廖金梅，鄧業(yè)成，鄧志勇，蒙思妤，韋堅芬，黃玲玉，徐紫薇，駱海玉

（珍稀瀕危動植物生態(tài)與環(huán)境保護省部共建教育部重點實驗室/廣西師范大學 生命科學學院，廣西 桂林 541006）

我國植物資源豐富多樣，是結構多樣、活性特殊的天然活性物質的重要來源，其中相當多的植物成分具有抑菌活性[1-3]。發(fā)掘具有較好農用抑菌活性的植物，可為植物源抑菌劑的開發(fā)提供材料[4-8]。我國農業(yè)主要危害為病、蟲和草害，其中由真菌及細菌引起的病害所帶來的作物損失極大[9-10]。為了防治真菌性病害和細菌性病害，大量地使用化學農藥進行防治[11]，導致土壤及水源中的農藥殘留問題日益嚴重[12-15]。植物源抑菌劑具有環(huán)保、無殘留、無污染、對人畜安全無毒、對病害特異性強等特點，采用植物源抑菌劑替代化學抑菌劑防治植物病害，有助于促進農業(yè)良好、綠色發(fā)展[16-18]。因此，對植物進行抑菌活性篩選，深入研究植物天然有效成分對病原菌的防治作用對植物源抑菌劑的開發(fā)具有重要意義。

目前，有關植物活性成分對病原菌的抑制活性研究主要為單一地對某種或某幾種動物病原細菌，以及單一地對某種或某幾種植物病原真菌。如王紅剛等[19]研究了九里香等5 種南藥植物提取物對番茄晚疫病菌致病疫霉的抑制作用，發(fā)現九里香提取物的石油醚萃取組分對致病疫霉的抑菌活性較高。張梅等[20]通過測定9 種植物提取物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌3 種病原細菌的抑菌強度，從中篩選了4種植物提取物進一步復配，得到一種抑菌性較強的植物源防腐劑。吳文能等[21]研究發(fā)現，花椒、金銀花、生姜和八角茴香4 種植物提取物對獼猴桃軟腐病4種主要致病菌均具有一定的抑菌活性。

自然界中現有植物約50萬種，但僅5%～15%的植物被研究過，可見作為抑菌藥物來源的植物資源和天然產物的潛力尚未充分利用[22-23]，且同時以多種植物病原真菌和多種動物病原細菌作為供試菌，研究廣譜抑菌植物的報道較少。鑒于此，測定了黃皮等23 種植物的甲醇提取物對8 種植物病原真菌和9 種動物病原細菌的抑菌活性，旨在尋找對植物病原真菌與動物病原細菌有廣譜抑菌活性的植物，為下一步分離及純化植物的活性成分提供研究材料，并為開發(fā)更豐富的植物源抑菌劑提供科學依據。

1 材料和方法

1.1 材料

供 試 植 物：楊 梅[Myrica rubra（Lour.）S. et Zucc.]、黃皮[Clausena lansium（Lour.）Skeels.]、構樹（Broussonetia papyrifera）等23 種供試植物原材料采自廣西桂林、廣西梧州。

供試8 種植物病原真菌：辣椒炭疽病菌（Colletotrichum capsici）、茶輪斑病菌（Pestalotiopsis theae）、甘藍黑斑病菌（Alternaria oleracea）、甘蔗鳳梨病菌（Ceratocystis paradoxa）、玉米大斑病菌（Exserohilum turcicum）、貢柑鏈格孢菌（Alternaria citri）、根腐病菌（Fusarium oxysporum）、白絹病菌（Athelia rolfsii）。

供試9 種動物病原細菌：藤黃微球菌（Micrococcus luteus）、大腸桿菌（Escherichia coli）、普通變形桿菌（Proteusbacillus vulgaris）、金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）、蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）、巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）、炭疽桿菌（Bacillus anthraci）、溶 壁 微 球 菌（Micrococcus lysodeikticus）、乙 型 副 傷 寒 桿 菌（Bacterium paratyphosumB）。

