張國(guó)軍,任洪林,楊 舉,張嘉桐,楊延梅,暢麗芳,陳建國(guó),陳 博,齊 宇* (.吉林大學(xué) 人獸共患病研究所 人獸共患病研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長(zhǎng)春 006；.吉力生物科技有限公司，浙江 寧波 56；.吉林大學(xué) 致遠(yuǎn)有限公司，吉林 長(zhǎng)春 00；.吉林大學(xué) 科研院西區(qū)科技辦公室,吉林 長(zhǎng)春 006)

貓病毒性鼻氣管炎病是一種貓的上呼吸道高度接觸性急性傳染病，幼貓發(fā)病率可達(dá)100%，死亡率50%，成年貓死亡率很低，是貓的重要呼吸道疾病之一。本病病原是貓Ⅰ型皰疹病毒(FHV-1)，自然條件下經(jīng)呼吸道和消化道感染，也可通過飛沫迅速傳播。該病毒目前只有一種血清型被確認(rèn)，但其毒力在各病毒株之間各有不同，通常情況下只感染貓。我國(guó)寵物貓?jiān)? 000萬只以上，貓感染后，病毒能在病貓鼻腔、咽喉、氣管、結(jié)膜和舌上皮細(xì)胞內(nèi)繁殖，并隨其分泌物排到體外。有些貓感染后不呈現(xiàn)癥狀，稱為隱性感染，但仍能向外排出病毒[1]。因此，當(dāng)健康貓接觸了被病毒污染的飼料、水、用具和周圍環(huán)境時(shí)，就可引起本病傳播。由于本病癥狀與貓杯狀病毒(FCV)感染和貓肺炎(衣原體感染)有相似之處，故臨床診斷較難[2]。目前國(guó)際市場(chǎng)已有預(yù)防貓鼻氣管炎的滅活疫苗和弱毒苗，主要為聯(lián)苗形式。我國(guó)目前預(yù)防貓病毒性鼻氣管炎較多的產(chǎn)品是妙三多三聯(lián)滅活疫苗，為進(jìn)口產(chǎn)品，價(jià)格高，目前還沒有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的疫苗產(chǎn)品。因此，為加強(qiáng)國(guó)產(chǎn)疫苗研發(fā)和知識(shí)產(chǎn)權(quán)獨(dú)立性，有必要研制國(guó)產(chǎn)疫苗，以解決目前國(guó)內(nèi)面臨的疫苗短缺問題。

本試驗(yàn)從臨床患病貓氣管分離到1株貓皰疹病毒(FHV)，將其命名為FHV-HB株，并對(duì)其特性進(jìn)行了初步分析，結(jié)果顯示該毒株免疫原性好且免疫防護(hù)力高，成為貓鼻氣管炎疫苗候選株的潛力大，目前相關(guān)研究正在繼續(xù)，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 病料采集2014年河北保定某貓舍幼貓發(fā)病，臨床表現(xiàn)為打噴嚏，眼、鼻部出現(xiàn)大量分泌物，幾日后眼部、鼻部被分泌物封死，食欲廢絕，呼吸困難并死亡，疑似貓病毒性鼻氣管炎病毒感染。

1.2 細(xì)胞株及試劑貓腎細(xì)胞(F81細(xì)胞)購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司；FHV陽性血清(SN≥1∶32)由吉林大學(xué)人獸共患病研究所惠贈(zèng)；Ex Taq DNA聚合酶、pMD18-T載體、E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；DNA提取試劑盒與膠回收試劑盒購(gòu)自AXYGEN公司；DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自南京生航生物技術(shù)有限公司；PCR引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。

1.3 試驗(yàn)貓2～3月齡中華田園貓，購(gòu)自長(zhǎng)春市某寵物市場(chǎng)，測(cè)定皰疹病毒抗體陰性或中和抗體≤1∶2。

1.4 試驗(yàn)儀器德國(guó)HERAcell BB15二氧化碳培養(yǎng)箱；奧林巴斯CKX53倒置生物顯微鏡；ABI梯度PCR儀。

1.5 病毒分離

1.5.1病料處理 采集發(fā)病貓鼻拭子于盛有0.5 mL DMEM培養(yǎng)基(含100 U/mL青霉素和100 g/L 鏈霉素)的離心管中，用于病毒分離。

1.5.2病毒培養(yǎng) 取1.5.1裝有鼻拭子的離心管，12 000 r/min離心20 min，吸取上清液，在無菌條件下用0.22 μm細(xì)菌濾器過濾除菌，接種過濾液1 mL于F81單層細(xì)胞，37℃感作2 h，棄掉過濾液，補(bǔ)加維持液，將細(xì)胞培養(yǎng)板置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每日觀察細(xì)胞，將出現(xiàn)病變(CPE)的細(xì)胞凍融1次，收集細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行鑒定。

