鄭 鵬，馮 瑞，秦 雪，李 琦，趙 騫 (東北農(nóng)業(yè)大學 動物科學技術(shù)學院，黑龍江 哈爾濱 150030)

雄性動物睪丸曲細精管內(nèi)的支持細胞增殖與分化形成的血睪屏障(blood-testis barrier，BTB)是維持精子發(fā)生的重要內(nèi)環(huán)境[1-5]。公牛出生后，睪丸生長相對緩慢，直到大約25周齡后，睪丸開始迅速生長，睪丸內(nèi)形成血睪屏障和睪丸功能逐漸完善，動物開始產(chǎn)生精子，標志著初情期的到來[6-7]。初情期以后，睪丸內(nèi)的支持細胞停止增殖，細胞間形成緊密連接，進而形成血睪屏障，成為成熟的支持細胞。廣義的BTB由緊密連接、黏附連接、縫隙連接等連接復合體共同組成。而狹義的BTB，即支持細胞間的緊密連接是構(gòu)成血睪屏障主要的結(jié)構(gòu)基礎。緊密連接主要由跨膜蛋白分子Claudin-1、緊密連接蛋白ZO-1、穿膜蛋白Occludin及連接黏附分子(junctional adhesion molecules，JAMS)共同組成[8-10]。

支持細胞的增殖與其細胞周期進程緊密相關(guān)。磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide3-kinase，PI3K)是對細胞周期產(chǎn)生影響的一個重要分子。PI3K在質(zhì)膜上產(chǎn)生第二信使PIP3(3，4，5-三磷酸磷脂酰肌醇)，作為第二信使的PIP3與蛋白激酶B(Akt)結(jié)合，使Akt轉(zhuǎn)位于細胞膜并獲得催化活性，Akt激活后可抑制P21Cip1和P27Kip1蛋白的表達，解除對Cyclin D1-CDK復合物形成的抑制作用，促進細胞增殖[6]。

支持細胞增殖、分化與BTB的形成及支持細胞的功能密切相關(guān)[11-12]。本試驗分離純化了犢牛睪丸支持細胞，采用體外傳代培養(yǎng)的方法，探索支持細胞體外成熟的培養(yǎng)體系，為建立體外研究血睪屏障機制的細胞模型奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與主要試劑犢牛睪丸(屠宰后割取睪丸，置于4℃生理鹽水中3 h內(nèi)運回實驗室。取自黑龍江雙城血清廠)；0.1%膠原酶購自Sigma公司；0.25%胰酶購自Amresco公司；DMEM，F(xiàn)BS購自Gibco公司；雙抗(每毫升含10 000 U青霉素和10 mg 鏈霉素)購自Biosharp公司；兔抗ZO-1多克隆抗體，兔抗波形蛋白(vimentin)多克隆抗體，F(xiàn)ITC標記的羊抗兔IgG購自Proteintech公司；HRP標記的二抗購自Bioss公司。

1.2 支持細胞的體外培養(yǎng)參照本試驗之前的研究方法[1-2]，用0.1%膠原酶和0.25%胰酶消化睪丸組織，利用差速貼壁方法純化支持細胞。將純化的支持細胞按5×105個/mL的密度培養(yǎng)于含10% FBS和1%雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)液中，于37℃，5% CO2飽和濕度的條件下進行培養(yǎng)。此時的支持細胞記為原代支持細胞(0代)，培養(yǎng)2～3 d后，細胞鋪滿皿底90%以上時進行傳代，傳代后的細胞記為1代支持細胞，以此類推，進行細胞代數(shù)的標記。

1.3 免疫熒光染色待鋪滿皿底90%以上時，用4%多聚甲醛固定15 min，用含0.1% BSA的PBS溶液清洗2次，每次5 min，滴加5% BSA封閉液，室溫封閉40 min，棄掉封閉液，加入按1∶500稀釋(含1% BSA的PBS溶液)的一抗，4℃孵育過夜，使用正常IgG作為陰性對照。用含0.1% BSA的PBS溶液清洗2次，每次5 min，加入按1∶200稀釋(含1% BSA的PBS溶液)的FITC標記的二抗，室溫避光孵育1 h，用含0.1% BSA的PBS溶液清洗2次，每次5 min，用DAPI復染5 min。用PBS清洗3次后，置于熒光顯微鏡下觀察。

1.4 實時熒光定量RT-PCR分析參考WANG等[6]的方法，使用TRIzol(Invitrogen)試劑提取支持細胞的總RNA，進行反轉(zhuǎn)錄，采用定量RT-PCR檢測PI3K、Akt、ZO-1、Connexin-34和β-actin的表達，內(nèi)參基因為β-actin，用2-△△Ct法計算靶基因的表達水平。檢測基因的引物序列見表1，由華大基因公司合成。

表1 引物序列及相關(guān)信息

1.5 免疫蛋白印跡分析參考WANG等[8-10]的方法，將處理后的細胞用PBS洗滌，用胰蛋白酶消化后收集細胞，再次用PBS洗滌細胞2次，去除上清液后，加入150 μL RIPA裂解緩沖液提取蛋白。用BCA蛋白檢測試劑盒檢測蛋白質(zhì)量濃度。采用10% SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)膜后用5%脫脂奶粉封閉1 h，然后與一抗(PI3K、Akt、ZO-1、Connexin-34、β-actin，1∶1 000，Bioss公司)在4℃下孵育過夜。清洗膜3次，每次10 min，加入HRP標記的二抗(1∶3 000)在室溫下孵育1 h。洗滌3次，使用ECL-Western blot檢測系統(tǒng)檢測(Amersham Biosciences，USA)。用Image J軟件進行灰度分析。