以上供試植物病原真菌及動物病原細菌均由廣西師范大學珍稀瀕危動植物生態(tài)與環(huán)境保護省部共建教育部重點實驗室化學生態(tài)實驗室提供。

1.2 方法

1.2.1 供試植物甲醇提取物的制備 參照王學貴等[14]和魏敬懷等[15]的方法，通過甲醇冷浸提取法對供試植物的有效成分進行初步提取。采集新鮮的植物葉片、枝、花或莖等部位，烘干粉碎后用篩網（孔徑0.3 mm）過篩，取植物干粉、甲醇按1∶5（m/V）的比例混勻，超聲振蕩30 min 后，于室溫下浸泡72 h 進行抽濾，濾液經旋轉蒸發(fā)儀減壓濃縮得到樣品植物的甲醇提取物。濾渣重復浸泡2 次并旋蒸，合并3 次旋蒸所得的甲醇提取物，保存于4 ℃冰箱中備用。

1.2.2 植物有效成分的分離（液-液萃取分離） 根據初篩結果進行第2 次篩選，采用液-液萃取分離法[24-26]對黃皮葉甲醇提取物進行初步分離。取黃皮葉甲醇提取物，用適量蒸餾水溶解或分散后，依次用與蒸餾水等體積的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇進行萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物、萃余物，于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 對8種植物病原真菌的抑制活性測定 結合帶毒平板法和菌絲生長速率法[27-29]，測定23 種植物甲醇提取物（10 mg/mL）以及黃皮4 種萃取物（5 mg/mL）對8 種植物病原真菌菌絲生長的抑制活性。將植物提取物或萃取物配制成相應濃度的藥液（溶劑為丙酮∶無菌水=1∶1），取1 mL藥液（對照用等量溶劑代替）與9 mL PDA 培養(yǎng)基混合均勻，倒入直徑為9 cm 的培養(yǎng)皿中待其冷卻。用直徑為0.4 cm 的無菌打孔器切取菌餅，每皿接3 個菌餅（呈“品”字形分布），菌餅長滿菌絲面朝下緊貼在培養(yǎng)基表面，每個處理設3 個重復。置于培養(yǎng)箱中（27±1）℃倒置培養(yǎng)72 h 后，采用十字交叉法測量菌落生長直徑，取平均值，計算抑菌率。

抑菌率=（對照菌落直徑-處理菌落直徑）÷（對照菌落直徑-0.4）×100%。

1.2.4 對8種植物病原真菌毒力大小的測定 按照

1.2.3 所述方法將植物提取物或萃取物依次配制一系列濃度梯度的帶毒平板，每個濃度處理設3 個重復，根據抑菌率測定植物提取物或黃皮4 種萃取物對病原真菌的毒力大小，并求出毒力回歸方程、有效抑制中質量濃度（EC50）等。

1.2.5 對9種動物病原細菌的抑菌活性測定 結合帶毒平板法和平板稀釋涂布法[30]，測定23 種植物甲醇提取物（10 mg/mL）以及黃皮4 種萃取物（5 mg/mL）對9 種動物病原細菌的抑制活性。將適量植物提取物或萃取物配制成一定濃度的藥液（溶劑為丙酮∶無菌水=1∶1），取1 mL 藥液（對照用等量溶劑代替）與9 mL PDA 培養(yǎng)基混合均勻，倒入直徑為9 cm 的培養(yǎng)皿中待其冷卻。取已活化菌種0.1 mL 與無菌水9.9 mL 混勻制成菌懸液，吸取菌懸液0.1 mL 到平板培養(yǎng)基上，涂布均勻制成帶毒培養(yǎng)平板，每個處理設3 個重復。陽性對照用溶劑代替藥液，陰性對照涂布無菌水，其他條件不變，于（37±1）℃培養(yǎng)72 h后，觀察結果并記錄。

1.2.6 對9 種動物病原細菌最低抑制質量濃度（MIC）的測定 采用倍數稀釋法，將植物提取物或黃皮4 種萃取物用溶劑（丙酮∶無菌水=1∶1）溶解配成藥液，按照1.2.5中所述方法依次配制一系列濃度梯度的帶毒培養(yǎng)平板，（37±1）℃培養(yǎng)72 h 后觀察結果，以不長菌的最低濃度為藥液對病原細菌的MIC值。

1.3 數據處理

采用Microsoft Excel 2010 和SPSS 25.0 軟件對數據進行統計及差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 23種植物甲醇提取物對8種植物病原真菌的抑菌活性

