李素梅，羅思妮，畢曉黎，胥愛麗，李養(yǎng)學，肖觀林，陳偉韜

[1.廣東省第二中醫(yī)院（廣東省中醫(yī)藥工程技術研究院）/廣東省中醫(yī)藥研究開發(fā)重點實驗室，廣東 廣州 510095；2.佛山市中醫(yī)院，廣東 佛山 528000]

佩蘭來源于菊科植物佩蘭EupatoriumfortuneiTurcz.的干燥地上部分，具有芳香化濕、醒脾開胃、發(fā)表解暑的功效，用于治療濕濁中阻、口中甜膩、口臭、暑濕表證、濕溫初起等[1]，為常用化濕、醒脾、解表中藥，用藥歷史悠久，在我國華南、西南、中南、華東、陜西、河北、山東及湖北等地均有分布[2]。佩蘭主要含揮發(fā)油類[3-4]、黃酮類[5-7]、生物堿類[8-9]、腦苷脂類、蒲公英甾醇、蒲公英甾醇乙酸酯等成分[10]。藥理研究表明，佩蘭具有抗炎[11]、祛痰[12]、抗腫瘤[13]、抑菌[14-16]、增強免疫力[17-18]等作用。

目前，關于佩蘭質量控制方面的研究報道較少，且主要集中在揮發(fā)油[19-21]分析和化學成分提取分析研究等方面[10]，均未涉及到佩蘭藥材的超高效液相色譜指紋圖譜研究。2020年版《中國藥典》收載的佩蘭質量控制項目主要是定性鑒別和總揮發(fā)油含量，缺少具體的指標性成分要求。為了更全面地評價、控制佩蘭的質量，本研究收集了6個不同產地的佩蘭，采用UPLC技術建立了佩蘭指紋圖譜，旨在為佩蘭的質量控制提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

TLE-204分析天平、XS205DU型分析天平（瑞士-梅特勒托利多儀器公司）；JJ500電子天平（常熟-雙杰測試儀器廠）；KQ700DE超聲清洗器（昆山超聲儀器公司）；安捷倫1290超高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）。

1.2 試藥

香豆素對照品（批號：X-013-150801，純度：98%），購自成都瑞芬思生物科技有限公司；24批佩蘭藥材經廣東省中醫(yī)藥工程技術研究院劉法錦教授鑒定為菊科植物佩蘭EupatoriumfortuneiTurcz的干燥地上部分，產地信息見表1；液相用甲醇為Merck色譜純試劑，液相用水為屈臣氏水，甲醇、磷酸等其他試劑為分析純。

表1 佩蘭樣品信息Table 1 Information of the E.fortunei

2 方法與結果

2.1 色譜條件

以 Waters Cortecs UPLC T3（2.1 mm×150 mm，1.6μm）為色譜柱，以甲醇為流動相A，0.1%磷酸水溶液為流動相 B，梯度洗脫（0～40 min，5%～100%A）；流速為0.25 mL/min；檢測波長為230 nm；柱溫為35℃；進樣量為2μL。

2.2 供試品溶液的制備

取佩蘭粉末（過三號篩）約0.5 g，精密稱定質量，置錐形瓶中，精密加入70%（體積分數，下同）甲醇溶液10 mL，超聲處理（功率700 W，頻率45 kHz）提取20 min，取出，放冷，用70%甲醇溶液補足減失的質量，搖勻，提取液通過0.22μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.3 對照品溶液的配制

精密稱取香豆素對照品5.36 mg，置25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制得質量濃度為0.210 1 mg/mL的對照品溶液，從中精密吸取1 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，制得質量濃度為21.01μg/mL的對照品溶液，備用。

2.4 方法學考察

2.4.1 專屬性試驗 精密吸取70%甲醇溶液2μL進樣，按“2.1”項下的色譜條件測定，結果見圖1，專屬性試驗結果表明，該分析方法能正確檢測所指認的共有峰，不受提取溶劑的干擾。

圖1 專屬性試驗UPLC圖Figure 1 The UPLC of specific test

2.4.2 精密度試驗 取S1供試品溶液，按“2.1”項色譜條件連續(xù)進樣6針，以5號峰（香豆素）為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間及相對峰面積，其中各共有峰相對保留時間的RSD在0.06%～0.12%之間，相對峰面積RSD在1.22%～2.33%之間，表明儀器精密度良好。

2.4.3 重復性試驗 取佩蘭S1樣品，按“2.2”項方法平行處理6份供試品溶液，再按“2.1”項色譜條件進樣分析，以5號峰（香豆素）為參照峰，計算各共有峰的相對峰面積RSD在1.42%～4.75%之間，表明方法重復性良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗 取佩蘭S1供試品溶液，按“2.1”項色譜條件，分別在0、2、4、7、9、11、13、15、17 h分別進樣分析，以5號峰（香豆素）為參照峰，計算各共有峰的相對峰面積RSD在0.71%～1.92%之間，表明佩蘭供試品溶液在17 h內穩(wěn)定性良好。