1.6 分離病毒鑒定

1.6.1中和試驗(yàn) 將出現(xiàn)CPE細(xì)胞的培養(yǎng)液用DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋為200 TCID50/0.1 mL，與FHV特異性陽性血清(SN≥1∶32)等量混合，置37℃下中和1 h，接種已長(zhǎng)成單層、棄去細(xì)胞培養(yǎng)液的96孔板中培養(yǎng)的F81細(xì)胞(2孔)，37℃孵育2 h后，棄去病毒-血清中和液，加入0.1 mL含2%胎牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液；同時(shí)設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照、病毒對(duì)照各2孔。將96孔板置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)觀察48 h。

1.6.2核酸鑒定 提取病毒液的DNA與RNA。采用FPV、FCV和FHV的特異性引物，通過PCR或RT-PCR方法進(jìn)行鑒定，引物相關(guān)信息見表1。

表1 FHV、FCV、FPV檢測(cè)用引物序列及相關(guān)信息

1.6.3病毒的形態(tài)學(xué)觀察 將病毒液4℃，10 000 r/min離心30 min，取上清液加入0.5%磷鎢酸溶液染色，用透射電子顯微鏡觀察其形態(tài)學(xué)特征。

1.6.4毒力測(cè)定 將第5代細(xì)胞培養(yǎng)物用生理鹽水10倍系列稀釋至105，106，107TCID50/mL，病毒感染途徑為滴鼻和口服，將病毒接種于2月齡以上，F(xiàn)HV中和抗體不高于1∶2的臨床健康貓，每組5只，每只2.0 mL，觀察14 d。

1.6.5免疫原性測(cè)定 將第5代病毒培養(yǎng)液稀釋至105.5TCID50/mL，用0.2%的甲醛溶液滅活后加入疫苗稀釋液，皮下接種2～3月齡臨床健康中華田園貓(FHV中和抗體≤1∶2)4只，每只1 mL，接種后21 d以相同劑量和相同免疫途徑加強(qiáng)免疫1次。另取條件相同的3只貓不接種作為空白對(duì)照。加強(qiáng)免疫后21 d分別采集免疫貓和對(duì)照貓血液，分離血清，測(cè)定貓鼻氣管炎病毒中和抗體效價(jià)。加強(qiáng)免疫后21 d，通過滴鼻途徑進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，每只貓接種病毒滴度為107.5TCID50/mL的FHV HB株培養(yǎng)液2.0 mL，正常飼養(yǎng)，觀察14 d。

2 結(jié)果

2.1 病毒分離結(jié)果正常F81細(xì)胞生長(zhǎng)良好，邊緣清晰，形態(tài)均勻一致(圖1A)。接種病毒后24 h，F(xiàn)81細(xì)胞開始出現(xiàn)明顯的CPE：細(xì)胞圓縮，聚集成團(tuán)，細(xì)胞間隙變大，聚集成“葡萄串樣”群落(圖1B)。

A.正常細(xì)胞；B.接毒后48 h細(xì)胞圖1 正常F81細(xì)胞及感染FHV F81細(xì)胞的顯微鏡觀察結(jié)果

2.2 病毒的鑒定結(jié)果

2.2.1中和試驗(yàn)鑒定結(jié)果 用通過FHV陽性血清中和分離的第3代病毒，混合感作后接種細(xì)胞，接種后4 d觀察細(xì)胞，陽性血清中和組接毒后未出現(xiàn)CPE，陰性血清中和組和病毒對(duì)照組細(xì)胞均出現(xiàn)了CPE，表明所分離的病毒為FHV，并且有致病性。

2.2.2核酸鑒定結(jié)果 通過FHVgD基因特異性引物對(duì)病毒細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到與預(yù)期片段大小相符的目的條帶(圖2)。

M.DL2000 DNA Marker；1.病毒細(xì)胞培養(yǎng)物的FPV鑒定引物PCR擴(kuò)增結(jié)果；2.FHV鑒定引物PCR擴(kuò)增結(jié)果；3.FCV鑒定引物RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果；4.F81對(duì)照細(xì)胞上清的FHV鑒定引物PCR擴(kuò)增結(jié)果圖2 第5代細(xì)胞培養(yǎng)物PCR擴(kuò)增結(jié)果

擴(kuò)增獲得的包含F(xiàn)HVgD基因的序列測(cè)定結(jié)果表明，F(xiàn)HV HB株與已發(fā)表的病毒株核酸序列同源性均較高。利用擴(kuò)增序列和基因數(shù)據(jù)庫(kù)中已有序列構(gòu)建的遺傳進(jìn)化樹如圖3所示。

圖3 FHV HB株gD基因的遺傳進(jìn)化樹

2.2.3病毒形態(tài)觀察結(jié)果 病毒經(jīng)磷鎢酸染色后，透射電鏡觀察可見到典型的皰疹病毒的病毒粒子(圖4)，將病毒命名為FHV-HB株。

圖4 FHV-HB株透射電鏡照片(×40 000)