從表1 可以看出，當植物甲醇提取物質量濃度為10 mg/mL 時，黃皮葉甲醇提取物對所有供試植物病原真菌都有一定的抑菌作用，且抑菌率均在60%以上，其中對玉米大斑病菌、茶輪斑病菌、甘蔗鳳梨病菌的抑制效果較佳，抑菌率分別為85.64%、82.94%、82.49%；對白絹病菌、辣椒炭疽病菌的抑菌率分別為76.89%、68.09%；而對甘藍黑斑病菌、貢柑鏈格孢菌、根腐病菌的抑菌率分別為64.81%、63.55%、61.19%。

表1 23種植物甲醇提取物（10 mg/mL）對8種植物病原真菌的抑制活性Tab.1 Inhibitory activity of methanol extracts（10 mg/mL）from 23 plants against eight plant pathogenic fungi

商陸對辣椒炭疽病菌、茶輪斑病菌、甘蔗鳳梨病菌、玉米大斑病菌、白絹病菌5種植物病原真菌也具有較好的抑菌作用，尤其是玉米大斑病菌，抑菌率達91.70%；楊梅、五爪金龍、蘇門白酒草和假臭草等植物甲醇提取物集中表現在對玉米大斑病菌、甘藍黑斑病菌或甘蔗鳳梨病菌等的抑菌作用上，尤其是假臭草，對甘蔗鳳梨病菌的抑菌率高達94.55%。

此外，構樹、黃花稔2種植提取提物對茶輪斑病菌，蘇門白酒草、酸模2種植物提取物對貢柑鏈格孢菌以及決明提取物對根腐病菌分別表現出不同程度的負抑制效果，表明以上植物的提取物中可能存在對茶輪斑病菌、貢柑鏈格孢菌或根腐病菌菌絲生長起促進作用的物質。

上述結果表明，黃皮、楊梅、五爪金龍、蘇門白酒草、假臭草、商陸6種植物的甲醇提取物對植物病原真菌具有較好的抑制作用，其中黃皮葉甲醇提取物對植物病原真菌的抑制活性較為明顯和廣譜。

2.2 黃皮等6種植物甲醇提取物對植物病原真菌的毒力

為進一步明確黃皮、楊梅等6種植物甲醇提取物對植物病原真菌的抑制活性，測定了6種植物甲醇提取物對相應植物病原真菌（質量濃度為10 mg/mL時，抑菌率≥60%）的毒力。結果（表2）表明，黃皮葉甲醇提取物對玉米大斑病菌菌絲的毒力最高，EC50值為0.033 2 mg/mL，對甘蔗鳳梨病菌、白絹病菌的EC50值分別為0.406 4、0.750 1 mg/mL；黃皮葉甲醇提取物對根腐病菌菌絲的毒力最低，EC50值為5.172 7 mg/mL，對辣椒炭疽病菌、茶輪斑病菌、甘藍黑斑病菌和貢柑鏈格孢菌的EC50值則為1.325 3～4.188 3 mg/mL。

表2 6種植物甲醇提取物對植物病原真菌菌絲的毒力Tab.2 Virulence of methanol extracts from six plants against hyphae of plant pathogenic fungi

楊梅、五爪金龍、蘇門白酒草、假臭草及商陸等幾種植物中，以五爪金龍甲醇提取物對玉米大斑病菌菌絲毒力最高，EC50值為0.080 3 mg/mL；同時，五爪金龍、蘇門白酒草、假臭草及商陸的甲醇提取物對甘蔗鳳梨病菌菌絲的毒力均較高，EC50值為0.255 9～0.789 7 mg/mL。

2.3 23種植物甲醇提取物對9種動物病原細菌的抑菌活性

由表3 可見，當甲醇提取物質量濃度為10 mg/mL 時有15 種植物的甲醇提取物對至少1 種動物病原細菌具有抑菌活性，其中黃皮葉與楊梅葉的甲醇提取物對9 種動物病原細菌均有抑制作用，且最低抑制質量濃度均≤10 mg/mL。

表3 15種植物甲醇提取物對9種動物病原細菌的MICTab.3 MIC of methanol extracts from 15 plants against nine animal pathogenic bacteria

蟛蜞菊除對炭疽桿菌、假臭草除對普通變形桿菌無抑制作用或弱抑制作用外，二者的甲醇提取物對其余相應的8種動物病原細菌均有較好的抑制作用，且只有這2種植物和黃皮、楊梅的甲醇提取物對金黃色葡萄球菌具有抑制作用。蘇門白酒草對藤黃微球菌、大腸桿菌、蠟樣芽孢桿菌、炭疽桿菌均有較好的抑制作用。

