王俊娜，李凌薇，王秋霞，師 雯，張 新，劉興友，姜金慶，裴大偉

（1. 河南科技學(xué)院 動(dòng)物科技學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003；2. 新鄉(xiāng)學(xué)院 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003；3. 厚德食品股份有限公司，吉林 遼源 136200 ）

禽腺病毒（Fowl adenovirus，F(xiàn)AdV）為無囊膜的雙鏈DNA病毒，為腺病毒科、腺病毒屬的成員，是家禽和野禽常見的病原之一。FAdV 包括Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ等3 個(gè)群，其中Ⅱ群FAdV 主要引起火雞出血性腸炎；Ⅲ群FAdV 主要引起減蛋綜合征[1]；而臨床上常見的心包積水（Hydropericardium syndrome，HPS）、包涵體肝炎（Inclusion body hepatitis，IBH）和心包積水-肝 炎 綜 合 征（Hydropericardium hepatitis syndrome，HHS）多為Ⅰ群引起[2]。HHS 最早于1987 年發(fā)生在巴基斯坦安哥拉地區(qū)，隨后逐漸傳入多個(gè)國家，成為嚴(yán)重危害家禽業(yè)的傳染病之一。2012 年起，我國山東、河北、遼寧等地陸續(xù)出現(xiàn)HHS 病例。2015 年夏季，Ⅰ群FAdV 在山東、河南等多個(gè)省份肆虐[3]，給家禽業(yè)造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失。目前，Ⅰ群中FAdV-4 可以單獨(dú)引起發(fā)病，而其他毒株往往需要免疫抑制因素的協(xié)同作用才能致病[4]。

FAdV 外殼蛋白主要由240 個(gè)六鄰體蛋白（Hexon）、12 個(gè)五鄰體蛋白（Penton）和纖維蛋白（Fiber）等構(gòu)成，其中Hexon 蛋白是主要的結(jié)構(gòu)蛋白，也是病毒表面含量最高的蛋白質(zhì)，帶有主要的屬和亞屬特異性抗原決定簇，可用于FAdV 基因分型[5-6]。2020 年6—8 月，河南省新鄉(xiāng)市周邊地區(qū)多個(gè)養(yǎng)雞場發(fā)生疑似FAdV 感染類疫病，感染雞多為4～6 周齡的雛雞。為了解新鄉(xiāng)市周邊養(yǎng)殖場FAdV流行情況，采集4個(gè)規(guī)模化養(yǎng)殖場送檢的疑似FAdV感染的15份雞肝臟病料，針對(duì)FAdV-4Hexon基因保守區(qū)設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行PCR 檢測，對(duì)獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序和序列分析，以期了解FAdV 新鄉(xiāng)株的遺傳進(jìn)化關(guān)系，為研究其分子流行病學(xué)奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 病料樣品 對(duì)4個(gè)養(yǎng)雞場送檢的病雞進(jìn)行剖檢，隨機(jī)采集15 份疑似FAdV 感染雞肝臟病料。

1.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物 SPF雞胚購自北京勃林格殷格翰維通生物技術(shù)有限公司，SPF雞由SPF雞胚孵化。

1.1.3 主要試劑 rTaq DNA 聚合酶、DL2000 Marker、pMD18-T 載體、病毒DNA 提取試劑盒等購自寶生物工程（大連）有限公司；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自O(shè)mega 公司；其他常規(guī)試劑均為分析純?cè)噭?/p>

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 參考GenBank 中FAdV-4 SDSX

株基因序列（GenBank 登錄號(hào)為KT899325），利用Oligo（Version 6.0）軟件，針對(duì)Hexon基因設(shè)計(jì)2對(duì)特異性引物，引物序列和擴(kuò)增長度見表1。引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。

表1 試驗(yàn)中所用PCR擴(kuò)增引物Tab.1 Primers used for PCR in this study

1.2.2 組織病料DNA 的提取 取采集的病雞肝組織，研磨后加入含青鏈霉素的PBS 制成懸液，反復(fù)凍融3 次，8 000 r/min 離心10 min，取上清液使用試劑盒按說明書提取病毒DNA。

1.2.3Hexon基因的PCR 檢測 以提取的DNA 為模板，先使用設(shè)計(jì)的第1對(duì)引物進(jìn)行擴(kuò)增，再使用第2 對(duì)引物進(jìn)行檢測。PCR 反應(yīng)體系：模板DNA 2 μL，dNTP 2 μL，10×Buffer 2.5 μL，上、下游引物各1 μL，rTaq 聚合酶0.5 μL，補(bǔ)水至25 μL；以去離子水為空白對(duì)照。擴(kuò)增程序：95 ℃2 min；95 ℃1 min，55 ℃30 s，72 ℃20 s，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min；4 ℃終止。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析。

