朱凝瑜，賀 澤，梁倩蓉，鄭曉葉，丁雪燕*，曲道峰* (.浙江省水產(chǎn)技術(shù)推廣總站，浙江 杭州 300；.浙江工商大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院 浙江省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 3008)

β-內(nèi)酰胺類抗生素因其抗菌作用范圍較廣，近年來一直被廣泛應(yīng)用于臨床醫(yī)療，但也因此使得各類細(xì)菌對(duì)其抗性大大增加[1]。磷霉素對(duì)革蘭陰性和陽性需氧菌具有廣譜抗菌作用，對(duì)于臨床重要的耐藥菌，包括產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBL)的腸桿菌科細(xì)菌、碳青霉烯類耐藥的腸桿菌科細(xì)菌(carbapenem-resistantEnterobacteriaceae，CRE)等細(xì)菌，仍有較高的抗菌活性[2]。而超廣譜β-內(nèi)酰胺抗生素中的碳青霉烯類抗生素更是因其較其他β-內(nèi)酰胺具有更強(qiáng)的抗菌效果和較低的耐藥率[3]，曾一度被認(rèn)為是對(duì)抗細(xì)菌感染的最后一道防線[4]。但近年來隨著大量超廣譜β-內(nèi)酰胺類耐藥基因(如blaTEM)[5]和部分碳青霉烯類耐藥基因(如blaIMP)[6-7]的發(fā)現(xiàn)和檢出，使得人們不得不重視抗生素的濫用導(dǎo)致的耐藥性增加問題，急需尋求新的有效抗生素。磷霉素的細(xì)菌耐藥率也有所增長，其主要的耐藥基因fosA3檢出率在10%以下[8-9]。耐藥基因的存在與菌株產(chǎn)生耐藥性有關(guān)[10-11]，在耐藥性產(chǎn)生中起到一定的作用，需引起關(guān)注。

目前檢測耐藥基因的方法有傳統(tǒng)PCR、熒光PCR、全基因組測序等，重組酶聚合酶擴(kuò)增(recombinase polymerase amplification，RPA)技術(shù)作為一種新興的恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)[12]，相對(duì)于傳統(tǒng)方法來說，具有耗時(shí)短，操作簡單，無需特定設(shè)備等優(yōu)點(diǎn)。國內(nèi)尚無利用RPA技術(shù)同時(shí)檢測3種耐藥基因的報(bào)道。本研究選擇3類抗生素的典型耐藥基因，即超廣譜β-內(nèi)酰胺類耐藥基因blaTEM-1、碳青霉烯類耐藥基因blaIMP-3和磷霉素耐藥基因fosA3，設(shè)計(jì)3組獨(dú)立的RPA引物，建立并優(yōu)化對(duì)應(yīng)3種耐藥基因的多重RPA快速檢測方法。同時(shí)對(duì)從水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境及水生動(dòng)物體內(nèi)分離到細(xì)菌進(jìn)行檢測，并與傳統(tǒng)PCR檢測方法進(jìn)行比較。本研究旨在解決養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)鏈各環(huán)節(jié)現(xiàn)場快速檢測耐藥基因難題，對(duì)養(yǎng)殖環(huán)境進(jìn)行耐藥風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，為保障水產(chǎn)品的食用安全提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 菌種收集以E.coliTOP10(BNCC353819，購自國家獸醫(yī)微生物菌種保藏中心)為陰性對(duì)照；將3株分別攜帶耐藥基因blaTEM-1、blaIMP-3、fosA3 大腸桿菌的耐藥基因分別通過細(xì)菌接合試驗(yàn)轉(zhuǎn)移到大腸桿菌TOP10中，使其分別攜帶1個(gè)、3個(gè)基因(命名為TOP10-blaTEM-1、TOP10-blaIMP-3、TOP10-fosA3和TOP10-all)，用作陽性對(duì)照。100株從水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境及300株從省內(nèi)主養(yǎng)水產(chǎn)品種(大口黑鱸、黃顙魚、中華鱉、南美白對(duì)蝦等)體內(nèi)分離到的細(xì)菌菌株(編號(hào)為T2011001～T2011400)為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑TwistAmp?DNA Basic Kit 購自英國TwistDx公司；2×Taq PCR Master Mix、dNTPs(10 mmol/L)、 DL2000 DNA Marker均購自生工生物工程(上海)股份有限公司；TIANamp Bacteria DNA Kit細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)根據(jù)NCBI上發(fā)布的blaTEM-1(NG_050145.1)、blaIMP-3(NG_049194.1)、fosA3(NG_050407.1)基因序列，選擇各基因的特異性保守區(qū)域，根據(jù)RPA技術(shù)要求利用Primer 6.0軟件設(shè)計(jì)RPA引物[13-15]，同時(shí)設(shè)計(jì)常規(guī)PCR引物。引物序列見表1，均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 引物序列及相關(guān)信息