2 結(jié)果

2.1 支持細胞的體外成熟與分化分離純化后的支持細胞貼壁較快，形態(tài)類似成纖維細胞。傳到5代時，有少量細胞的細胞質(zhì)擴展，面積增大，表現(xiàn)出成熟狀態(tài)；傳到10代時，支持細胞的細胞質(zhì)充分擴展，細胞質(zhì)的表面積進一步增大；傳到20代時，細胞質(zhì)充分發(fā)育，不同細胞質(zhì)之間相互連接，細胞質(zhì)的表面積更大(圖1)。隨著傳代次數(shù)增加，支持細胞增殖速度逐漸變慢，支持細胞逐漸趨于成熟狀態(tài)。因此，在本試驗中，5代以內(nèi)的細胞作為未成熟的支持細胞，10代以上的細胞作為成熟的支持細胞，用于進一步的基因表達分析。

A.1代睪丸支持細胞；B.5代睪丸支持細胞；C.10代睪丸支持細胞；D.20代睪丸支持細胞圖1 不同代次犢牛睪丸支持細胞(標尺=50 μm)

2.2 支持細胞的免疫熒光染色對未成熟與成熟的支持細胞進行免疫熒光染色分析，波形蛋白染色顯示，未成熟與成熟的支持細胞都呈陽性，波形蛋白表達于細胞質(zhì)(圖2)。ZO-1染色顯示，未成熟與成熟的支持細胞都呈陽性， ZO-1表達于支持細胞邊緣(圖3)。

A.波形蛋白染色；B.DAPI染色；C.疊加圖圖2 犢牛睪丸支持細胞的波形蛋白染色(標尺=50 μm)

A.ZO-1染色；B.DAPI染色；C.疊加圖圖3 犢牛睪丸支持細胞的ZO-1染色(標尺=20 μm)

2.3 支持細胞增殖與成熟相關(guān)基因的表達RT-PCR分析顯示，支持細胞成熟分化后，與細胞增殖相關(guān)的PI3K的mRNA水平顯著下降(P<0.05)，Akt的mRNA水平并沒有顯著改變(P>0.05)；與細胞緊密連接相關(guān)的ZO-1和Connexin-34的mRNA水平略有升高，但與對照組相比差異不顯著(P>0.05)(圖4)。Western blot分析的結(jié)果與RT-PCR分析的結(jié)果一致(圖4)。

相同字母表示組間差異不顯著(P<0.05)，不同字母表示組間差異顯著(P<0.05)圖4 犢牛睪丸支持細胞增殖與成熟相關(guān)基因的表達

3 討論

在正常的生理狀態(tài)下，幼年動物睪丸內(nèi)的未成熟支持細胞具有很強的增殖能力，成年動物的支持細胞高度分化不再增殖[13]。在嚙齒動物中，出生后3～5 d內(nèi)，支持細胞繼續(xù)增殖并將生殖細胞吸引至基底膜以建立精原干細胞生態(tài)位。在出生后第2周，隨著精原細胞進入減數(shù)分裂，支持細胞停止增殖并變大，形成緊密連接并在出生后15～16 d建立血睪屏障。支持細胞的體外研究，大部分集中于使用未成熟的支持細胞，而關(guān)于支持細胞體外成熟分化的形態(tài)學及其機制研究相對較少[14]。本實驗室前期培養(yǎng)了幼年鼠(7日齡)和青年鼠(6周齡)的睪丸支持細胞，發(fā)現(xiàn)原代的青年鼠睪丸支持細胞的細胞質(zhì)鋪展面積較大，增殖速度慢。參照鼠的未成熟和成熟的支持細胞，本試驗利用體外不斷傳代的方法，誘導犢牛睪丸支持細胞成熟分化，從形態(tài)學上觀察到支持細胞的細胞質(zhì)充分擴展，增殖能力降低，表現(xiàn)出成熟的特征。隨著傳代次數(shù)的增加，成熟的支持細胞數(shù)量不斷增多。除了細胞質(zhì)擴展的形態(tài)學特征之外，并沒有找到特異性的免疫熒光染色標記來區(qū)分未成熟與成熟的支持細胞，后續(xù)試驗將繼續(xù)篩選支持細胞體外成熟的標記，為支持細胞體外分化成熟的研究提供參考。

曲細精管內(nèi)的血睪屏障將生精上皮分為基底室和近腔室，保證精子的發(fā)生。伴隨血睪屏障的形成，支持細胞停止增殖，成熟的相鄰支持細胞之間形成緊密連接[15]。PI3K/Akt信號通路是調(diào)控細胞增殖的重要通路，研究表明，激活PI3K/Akt信號通路，可促進細胞增殖，抑制PI3K/Akt信號通路，支持細胞發(fā)生成熟分化[6]。本試驗檢測到細胞質(zhì)擴展的支持細胞中PI3K/Akt信號通路被抑制，從分子水平證實了細胞質(zhì)擴展后支持細胞增殖能力降低，逐漸分化成熟。ZO-1和Connexin-34是主要的緊密連接蛋白[8-10]，本試驗檢測到成熟的支持細胞的ZO-1和Connexin-34的mRNA和蛋白的表達水平升高，但與對照組相比差異不顯著。血睪屏障的緊密連接在體內(nèi)是立體結(jié)構(gòu)條件下形成的，在體外培養(yǎng)條件下，可能成熟支持細胞的緊密連接形成不完善，導致ZO-1和Connexin-34的表達沒有顯著升高。3D培養(yǎng)條件可能更有利于研究支持細胞成熟和血睪屏障緊密連接的形成機制。

綜上所述，犢牛睪丸支持細胞體外傳代培養(yǎng)過程中，逐漸發(fā)生分化成熟，成熟的支持細胞的細胞質(zhì)擴展，分裂能力逐步降低。