2.5 佩蘭對照指紋圖譜的建立及相似度評價

取24批佩蘭樣品，按“2.2”項方法分別制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件，測定24批樣品指紋圖譜。將24批佩蘭指紋圖譜導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件》（2012年版）進行評價，以S1為參照圖譜，對照圖譜生成方法為中位數法，時間窗設置為0.1，經過多點校正和峰匹配，得到24批樣品的共有峰模式及佩蘭對照指紋圖譜，結果見圖2、圖3。其中標定了13個共有峰，通過與對照品比對，指認5號峰為香豆素。以5號峰（香豆素）為參照峰，分別計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，結果見表2、表3。結果顯示，13個共有峰的相對保留時間RSD值均小于0.1%，而相對峰面積RSD值在36.55%～87.37%之間，表明不同產地佩蘭的化學成分含量存在較大的差異。以生成的對照指紋圖譜作為對照，計算各批次樣品的相似度，結果見表4?？梢?，除S8外，24批樣品相似度均大于0.90，表明不同產地的佩蘭化學成分一致性較好。

表2 24批佩蘭的共有峰相對保留時間Table 2 Relative peak time of common peaks of 24 batches of the E.fortunei

表3 24批佩蘭的共有峰相對峰面積Table 3 Relative peak area of common peaks of 24 batches of the E.fortunei

表4 相似度評價結果Table 4 Results of similarity analysis

圖2 佩蘭對照指紋圖譜Figure 2 Rreference fingerprint of E.fortunei

圖3 24批佩蘭指紋圖譜共有峰模式Figure 3 The common peak pattern of the HPLC fingerprints of 24 batches of the E.fortunei

2.6 化學計量學分析

將24批佩蘭指紋圖譜中的13個共有峰峰面積導入IBM SPSS Statistics 21.0軟件進行PCA分析，計算得到主成分特征值、累積貢獻率，結果見表5?？梢姡琍CA共提取3個特征值大于1的主成分，累積方差貢獻率達87.450%，表明提取的前3個主成分可以代表佩蘭指紋圖譜共有峰中大部分的信息。旋轉后的成分載荷矩陣反映了各變量對主成分的貢獻大小[22]，結果見表6。結果顯示，第1主成分主要反映了峰8、12、9、10、3、2、13、7、4對第1主成分的貢獻；峰5、1對第2主成分的貢獻較大；第3主成分主要反映了峰11、6的信息。將共有峰峰面積導入SIMCA 14.0軟件進行PCA分析，得到主成分得分散點圖見圖4?？梢?，大部分樣品較為集中，表明不同產地佩蘭的差異性較小，提示地理環(huán)境等因素對佩蘭藥材質量的影響并不顯著。

圖4 主成分得分散點圖Figure 4 PCA score plot

表5 特征值及方差貢獻率Table 5 Characteristic value and variance contribution rate

表6 旋轉后成分載荷矩陣Table 6 Factors loading matrix after rotating

3 討論

本研究考察了不同的提取溶劑（50%甲醇、70%甲醇、90%甲醇、乙醇）、不同提取時間（5、10、20 min）和不同的提取方式（超聲、回流）對佩蘭指紋圖譜的影響，結果發(fā)現(xiàn)以70%甲醇提取的指紋圖譜信息最為豐富，且不同提取時間和提取方式的差異不明顯，因此，選擇以70%甲醇超聲10 min作為供試品溶液的制備方法。通過考察不同的流動相體系，結果顯示以甲醇-0.1%磷酸水溶液分離效果最佳，因此，選擇以甲醇-0.1%磷酸水溶液作為流動相。采用DAD檢測器進行全波長掃描（190～400 nm），結果顯示以220 nm為檢測波長的指紋圖譜色譜峰較多、基線穩(wěn)定，因此，選擇以220 nm作為檢測波長。

本研究建立了不同產地佩蘭藥材的指紋圖譜，標定了13個共有峰，并指認了其中的5號峰為香豆素。23批樣品的相似度均大于0.90，其中1批樣品相似度低于0.9，可能與生長年限、貯藏環(huán)境等因素有關，需進一步進行分析。相似度結果表明不同產地佩蘭的化學成分種類一致性較高。PCA共提取了3個主成分。主成分得分散點圖結果表明不同產地及來源的佩蘭樣品相似度較高，產地差異不易區(qū)分，與相似度評價結果一致。這可能是由于佩蘭藥材品質受產地環(huán)境影響不大，也為佩蘭道地性不明顯提供了佐證，提示佩蘭藥材的質量優(yōu)劣可能與采收時間、加工方式等更為密切，因此下一步可以對不同采收時間、加工方式的佩蘭藥材進行指紋圖譜研究。

本研究建立了佩蘭藥材的指紋圖譜，但僅指認了其中的1個色譜峰，后續(xù)將結合液質聯(lián)用技術對未知峰進行指認。另外，由于本研究采集的樣本量較少，后續(xù)仍需進一步收集更多產地的多批次樣品進行研究。

中藥是通過多成分、多靶點、多通路發(fā)揮療效的，僅僅對一類成分進行分析不能全面的評價其質量優(yōu)劣。中藥指紋圖譜具有專屬性高、穩(wěn)定性好、整體性強的特點，能更全面的反映中藥材整體的化學成分信息。本研究所建立的佩蘭藥材指紋圖譜，為佩蘭藥材指標成分定量分析、完善佩蘭藥材的質量標準提供了科學的依據，同時，對含有佩蘭的中成藥質量標準研究也具有重要的參考價值。