1.4 多重RPA體系的建立根據(jù)TwistAmp?DNA Basic Kit試劑盒的操作說明，建立多重 RPA 的反應(yīng)體系，總反應(yīng)體系50 μL：Primer Free Rehydration Buffer 29.5 μL，MgAc(280 mmol/L) 2.5 μL，blaTEM-1、blaIMP-3、fosA3 三對(duì)基因上、下游引物各1 μL，樣品DNA模板5 μL，ddH2O補(bǔ)足體積。37℃恒溫反應(yīng)30 min，將反應(yīng)產(chǎn)物電泳后通過凝膠成像儀進(jìn)行檢測。

1.5 多重RPA反應(yīng)條件的優(yōu)化分別對(duì)多重RPA法的反應(yīng)溫度( 37，38，39，40，41，42℃)、反應(yīng)時(shí)間(5，10，15，20，25，30，35，40 min)、引物濃度(200，270，340，410，480 nmol/L)進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳反應(yīng)條件。

1.6 多重RPA反應(yīng)特異性和靈敏度檢測

1.6.1多重RPA反應(yīng)的特異性 提取TOP10-blaTEM-1、TOP10-blaIMP-3、TOP10-fosA3、TOP10-all以及TOP10的細(xì)菌DNA作為模板，采用上述最佳反應(yīng)條件的RPA體系進(jìn)行檢測，評(píng)估所建立的檢測方法的特異性。

1.6.2多重RPA反應(yīng)的敏感性 提取TOP10-all菌株DNA作為模板，用ddH2O 對(duì)其進(jìn)行10倍倍比稀釋(100～105)，用最佳反應(yīng)條件進(jìn)行 RPA 擴(kuò)增，確定耐藥基因的檢測限。

1.7 多重RPA方法的應(yīng)用從養(yǎng)殖用水進(jìn)水口水樣中分離得到的100株菌株及水產(chǎn)動(dòng)物體內(nèi)分離到的300株菌株，共400株菌株，提取DNA作為模板，用多重RPA方法和普通PCR方法檢測上述3種耐藥基因，對(duì)比檢測結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 多重RPA反應(yīng)條件的優(yōu)化

2.1.1多重RPA反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化 以攜帶有全部3種耐藥基因載體菌(TOP10-all)的DNA為模板，對(duì)多重RPA法的反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、引物濃度進(jìn)行優(yōu)化。反應(yīng)結(jié)果如圖1～3所示，37～42℃條件下blaTEM-1、blaIMP-3均有清晰且明亮的條帶出現(xiàn)，但在37℃條件下fosA3條帶較亮；5～40 min反應(yīng)時(shí)間均能檢測到3種耐藥基因，但20 min時(shí)條帶最亮且最為清晰；blaTEM-1和blaIMP-3耐藥基因引物濃度在270 nmol/L以上時(shí)條帶較亮并且清晰，fosA3耐藥基因在引物濃度為480 nmol/L時(shí)條帶較亮。因此，確定多重RPA的最佳反應(yīng)溫度為37℃，最佳反應(yīng)時(shí)間為20 min，最佳引物濃度為480 nmol/L。

M.DL2000 DNA Marker；1～8.5，10，15，20，25，30，35，40 min；9.陰性對(duì)照?qǐng)D1 耐藥基因blaTEM-1、blaIMP-3 和fosA3多重RPA最適反應(yīng)時(shí)間優(yōu)化結(jié)果

M.DL2000 DNA Marker；1～6.37，38，39，40，41，42℃；7.陰性對(duì)照?qǐng)D2 耐藥基因blaTEM-1、blaIMP-3 和 fosA3多重RPA最適反應(yīng)溫度優(yōu)化結(jié)果

M.DL2000 DNA Marker；1～5.200，270，340，410，480 nmol/L；6.陰性對(duì)照?qǐng)D3 耐藥基因blaTEM-1、blaIMP-3和fosA3多重RPA最適引物濃度的優(yōu)化結(jié)果