綜上可知，黃皮、楊梅、蟛蜞菊、假臭草、蘇門白酒草、五爪金龍等15 種植物甲醇提取物對至少1 種動物病原細菌的生長具有抑制活性，其中黃皮葉與楊梅葉的甲醇提取物對動物病原細菌的抑制活性較為明顯和廣譜。

2.4 15種植物甲醇提取物對相應動物病原細菌的MIC

由表3 可知，黃皮葉甲醇提取物對9 種動物病原細菌的抑制活性優(yōu)于其他植物提取物的活性，MIC 為0.625～2.5 mg/mL。其次，蟛蜞菊提取物對大腸桿菌、普通變形桿菌、金黃色葡萄球菌的MIC 處于1.25～5 mg/mL，對其余5 種動物病原細菌的MIC均為0.625 mg/mL。楊梅葉提取物對藤黃微球菌的MIC為1.25 mg/mL，對其余8種動物病原細菌的MIC則≥2.5 mg/mL。除蘇門白酒草提取物對大腸桿菌、筒軸茅提取物對藤黃微球菌的MIC 為2.5 mg/mL外，枇杷、五爪金龍、艾草、假臭草、三葉鬼針草、野葛等多種植物提取物對相應動物病原細菌的MIC均≥5 mg/mL。

2.5 黃皮葉提取物各萃取物的抑菌活性

2.5.1 對植物病原真菌的抑制活性 初篩中測定了23種植物提取物對8種植物病原真菌及9種動物病原細菌的抑菌活性，結果表明，黃皮葉甲醇提取物的綜合抑菌活性較好。根據初篩結果進行第二次篩選，采用液-液萃取分離法對黃皮葉甲醇提取物進行初步分離，得石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和萃余物，各部分的百分含量分別為36.67%、9.03%、23.57%和21.65%。分別測定各萃取物（5 mg/mL）對8 種植物病原真菌的抑菌活性，結果見表4。

表4 黃皮葉提取物各萃取物（5 mg/mL）對8種植物病原真菌的抑制活性Tab.4 Inhibitory activities of different extracts（5 mg/mL）from crude extracts of Clausena lansium leaves on eight plant pathogenic fungi

石油醚萃取物對根腐病菌的抑菌率為65.14%，對其余植物病原真菌的抑菌率均高于75%，石油醚萃取物對除玉米大斑病菌外7種植物病原真菌的抑菌率均顯著高于另外3種萃取物的抑菌率。

乙酸乙酯萃取物對甘蔗鳳梨病原菌和玉米大斑病菌的抑菌活性較強，分別為83.37%和81.08%；其次，對辣椒炭疽病菌、茶輪斑病菌、貢柑鏈格孢菌、白絹病菌的抑菌率在60%～80%，而對甘藍黑斑病菌、根腐病菌的抑菌率則均低于60%。

正丁醇萃取物對甘蔗鳳梨病菌和玉米大斑病菌的抑菌活性較好，分別為81.52%和86.04%，對其余植物病原真菌的抑菌率均低于60%；而萃余物對8種植物病原真菌的抑菌率均較低（6%～60%）。

上述研究結果說明，黃皮葉甲醇提取物對植物病原真菌的抑制活性成分主要存在于石油醚萃取物中，同時也有小部分處于乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物中。

據表4 可知，黃皮葉石油醚萃取物對8 種植物病原真菌、乙酸乙酯萃取物對6種植物病原真菌、正丁醇萃取物對2 種植物病原真菌的抑菌效果較佳，進一步測定3 種萃取物對相應植物病原真菌的毒力，追蹤抑菌活性物質所在萃取層部位，結果見表5。石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物對玉米大斑病菌菌絲的毒力均為最高，EC50值分別為0.010 2、0.016 4、0.433 2 mg/mL。石油醚萃取物對根腐病菌的毒力最低，EC50值為0.744 1 mg/mL，對其余6 種植物病原真菌的EC50值則為0.078 3～0.441 8 mg/mL；乙酸乙酯萃取物對除玉米大斑病菌外其余5 種相應植物病原真菌的EC50值為0.636 9～1.552 0 mg/mL；正丁醇萃取物對甘蔗鳳梨病菌的EC50值則為1.666 2 mg/mL。

