代玉榮，李云紅，穆立薔，吳 進(jìn)

（1. 黑龍江農(nóng)業(yè)工程職業(yè)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150088；2. 黑龍江省生態(tài)研究所，黑龍江 哈爾濱 150081；3. 東北林業(yè)大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150006；4. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，江西 南昌 330045）

大量元素的長(zhǎng)期不合理供應(yīng)和過量施用，造成土壤有機(jī)物質(zhì)利用率低、土壤物理結(jié)構(gòu)失衡、土壤鹽堿板結(jié)嚴(yán)重、地力有效性下降、作物產(chǎn)量低等問題，威脅糧食安全和人體健康[1-4]。因此，減少化肥使用量、改善土壤結(jié)構(gòu)、提高農(nóng)作物產(chǎn)量成為農(nóng)業(yè)領(lǐng)域亟待解決的問題。植物根圍促生細(xì)菌（Plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR）是附著于植物根際周圍的一類有益微生物，具有溶磷固氮、合成植物生長(zhǎng)激素、促進(jìn)氮磷鉀等大量元素吸收、增強(qiáng)植物光合作用、防治土傳病蟲害的作用[5-8]。研究表明，施用PGPR 菌劑能有效促進(jìn)辣椒（Capsicum annuum）植株生長(zhǎng)，增加辣椒單株產(chǎn)量及掛果數(shù)；土壤微生物細(xì)菌數(shù)量呈顯著增加趨勢(shì)，真菌數(shù)量明顯降低，具有溶磷、解鉀及固氮等功能的菌群數(shù)量總體上表現(xiàn)為上升趨勢(shì)[9]。梁建根等[10]的研究發(fā)現(xiàn)，PGPR 對(duì)黃瓜（Cucumis sativus）種子萌發(fā)、植株生長(zhǎng)和根系伸長(zhǎng)均有促進(jìn)作用，可促進(jìn)果實(shí)中葉綠素、蛋白質(zhì)、可溶性糖和維生素含量的增加。另有研究表明，PGPR 處理能夠顯著提高土壤有機(jī)質(zhì)、全氮、全磷、全鉀、有效磷和速效鉀含量，同時(shí)提高紫花苜蓿（Medicago sativa）株高、地下部鮮質(zhì)量、地上部鮮質(zhì)量以及植株全氮含量[11]。生物質(zhì)炭作為多功能的土壤改良劑，具有存碳量大、孔隙結(jié)構(gòu)疏松、含氧活性基團(tuán)數(shù)量多等特點(diǎn)，且能提供豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，防止土壤板結(jié)，為微生物活動(dòng)提供有益的繁殖和生存條件[12-14]。研究表明，溫室盆栽試驗(yàn)下小白菜（Brassica campestris）在添加不同比例的生物質(zhì)炭后產(chǎn)量顯著提高，且生物質(zhì)炭添加量與產(chǎn)量呈顯著正相關(guān)關(guān)系；生物質(zhì)炭對(duì)小白菜植株地上部和地下部的影響不一致；顯著增加了土壤中總氮含量[15]。張功臣等[16]也發(fā)現(xiàn)，施用生物質(zhì)炭可提高土壤肥力，速效氮、速效磷、速效鉀及有機(jī)質(zhì)含量顯著高于對(duì)照；顯著增加黃瓜葉片葉面積、莖稈粗度、地上部生物量和產(chǎn)量。

研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）和生物質(zhì)炭配施可增加水稻地上部株高及葉片數(shù)量，促進(jìn)根系的伸長(zhǎng)及側(cè)根的分化，效果顯著優(yōu)于單一處理[17]?？梢?，PGPR 和生物質(zhì)炭二者之間可能存在協(xié)同改善根系狀況、增強(qiáng)植物生理功能的作用。單獨(dú)添加生物質(zhì)炭或者接種PGPR 對(duì)植物生長(zhǎng)、土壤理化性質(zhì)和微生物群落影響的研究較多，而關(guān)于二者配施對(duì)植物生長(zhǎng)以及土壤微生物環(huán)境等影響的研究較少。鑒于此，以辣椒為研究對(duì)象，探究不同生物質(zhì)炭添加量下接種PGPR 對(duì)辣椒生長(zhǎng)、土壤理化性質(zhì)以及微生物群落組成等的影響，揭示生物質(zhì)炭和PGPR 的協(xié)同效應(yīng)，為今后應(yīng)用微生物協(xié)同技術(shù)促進(jìn)植物生長(zhǎng)、改善土壤條件提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