2.2 多重RPA反應(yīng)的特異性分別對(duì)攜帶1個(gè)、3個(gè)耐藥基因的TOP10-blaTEM-1、TOP10-blaIMP-3、TOP10-fosA3和TOP10-all菌株以及陰性對(duì)照TOP10菌株的細(xì)菌DNA模板進(jìn)行多重RPA檢測。結(jié)果如圖4所示，均可擴(kuò)增出相應(yīng)的目的條帶，而陰性對(duì)照則沒有目的條帶出現(xiàn)，說明建立的多重RPA特異性較強(qiáng)。

M.DL2000 DNA Marker；1.TOP10-fosA3 DNA；2.TOP10-blaIMP-3 DNA；3.TOP10-blaTEM-1 DNA；4.TOP10-all DNA；5.TOP10 陰性對(duì)照DNA圖4 耐藥基因blaTEM-1、blaIMP-3 和fosA3多重RPA的特異性檢測結(jié)果

2.3 多重RPA反應(yīng)的敏感性經(jīng)測定及計(jì)算，提取的TOP10-all菌株DNA濃度為1.8×107拷貝/μL，用ddH2O對(duì)其進(jìn)行10倍倍比稀釋后進(jìn)行多重RPA檢測。檢測結(jié)果如圖5所示，體系對(duì)blaTEM-1、blaIMP-3基因的最低檢出限為18拷貝/μL，對(duì)fosA3基因的最低檢出限為1.8×102拷貝/μL。

M.DL2000 DNA Marker；1～8.100，10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7模板濃度圖5 耐藥基因blaTEM-1、blaIMP-3 和fosA3多重RPA的敏感性檢測結(jié)果

2.4 多重RPA快速檢測方法應(yīng)用及效果評(píng)價(jià)對(duì)400株菌株進(jìn)行多重RPA檢測(表2)，其中養(yǎng)殖用水進(jìn)水口水樣分離菌株的blaTEM-1的RPA檢出率為81.00%(81/100)，blaIMP-3和fosA3的檢出率分別為11.00%(11/300)和29.00%(29/100)；常規(guī)PCR對(duì)3者的檢出率分別為81.00%(81/100)，11.00%(11/300)和29.00%(29/100)。水產(chǎn)動(dòng)物體內(nèi)分離菌株的blaTEM-1的RPA檢出率為73.67%(221/300)，blaIMP-3和fosA3的檢出率分別為1.33%(4/300)和23.33%(70/300)；常規(guī)PCR對(duì)3者的檢出率分別為73.33%(220/300)，1.33%(4/300)和23.33%(70/300)。RPA方法的檢出率與常規(guī)PCR基本一致。可以用于臨床樣品細(xì)菌中耐藥基因的檢測。根據(jù)檢測結(jié)果，推斷是由養(yǎng)殖用水等上游環(huán)境的耐藥基因污染導(dǎo)致了水產(chǎn)動(dòng)物體內(nèi)分離菌株耐藥基因的出現(xiàn)。

表2 多重RPA與普通PCR檢測符合率 %

3 討論

RPA技術(shù)是一種新興的恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)，其在單鏈DNA結(jié)合蛋白和DNA聚合酶的復(fù)合作用下，先將模板DNA解鏈，進(jìn)而把引物與匹配模板形成復(fù)合體，再延伸生成新的配對(duì)鏈，如此循環(huán)往復(fù)以指數(shù)增長方式達(dá)到檢測閾值[16]。RPA 技術(shù)在近幾年已經(jīng)趨于成熟，很多學(xué)者都將其應(yīng)用在研究中，但僅有少數(shù)學(xué)者使用RPA技術(shù)來檢測細(xì)菌中的耐藥基因，如馬骉等[17]使用RPA技術(shù)對(duì)磺胺類耐藥基因進(jìn)行檢測，屠博文等[18]使用RPA技術(shù)對(duì)金屬β內(nèi)酰胺酶基因blaNDM進(jìn)行檢測等。本研究通過對(duì)blaTEM-1、blaIMP-3、fosA3 三種耐藥基因序列設(shè)計(jì)引物，成功建立了一套特異性強(qiáng)，靈敏度高的多重RPA檢測方法。相較傳統(tǒng)PCR檢測而言，既縮短了檢測時(shí)間(從約3 h縮短至約1 h)，只需要在恒溫條件(37℃)下操作，設(shè)備依賴低，并且能單次檢測3種耐藥基因，大大地提升了檢測效果和檢測效率?？蔀槎喾N類大批量細(xì)菌的耐藥基因快速檢測提供技術(shù)支撐，為養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)鏈各環(huán)節(jié)快速摸清耐藥基因情況，減緩耐藥基因的傳播提供了極大便利。