表5 黃皮葉提取物各萃取物對植物病原真菌菌絲的毒力Tab.5 Virulence of different extracts from crude extracts of Clausena lansium leaves on hypha of plant pathogenic fungi

2.5.2 對動物病原細菌的抑制活性 由表6 可知，黃皮葉甲醇提取物的石油醚萃取物及乙酸乙酯萃取物（5 mg/mL）對9 種動物病原細菌的生長均有抑制效果，其中石油醚萃取物對9 種動物病原細菌的MIC 為0.156 3～1.250 0 mg/mL，均低于或等于乙酸乙酯萃取物（0.625 0～2.500 0 mg/mL），表明黃皮葉甲醇提取物的石油醚萃取物對動物病原細菌的抑制活性優(yōu)于乙酸乙酯萃取物。

表6 黃皮葉提取物各萃取物對9種動物病原細菌的抑制活性及MICTab.6 Inhibitory activities and MIC values of different extracts from crude extracts of Clausena lansium leaves on nine animal pathogenic bacteria

續(xù)表6 黃皮葉提取物各萃取物對9種動物病原細菌的抑制活性及MIC值Tab.6（Continued） Inhibitory activities and MIC values of different extracts from crude extracts of Clausena lansium leaves on nine animal pathogenic bacteria

3 結論與討論

本研究報道了23 種植物的甲醇提取物對8 種植物病原真菌和9種動物病原細菌的抑菌活性初篩結果，并對初篩后抑菌效果較好的植物進行復篩。結果顯示，黃皮、楊梅、五爪金龍、蘇門白酒草、假臭草、商陸6 種植物甲醇提取物對植物病原真菌具有較好的抑制活性，黃皮葉甲醇提取物對8 種供試植物病原真菌的抑菌率均在60%以上。劉序銘等[31]研究結果說明，黃皮植株甲醇提取物對香蕉炭疽病菌、白菜黑斑病菌、玉米莖基腐病菌等12 種病原真菌具有抑制活性，結合本研究結果，黃皮葉甲醇提取物對病原真菌具有一定的抑菌廣譜性。后續(xù)研究發(fā)現，黃皮葉甲醇提取物的石油醚萃取物對8 種植物病原真菌的抑菌率顯著高于其他3 種萃取物，乙酸乙酯萃取物及正丁醇萃取物對甘蔗鳳梨病菌和玉米大斑病菌2 種植物病原真菌的抑制活性較佳，萃余物對8種植物病原真菌的抑制率均較低。

黃皮、楊梅、蟛蜞菊、假臭草、蘇門白酒草、五爪金龍等15 植物甲醇提取物對至少1 種動物病原細菌的生長具有抑制活性，其中黃皮葉甲醇提取物對9 種動物病原細菌均有抑制作用。趙豐麗等[32]研究結果顯示，黃皮葉提取物對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的MIC 均小于4 mg/mL，這與本研究結果相符，本研究中黃皮葉甲醇提取物對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的MIC分別為0.625、2.5 mg/mL。后續(xù)研究結果表明，黃皮葉甲醇提取物的石油醚萃取物對9種動物病原細菌的MIC 為0.156 3～1.250 0 mg/mL，其抑菌活性明顯優(yōu)于乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和萃余物。

綜上，在對23 種植物的抑菌活性初篩中，黃皮葉甲醇提取物對8 種植物病原真菌和9 種動物病原細菌的綜合抑菌效果最優(yōu)，復篩中黃皮葉甲醇提取物的石油醚萃取物綜合抑菌活性最強。當前，國內外對黃皮的研究報道多集中于黃皮成分在食品防腐保鮮、醫(yī)用保肝促智、抗氧化、藥用降糖降脂等方面，其綜合性研究尤其在農業(yè)領域的研究還需進一步重視[33-37]。本研究結論為合理利用黃皮資源，將黃皮葉活性成分研制為新型有效的植物源抑菌劑提供了科學依據，對解決目前農業(yè)病害危害嚴重、化學防治殘留污染大等問題具有重要意義。本研究雖只對綜合抑菌效果最佳的黃皮葉甲醇提取物做了深入的研究，但楊梅、蘇門白酒草、假臭草等植物提取物也具有深入研究并開發(fā)為有效植物源抑菌劑的潛力。