1.2.4 擴(kuò)增產(chǎn)物測序及序列分析 擴(kuò)增產(chǎn)物回收后送生工生物工程（上海）有限公司進(jìn)行測序鑒定，并對(duì)所得序列進(jìn)行分析。與GenBank 中FAdV-4Hexon基因核苷酸序列進(jìn)行比對(duì)分析，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。參考病毒株包括印度、韓國和國內(nèi)的一些分離株，具體信息見表2。

表2 同源性分析所參考毒株信息Tab.2 Strain information referenced for homology analysis

續(xù)表2 同源性分析所參考序列信息Tab.2（Continued） Sequence information referenced for homology analysis

1.2.5 動(dòng)物回歸試驗(yàn) 根據(jù)測序結(jié)果，選取鑒定為陽性的病雞肝臟組織，液氮研磨后，加入無菌PBS充分混勻溶解，10 000 r/min 離心10 min，收集上清液，經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過濾除菌后，經(jīng)卵黃囊接種9日齡SPF雞胚；收集48 h后死亡和未死亡雞胚尿囊液，盲傳7 代進(jìn)行純繁；收集尿囊液，過濾除菌，按0.2 mL/只的劑量（含103EID50病毒）接種3 周齡SPF雞（對(duì)照組接種同體積的無菌PBS），每日觀察臨床癥狀。對(duì)病死雞剖檢，觀察病理變化，并取肝臟組織制備石蠟切片，HE染色觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 Hexon基因片段PCR擴(kuò)增結(jié)果

將采集的15份病死雞肝臟組織研磨，提取病毒DNA 作為模板，使用設(shè)計(jì)的Hexon-F1/R1 引物對(duì)進(jìn)行擴(kuò)增，并使用Hexon-F2/R2 引物對(duì)進(jìn)一步驗(yàn)證。Hexon-F1/R1 引物對(duì)電泳結(jié)果顯示，有8 個(gè)樣品在約300 bp 處出現(xiàn)明顯特異性條帶，有4 個(gè)樣品出現(xiàn)弱條帶，與預(yù)期擴(kuò)增片段長度相符；另有3個(gè)樣品未出現(xiàn)明顯條帶（圖1）。進(jìn)一步使用Hexon-F2/R2 引物對(duì)進(jìn)行驗(yàn)證擴(kuò)增，結(jié)果與Hexon-F1/R1 引物對(duì)擴(kuò)增結(jié)果一致，表明設(shè)計(jì)的引物能夠特異性擴(kuò)增Hexon基因片段。

圖1 不同樣品Hexon基因片段的PCR擴(kuò)增Fig.1 PCR amplification of Hexon gene fragment in different samples

2.2 Hexon基因擴(kuò)增片段序列比對(duì)結(jié)果

將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行切膠純化，回收產(chǎn)物送公司進(jìn)行測序。測序結(jié)果經(jīng)NCBI BLAST 分析顯示，擴(kuò)增的部分Hexon基因序列均與FAdV-4 GDMZ 株（MG856954） 、 FAV-C CH/GDHZ-S7/2017 株（MK875249）、FAV-C GX-1 株（MH454598）等序列高度同源。測序結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，本研究設(shè)計(jì)的引物具有較高的特異性，擴(kuò)增得到特異性的部分Hexon基因片段。

2.3 Hexon基因片段序列分析結(jié)果

根據(jù)BLAST 比對(duì)結(jié)果，擴(kuò)增的基因片段為FAdVHexon基因2 個(gè)不同位置的序列，將毒株命名為XX。將XX 與GenBank 參考毒株的Hexon基因核苷酸序列進(jìn)行同源性分析（圖2），結(jié)果顯示，XX 與FAdV-4Hexon高度同源，相似性大于95%；而與FAV-1 代 表 株CELO（U46933）同 源 性 較 低，為71.3%；與鴨FAdV-Ⅰ型代表株EDS（Y09598）同源性為15.9%。

圖2 FAdV核苷酸序列同源性比對(duì)結(jié)果Fig.2 Homology alignment results of nucleotide sequences of FAdV Hexon gene

根據(jù)同源性分析結(jié)果，利用Mega軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖3）。從圖3 可以看出，本研究分離的XX株與FAdV-4 毒株處于同一個(gè)分支，有較近的親緣關(guān)系，而與FAdV-1 代表株CELO 和鴨FAdV-Ⅰ型代表株EDS 位于不同的分支，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，進(jìn)一步表明分離的毒株為FAdV-4型毒株。