超廣譜β-內(nèi)酰胺酶中的碳青霉烯類抗生素作為較新型的抗生素在近幾年內(nèi)不斷被投入使用，但細(xì)菌也因此進(jìn)化出新的耐藥基因，產(chǎn)生了一定的耐藥性。根據(jù)中國細(xì)菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)公布的數(shù)據(jù)顯示，2020年臨床上大腸埃希菌對(duì)頭孢西丁和頭孢他啶2種β-內(nèi)酰胺類抗生素的耐藥占比分別為6.1%和11.2%，對(duì)頭孢吡肟的耐藥占比已達(dá)25.7%，而對(duì)其他β-內(nèi)酰胺類抗生素的耐藥占比均已超過50%；對(duì)碳青霉烯類抗生素亞胺培南、厄他培南和美羅培南的耐藥占比分別為2.0%,2.1%和2.2%；對(duì)磷霉素的耐藥占比為5.8%，耐藥形勢(shì)不容樂觀。

細(xì)菌耐藥性與其本身特性、耐藥基因、藥物的使用情況等因素有關(guān)[19]，其中耐藥基因起到了很大作用。耐藥基因可通過縱向或橫向轉(zhuǎn)移，縱向轉(zhuǎn)移即攜帶耐藥基因的生物通過分裂等方式增殖，其耐藥基因隨著遺傳物質(zhì)的復(fù)制而增加；橫向轉(zhuǎn)移是指細(xì)胞內(nèi)部或不同生物個(gè)體之間遺傳物質(zhì)的交流，它打破了耐藥基因傳播時(shí)種屬的界限，更應(yīng)引起關(guān)注。主要途徑有質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子等可移動(dòng)基因元件的接合轉(zhuǎn)移，噬菌體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)化等[10-11]，其中可移動(dòng)耐藥基因元件在耐藥性的產(chǎn)生和傳播中發(fā)揮了重要作用[20]。如本研究中菌株的磷霉素耐藥基因fosA3檢出率已達(dá)到24.75%，大大高于其他文獻(xiàn)報(bào)道的10%，所檢測耐藥基因的對(duì)應(yīng)抗生素均在水產(chǎn)養(yǎng)殖中不可使用。并且養(yǎng)殖用水分離菌株中3種耐藥基因的檢出率均高于水產(chǎn)動(dòng)物體內(nèi)分離菌株，存在從養(yǎng)殖用水傳播至水產(chǎn)動(dòng)物的可能。這些結(jié)果一定程度上意味著浙江省內(nèi)水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境的耐藥形勢(shì)已十分嚴(yán)峻。雖然水產(chǎn)上人畜共患的細(xì)菌較為少見，大多數(shù)條件致病菌對(duì)人致病性較弱，但是通過橫向轉(zhuǎn)移，攜帶的耐藥基因伴隨著含有耐藥菌的廢水等其他媒介流動(dòng)、生物體間相互接觸，而轉(zhuǎn)至其他人類易感的細(xì)菌體內(nèi)，加快耐藥性的蔓延速度。人接觸被耐藥菌污染的水或養(yǎng)殖生物、食品等時(shí)，一旦被感染，將會(huì)給治療帶來困難。因此追蹤調(diào)查耐藥基因譜，對(duì)養(yǎng)殖環(huán)境進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，更科學(xué)地控制細(xì)菌的耐藥情況，減少環(huán)境污染風(fēng)險(xiǎn)迫在眉睫。

本研究建立了同時(shí)檢測3種耐藥基因的多重RPA快速檢測方法，為多種類大批量細(xì)菌的耐藥基因快速檢測提供技術(shù)支撐，為快速摸清養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)鏈各環(huán)節(jié)耐藥基因情況、減緩耐藥基因的傳播提供了極大便利，同時(shí)也為進(jìn)行養(yǎng)殖環(huán)境耐藥風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，保障水產(chǎn)品的食用安全奠定了基礎(chǔ)。