辣椒種子購自四川省川椒種業(yè)科技有限責(zé)任公司。PGPR 細(xì)菌為貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis），由中國科學(xué)院微生物研究所提供，將菌株轉(zhuǎn)移到牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基和無機(jī)鹽培養(yǎng)基培養(yǎng)備用。生物質(zhì)炭為花生炭殼（購自江蘇華豐農(nóng)業(yè)生物工程有限公司，炭化溫度為300～500 ℃）。供試土樣為121 ℃高溫滅菌2 h 后的壤土。土壤基本理化性質(zhì)：pH 值6.94、有機(jī)質(zhì)含量23.5 g/kg、全氮含量12.6 g/kg、速效磷含量107.8 mg/kg、速效鉀含量63.4 mg/kg。

1.2 試驗(yàn)方法

在0、1%、3%、9%生物質(zhì)炭添加量下，分別設(shè)置接種貝萊斯芽孢桿菌處理（PGPR）及不接種對(duì)照（NM），共8個(gè)處理：0+PGPR、1%+PGPR、3%+PGPR、9%+PGPR、0+NM、1%+NM、3%+NM、9%+NM，隨機(jī)排列，重復(fù)3 次。不同添加量生物質(zhì)炭處理以花生殼炭的形式添加到土壤中。

將辣椒種子用30 ℃溫水浸種8 h 后，置于恒溫培養(yǎng)箱中出芽。然后選取長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗移栽至花盆中（上盆口直徑20 cm、下盆口直徑15 cm，高13 cm），每盆移栽3 棵。待辣椒幼苗長(zhǎng)至二葉一心時(shí)，將20 mL PGPR 懸浮液（1×108cfu/mL）分別加入相應(yīng)處理，不接種對(duì)照則接種等量無菌水。試驗(yàn)于日光溫室中[白天/夜間溫度為（25～30）℃/（15～18）℃，相對(duì)濕度為70%]進(jìn)行，后期根據(jù)土壤肥力水平和植株生長(zhǎng)需要補(bǔ)充30%的Hoagland 營(yíng)養(yǎng)液，于70 d后觀測(cè)供試植株的各項(xiàng)指標(biāo)。

1.3 指標(biāo)測(cè)定

株高和干質(zhì)量等的測(cè)定：用直尺測(cè)定辣椒株高；采用霍爾德YMJ-B 植物葉面積測(cè)定儀測(cè)定葉面積；將植株地上部烘干（105 ℃、0.5 h）至恒質(zhì)量記作干質(zhì)量；采用GXY-A根系分析掃描儀測(cè)定根系構(gòu)型。

土壤微生物數(shù)量的測(cè)定：采用稀釋平板法[18]測(cè)定土壤中微生物數(shù)量。稱取10 g 辣椒根圍土壤于90 mL 的無菌水中，搖勻并用玻璃棒不斷攪拌稀釋，吸取10 μL 液體于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，用玻璃棒涂抹均勻，于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d 后計(jì)算微生物數(shù)量。

土壤養(yǎng)分含量測(cè)定：利用凱氏定氮儀測(cè)定土壤全氮含量；采用0.5 mol/L NaHCO3浸提-鉬銻抗比色法測(cè)定速效磷含量；采用中性乙酸銨溶液浸提、火焰光度計(jì)法測(cè)定速效鉀含量；采用水合熱重鉻酸鉀氧化比色法測(cè)定有機(jī)質(zhì)含量[19]。

土壤微生物生物量碳、氮測(cè)定：采用熏蒸浸提法測(cè)定土壤微生物生物量碳和土壤微生物生物量氮[19]。

土壤酶活性測(cè)定：采用紫外吸收法測(cè)定過氧化氫酶活性；采用鄰苯三酚比色法測(cè)定多酚氧化酶活性；采用磷酸苯二鈉比色法測(cè)定磷酸酶活性；采用2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）比色法測(cè)定脫氫酶活性[19]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2003 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和繪圖，采用DPS 9.0 和SPSS 11.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素、雙因素方差分析以及差異顯著性檢驗(yàn)（LSD法，α=0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 PGPR配施生物質(zhì)炭對(duì)辣椒生長(zhǎng)的影響