2.2.4病毒滴度(TCID50)測(cè)定結(jié)果 按照Reed-Muench法計(jì)算FHV HB株分離毒的第5代細(xì)胞培養(yǎng)物的滴度為107.5TCID50/mL。

2.2.5毒力測(cè)定結(jié)果 以107.5TCID50/mL劑量接種實(shí)驗(yàn)貓，接種后全部試驗(yàn)貓出現(xiàn)眼屎、膿涕、噴嚏、呼吸困難等發(fā)病癥狀(圖5)，5只試驗(yàn)貓均在14 d內(nèi)死亡。

圖5 攻毒后試驗(yàn)貓臨床癥狀觀察

2.2.6免疫原性檢測(cè)結(jié)果 將F81細(xì)胞培養(yǎng)傳代的FHV HB株第5代毒的病毒培養(yǎng)液(107.5TCID50/mL)，經(jīng)體積分?jǐn)?shù)為0.2%的甲醛溶液滅活后，皮下接種臨床健康易感中華田園貓，21 d后加強(qiáng)免疫1次。另取未接種的3只條件相同的中華田園貓作為空白對(duì)照。加強(qiáng)免疫后21 d，分別采集血液，分離血清，測(cè)定FHV中和抗體效價(jià)，免疫原性鑒定結(jié)果見表2。

表2 FHV HB株第5代毒免疫原性鑒定結(jié)果

通過表2可知，滅活FHV HB株(107.5TCID50/mL)可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生較好的中和抗體，對(duì)FHV具有較強(qiáng)抵抗作用。免疫攻毒結(jié)果表明，用該劑量的滅活FHV HB株免疫2次后可提供完全的攻毒保護(hù)，說明滅活的FHV HB株具有很好的免疫原性。

3 討論

近年來，隨著人們生活水平的提高，貓作為伴侶動(dòng)物已逐漸成為城市生活不可或缺的一部分，寵物健康也逐漸成為世界寵物行業(yè)關(guān)注的熱點(diǎn)。我國(guó)養(yǎng)貓數(shù)量逐年增多，且有相當(dāng)數(shù)量的野貓群體，傳染性疾病常成為寵物貓患病和死亡的主要因素[3-4]。貓傳染性鼻氣管炎作為寵物貓常見的病毒性傳染病之一，一般來說僅感染貓，引起病貓出現(xiàn)上呼吸道炎癥和結(jié)膜炎[5-8]。本試驗(yàn)從河北某寵物醫(yī)院送檢的疑似患鼻氣管炎病的貓氣管中成功分離出1株FHV，其糖蛋白gD能夠凝集紅細(xì)胞和誘導(dǎo)體液免疫反應(yīng)，對(duì)其gD基因進(jìn)行了測(cè)序及分析，結(jié)果表明分離病毒gD基因序列[9]與GenBank中已發(fā)表的序列同源性為100%，通過病毒形態(tài)觀察、血清中和試驗(yàn)及基因序列分析，表明該病毒分離株為FHV-1。

FHV-1屬于一種典型的α-皰疹病毒，具有復(fù)制周期短、傳播迅速以及引起潛伏感染等特點(diǎn)[10]。臨床康復(fù)的貓會(huì)成為潛伏感染的病毒攜帶者，潛伏期間會(huì)傳染無抗體的其他貓，且當(dāng)自身受到應(yīng)激時(shí)，病毒經(jīng)歷周期性的活化，引起二次感染[11]。由于該病毒引起的抗體持續(xù)時(shí)間短，抗病能力弱，細(xì)胞免疫在該病控制上也很重要。本病的預(yù)防主要依靠疫苗防控，常規(guī)的滅活和減毒活疫苗可以提供有效保護(hù)，但國(guó)內(nèi)還缺乏針對(duì)性疫苗的開發(fā)，這也是本試驗(yàn)的主要目的之一。治療性藥物主要包括賴氨酸、干擾素以及阿昔洛韋、泛昔洛韋等核苷類抗皰疹病毒藥物，但是這些藥物的治療效果總體上欠佳[12-13]。本試驗(yàn)分離到的FHV第5代毒的滴度為107.5TCID50/mL，滅活后免疫貓可抵抗強(qiáng)毒攻擊，具有良好的免疫原性，而且以107.5TCID50/mL劑量感染組中的實(shí)驗(yàn)貓均出現(xiàn)本病相應(yīng)的臨床癥狀，說明該毒株可作為疫苗檢驗(yàn)用毒株。本試驗(yàn)對(duì)分離毒株進(jìn)行了鑒定和免疫保護(hù)試驗(yàn)，結(jié)果可為貓鼻氣管炎病的疫苗研發(fā)奠定基礎(chǔ)。