圖3 FAdV-4型XX株的遺傳進(jìn)化分析Fig.3 Phygenetic analysis of FAdV-4 XX strain

2.4 動(dòng)物回歸試驗(yàn)結(jié)果

將純繁后的病毒感染3 周齡SPF 雞，感染后前2 d，SPF 雞無明顯臨床癥狀，僅略有精神沉郁現(xiàn)象；3 d 后病雞出現(xiàn)明顯的精神沉郁、食欲減退現(xiàn)象，部分雞出現(xiàn)腹瀉情況；4 d后有雞只開始死亡，7 d后死亡逐漸停止；觀察至10 d，病雞死亡率達(dá)60%。剖檢可見死亡雞出現(xiàn)與臨床采集病例相似的癥狀，肝臟質(zhì)脆易碎，表面出現(xiàn)大小不等的出血點(diǎn)；心臟有明顯的心包積液，呈淡黃色透明狀（圖4）。

圖4 FADV-4 XX株感染雞組織病變Fig.4 Tissue lesions of SPF chicken infected by FADV-4 XX strain

將采集的肝臟進(jìn)行組織病理學(xué)分析，與對(duì)照組雞的肝臟切片比較，結(jié)果顯示，感染組病雞的肝臟細(xì)胞核固縮，胞質(zhì)溶解，有淋巴細(xì)胞浸潤，出現(xiàn)明顯的壞死灶，在壞死灶的中心可看到包涵體（圖5）。

圖5 FADV-4 XX株感染雞組織病理學(xué)觀察Fig.5 Histopathologic observation of SPF chicken infected by FADV-4 XX strain

3 結(jié)論與討論

2012 年以來，禽心包積水-包涵體肝炎綜合征在我國時(shí)有發(fā)生；2015 年在我國多個(gè)地方暴發(fā)流行，給我國養(yǎng)禽業(yè)造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失[3]。該病主要由FAdV-4引起，具有高度傳染性，導(dǎo)致高死亡率[7]，世界各地均有發(fā)生[8-10]。目前，禽心包積水-包涵體肝炎綜合征在我國仍然零星散發(fā)，新鄉(xiāng)市周邊多個(gè)雞場出現(xiàn)疑似病例，死亡率較之前有所下降。

新鄉(xiāng)市畜牧業(yè)比較發(fā)達(dá)，據(jù)新鄉(xiāng)市統(tǒng)計(jì)局統(tǒng)計(jì)，2018 年底，全市生豬存欄272.90 萬頭，家禽存欄3 159.16 萬只[11]，一旦發(fā)生病毒性疾病，將會(huì)給養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。為了解目前FAdV-4在新鄉(xiāng)市的流行情況，本研究參照GenBank 中FAdV-4Hexon基因序列，設(shè)計(jì)2 對(duì)引物，對(duì)新鄉(xiāng)市周邊4 個(gè)養(yǎng)雞場采集的16份疑似FAdV感染的肝臟組織樣品進(jìn)行檢測，檢出12份陽性樣品，樣品陽性率占75%，確定該病依然存在，對(duì)該病的防控仍需重視。

從測序結(jié)果來看，本研究擴(kuò)增得到的幾個(gè)序列片段完全一致，判斷為同一個(gè)毒株，命名為XX 株。XX 株與FAdV-4 型參考毒株高度同源。測序結(jié)果表明，新鄉(xiāng)市流行的FAdV 主要為FAdV-4，同時(shí)也說明Hexon基因比較保守，能夠用于FAdV毒株的進(jìn)化分析[12-16]。由于本研究僅擴(kuò)增了Hexon基因的部分片段，其余部分是否存在變異或缺失，還需要進(jìn)一步擴(kuò)增Hexon基因的全長序列確定。

本研究分離的FAdV-4 XX 株能夠引起SPF 雞精神沉郁、食欲減退、閉眼嗜睡甚至死亡等臨床癥狀，剖檢可見典型的心包積液，病雞肝臟腫大、質(zhì)脆、有明顯的壞死灶，這些癥狀和病理變化與其他人分離毒株感染動(dòng)物的結(jié)果一致[17-18]。本研究中，感染雞只死亡率可達(dá)60%，表明分離毒株毒力較強(qiáng)。根據(jù)動(dòng)物回歸試驗(yàn)結(jié)果，結(jié)合測序和序列分析結(jié)果，進(jìn)一步證實(shí)分離的病毒為FAdV-4。本研究依據(jù)Hexon基因序列對(duì)分離的毒株進(jìn)行分型，與以往FAdV 分離鑒定的依據(jù)一致[19-23]。這些結(jié)果為進(jìn)一步研究禽腺病毒分子流行情況和防控提供了技術(shù)支持。