不同生物質(zhì)炭添加量下，PGPR 均能夠在辣椒根系穩(wěn)定定殖，產(chǎn)生促生效應(yīng)。在較低的生物質(zhì)炭添加量下，隨生物質(zhì)炭添加量的增加，辣椒株高、葉面積和地上干質(zhì)量增加，至9%生物質(zhì)炭添加量時(shí)又有所下降（表1）。在3%生物質(zhì)炭添加量下，接種PGPR 處理的辣椒株高最高，為23.1 cm；葉面積最大，為736.3 mm2；地上干質(zhì)量最大，為1.41 g。與3%+NM 相比，3%+PGPR 處理辣椒株高、葉面積、地上干質(zhì)量分別提高24.2%、77.3%、19.5%。

表1 PGPR配施生物質(zhì)炭處理下辣椒生長(zhǎng)情況Tab.1 Growth of C.annuum under PGPR combined with biomass carbon

2.2 PGPR配施生物質(zhì)炭對(duì)辣椒根系構(gòu)型的影響

同一生物質(zhì)炭添加量下，PGPR 能夠增加辣椒根系根尖數(shù)、根分叉數(shù)、根系總體積以及根系總投影面積，且不同處理間差異顯著（P＜0.05）。對(duì)于PGPR 處理或者不接種處理，在較低的生物質(zhì)炭添加量下，隨生物質(zhì)炭添加量的增加，辣椒根系根尖數(shù)、分叉數(shù)、總體積以及總投影面積增加，至9%生物質(zhì)炭添加量時(shí)又有所下降（表2）。與3%+NM 相比，3%+PGPR 處理辣椒根尖數(shù)、分叉數(shù)、總體積、總投影面積分別提高28.5%、13.2%、16.9%、8.8%。

表2 PGPR配施生物質(zhì)炭處理下辣椒根系構(gòu)型Tab.2 Root architecture of C.annuum under PGPR combined with biomass carbon

2.3 PGPR配施生物質(zhì)炭對(duì)辣椒根系土壤酶活性的影響

同一生物質(zhì)炭添加量下，PGPR 能夠增加辣椒根系土壤中脫氫酶、酸性磷酸酶、過氧化氫酶、多酚氧化酶活性，且不同處理間差異顯著（P＜0.05）。對(duì)于PGPR 處理或者不接種處理，在較低的生物質(zhì)炭添加量下，隨生物質(zhì)炭添加量的增加，脫氫酶、酸性磷酸酶、過氧化氫酶、多酚氧化酶活性增加，至9%生物質(zhì)炭添加量下稍下降（表3）。生物質(zhì)炭添加量3%下，接種PGPR 處理的辣椒根系土壤中脫氫酶活性最大，為1.333 mg/g；酸性磷酸酶活性最大，為60.70 mg/g；過氧化氫酶活性最大，為2.59 mL/g；多酚氧化酶活性最大，為0.240 mg/g。與3%+NM 相比，3%+PGPR 處理辣椒根系土壤中脫氫酶、酸性磷酸酶、過氧化氫酶、多酚氧化酶活性分別增加了16.2%、4.5%、28.2%、28.3%。

表3 PGPR配施生物質(zhì)炭處理下辣椒根系土壤酶活性Tab.3 Soil enzyme activities of C.annuum under PGPR combined with biomass carbon

2.4 PGPR配施生物質(zhì)炭對(duì)辣椒根系土壤養(yǎng)分含量的影響

同一生物質(zhì)炭添加量下，接種PGPR 處理能夠增加辣椒根系土壤中全氮含量，而降低土壤速效磷、速效鉀和有機(jī)質(zhì)含量，各處理間差異顯著（P＜0.05）。對(duì)于PGPR 處理或者不接種處理，在較低的生物質(zhì)炭添加量下，隨生物質(zhì)炭添加量的增加，土壤全氮、速效磷、速效鉀和有機(jī)質(zhì)含量呈先上升后下降的趨勢(shì)（表4），生物質(zhì)炭添加量為3%時(shí)接種PGPR 處理土壤全氮含量最高，達(dá)到19.8 g/kg。3%+NM 處理的土壤速效鉀、速效磷、有機(jī)質(zhì)含量均為最大，分別為113.1、140.1、33.9 mg/kg。

表4 PGPR配施生物質(zhì)炭處理下辣椒根系土壤養(yǎng)分含量Tab.4 Soil nutrient contents of C.annuum under PGPR combined with biomass carbon

