會隨著APOC3表達量的增高而降低[19]。在PPAR 信號通路中，APOC3 是脂質(zhì)代謝重要的調(diào)控因子。本研究中，獲能水牛精子組中APOC3 表達量上調(diào)，可能與精子在獲能前后的代謝方式不同有關(guān)。精子獲能過程需要大量能量維持其穩(wěn)定性，脂質(zhì)代謝產(chǎn)生的能量不足，需要其他代謝途徑聯(lián)合增加供能，APOC3 高表達抑制了獲能時的脂質(zhì)代謝（主要是VLDL 代謝）。而精子獲能后，由其他代謝途徑聯(lián)合增加供能，具體分子機制還需要進一步研究。

VAMP4 是一種僅表達于脊椎動物反面高爾基網(wǎng)絡(luò)（TGN）中的囊泡可溶性NSF 附著蛋白受體（Vesicle-SNAP receptor，v-SNARE）蛋白，在VAMP4缺失的情況下，高爾基體堆積正常，但高爾基體堆積長度縮短，其帶狀結(jié)構(gòu)被破壞[20]。VAMP 與SNARE 復(fù)合體成員參與調(diào)節(jié)葡萄糖轉(zhuǎn)運體（GLUT）介導(dǎo)的內(nèi)吞作用，為體細胞提供能量。VAMP4在維持精子頭部結(jié)構(gòu)以及頂體反應(yīng)中有重要作用[21]，精子頭部畸形率會隨著VAMP4 表達量降低而增加，同時，頂體囊泡也會出現(xiàn)一定的破裂和異型，從而導(dǎo)致精子細胞核外露。VAMP4 在頂體反應(yīng)中也具有一定的調(diào)控作用[22]，在頂體反應(yīng)中，頂體膜和頂體囊泡的結(jié)構(gòu)完整性對于頂體膜與卵細胞膜之間的融合至關(guān)重要。此外，在鼬鯊的相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)，VAMP4 可能對精子的活力和數(shù)量有一定影響[23]。在本研究獲能精子組中，VAMP4 表達量上調(diào)，推測VAMP4 可能在維持精子頭部結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定中發(fā)揮重要作用，并通過調(diào)節(jié)葡萄糖轉(zhuǎn)運促進頂體反應(yīng)的發(fā)生。

本研究通過差異蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)富集到一批與水牛精子獲能有關(guān)的蛋白質(zhì)。精子在獲能時需要大量能量維持相關(guān)反應(yīng)，同時，在頂體反應(yīng)前也需要保持頂體的完整性，APOC3 作為脂質(zhì)代謝的重要調(diào)控因子，與水牛精子獲能時的能量代謝緊密相關(guān)；VAMP4對水牛精子頂體反應(yīng)膜的融合與穩(wěn)定具有重要作用。APCO3 和VAMP4 在水牛精子獲能過程中起到重要作用，為在分子水平上全面揭示水牛精子的發(fā)育和成熟提供理論支持。