2.5 PGPR配施生物質(zhì)炭對(duì)辣椒根系微生物群落組成的影響

同一生物質(zhì)炭添加量下，接種PGPR 處理顯著增加辣椒根系土壤中細(xì)菌、放線菌數(shù)量，降低真菌數(shù)量，各處理間差異顯著（P＜0.05）。不接種PGPR的處理，隨生物質(zhì)炭添加量的增加，土壤真菌數(shù)量顯著下降，細(xì)菌和放線菌的數(shù)量隨之增加，至9%生物質(zhì)炭添加量下數(shù)量又有波動(dòng)（表5）。3%+PGPR處理的細(xì)菌與放線菌數(shù)量均為最大，分別為5.37×105、2.83×105cfu/g。

表5 PGPR配施生物質(zhì)炭處理下辣椒根系土壤微生物群落組成Tab.5 Soil microbe number of C.annuum under PGPR combined with biomass carbon

2.6 PGPR配施生物質(zhì)炭對(duì)辣椒根系土壤微生物生物量碳、氮的影響

同一生物質(zhì)炭添加量下，接種PGPR 處理顯著增加辣椒根系土壤中微生物生物量碳、氮含量，各處理間差異顯著（P＜0.05）。PGPR 處理或者不接種處理下，隨生物質(zhì)炭添加量的增加，微生物生物量碳、氮含量增加，至9%生物質(zhì)炭添加量下稍下降（圖1）。3%+PGPR 處理的微生物生物量碳、氮含量達(dá)到最大，分別為133.7、18.7 mg/kg，分別是3%+NM處理的1.6、1.2倍。

圖1 PGPR配施生物質(zhì)炭處理下辣椒根系土壤微生物生物量碳、氮含量Fig.1 Soil microbial biomass carbon and nitrogen content of C.annuum under PGPR combined with biomass carbon

2.7 PGPR配施生物質(zhì)炭處理下辣椒各指標(biāo)方差分析

方差分析結(jié)果表明，不同生物質(zhì)炭添加量對(duì)辣椒株高、干質(zhì)量、葉面積、根系總投影面積、根分叉數(shù)、根尖數(shù)、根系總體積、真菌數(shù)量、細(xì)菌數(shù)量、放線菌數(shù)量、有機(jī)質(zhì)含量、全氮含量、速效磷含量、速效鉀含量、多酚氧化酶活性、酸性磷酸酶活性、脫氫酶活性、過氧化氫酶活性、微生物生物量氮含量、微生物生物量碳含量均有顯著影響。接種PGPR 與否僅對(duì)土壤真菌數(shù)量影響不顯著，對(duì)其余各指標(biāo)影響均顯著（表6）。不同生物質(zhì)炭添加量與接種PGPR 處理的交互作用對(duì)辣椒地上干質(zhì)量、真菌數(shù)量影響極顯著，對(duì)微生物生物量碳影響顯著，對(duì)其余指標(biāo)無顯著影響。

表6 PGPR配施生物質(zhì)炭處理下各指標(biāo)方差分析（F值）Tab.6 Two-way ANOVA of all the indexes under PGPR combined with biomass carbon（F value）

3 結(jié)論與討論

PGPR 作為一種土壤有益細(xì)菌，具有拮抗植物病原菌、促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育的作用。研究發(fā)現(xiàn)，PGPR 與寄主植物共生時(shí)，可刺激寄主作物的生長(zhǎng)并代謝多種有益成分，如氨基酸、蛋白質(zhì)、糖類等[20]。如接種同溫層芽孢桿菌（Bacillus stratosphericus）、蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）對(duì)苦草（Vallisneria natans）株高、根系長(zhǎng)度、總生物量具有促進(jìn)作用[21]。此外，土壤中豐富的有機(jī)物質(zhì)和無機(jī)物質(zhì)協(xié)同微生物種群在參與土壤根圈系統(tǒng)中生物化學(xué)循環(huán)時(shí)發(fā)揮重要作用，而二者又影響土壤養(yǎng)分（氮、磷、鉀）含量、土壤結(jié)構(gòu)、微生物數(shù)量、碳匯儲(chǔ)量、水分利用率以及土壤通氣情況等[22-23]。有研究發(fā)現(xiàn)，生物質(zhì)炭能促進(jìn)土壤微生物發(fā)育定殖，其主要作用是介導(dǎo)土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化，進(jìn)而影響土壤物理結(jié)構(gòu)性質(zhì)以及有機(jī)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)循環(huán)，直接或間接對(duì)植物生長(zhǎng)造成影響[24-25]。

本研究表明，施用生物質(zhì)炭或者接種PGPR 均可促進(jìn)辣椒生長(zhǎng)，改善植物根系情況。這可能是PGPR 定殖土壤后，產(chǎn)生生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素和赤霉素等植物激素，溶解土壤中礦物質(zhì)并合成鐵載體來促進(jìn)植物生長(zhǎng)。PGPR 配施生物質(zhì)炭已被證明可以改善植物生長(zhǎng)條件，包括烤煙[26]、櫻桃[27]等，這與本研究結(jié)果一致。本研究也證實(shí)，接種PGPR 并配施生物質(zhì)炭能夠增加辣椒根系總投影面積、總體積、根尖數(shù)和根尖分叉數(shù)。這可能是PGPR 促進(jìn)了根系表皮細(xì)胞壁木質(zhì)化，使得植物細(xì)胞增厚，促進(jìn)了辣椒根系的發(fā)育和分支，從而改變了辣椒根系形態(tài)。PGPR 配施生物質(zhì)炭不僅可以提高植物生長(zhǎng)和產(chǎn)量[28-29]，還可以促進(jìn)植物養(yǎng)分吸收，從而提高肥料利用效率。本研究條件下，PGPR 和生物質(zhì)炭處理后的土壤養(yǎng)分狀況得到顯著改善，這可能與所施用的生物質(zhì)炭原料有關(guān)，生物質(zhì)炭原材為花生殼，含有有機(jī)質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，經(jīng)土壤中微生物作用后大大提高土壤養(yǎng)分含量，加之生物質(zhì)碳具有高孔隙、高面積和高吸附化合物、細(xì)菌的能力，能夠進(jìn)一步改善土壤團(tuán)粒結(jié)構(gòu)，為PGPR 在土壤中定殖提供了良好的生態(tài)位。

土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)中維持物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng)的重要部分，其種類和數(shù)量隨土壤環(huán)境、土層厚度、施肥措施等的不同而變化，主要參與土壤硝化、固氮等過程。土壤酶活性的變化既與土壤微生物數(shù)量、植物種類有關(guān)，又與土壤養(yǎng)分循環(huán)有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，以束村氏菌屬（Tsukamurella）、伯克霍爾德氏菌屬（Burkholderia）的細(xì)菌以及兩者混合菌液作為接種物對(duì)花生作用后，花生根際土壤中影響土壤氮循環(huán)功能的菌群數(shù)量提高，細(xì)菌總數(shù)、固氮菌和溶磷菌數(shù)也顯著增加；土壤蔗糖酶、脲酶及過氧化氫酶活性均高于對(duì)照；土壤堿解氮及速效鉀含量也顯著提高，進(jìn)而證實(shí)PGPR 通過活化土壤微生物來提高植株的有效營(yíng)養(yǎng)元素含量，促進(jìn)生長(zhǎng)[30]。本研究發(fā)現(xiàn)，不同生物質(zhì)炭處理辣椒根系土壤中真菌呈現(xiàn)減少的趨勢(shì)，而細(xì)菌、放線菌數(shù)量增加；接種PGPR 后土壤細(xì)菌、放線菌數(shù)量也顯著高于對(duì)照；生物質(zhì)炭單獨(dú)處理或與PGPR 配合使用，均顯著增加土壤中各種酶活性。另有研究發(fā)現(xiàn)，生物質(zhì)炭處理在煙草生長(zhǎng)期間顯著提高土壤微生物生物量碳含量，平均提高60.0%，土壤微生物生物量氮含量是對(duì)照的2.3 倍，證實(shí)生物質(zhì)炭可以有效地提高煙草土壤中土壤微生物生物量碳、微生物生物量氮及土壤中氮素生物活性[31]。本研究表明，接種PGPR 后辣椒根系土壤中微生物生物量碳、氮含量都顯著增加，其平衡態(tài)勢(shì)受土壤營(yíng)養(yǎng)狀況、水分狀態(tài)等綜合影響，具體原因還需進(jìn)一步研究。

綜上可知，PGPR 能夠促進(jìn)辣椒生長(zhǎng)和有機(jī)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的積累，改善辣椒根系構(gòu)型，增加根系總投影面積、總體積、根尖數(shù)和根尖分叉數(shù)。此外，PGPR 能夠促進(jìn)土壤微生物生物量碳、氮的積累，提高土壤中蔗糖酶、脲酶、過氧化氫酶和多酚氧化酶等活性，進(jìn)而增加土壤中細(xì)菌、放線菌數(shù)量，降低真菌數(shù)量。以PGPR 配施3%生物質(zhì)炭時(shí)促進(jìn)辣椒生長(zhǎng)、改善土壤微環(huán)境的效果為最佳。