鄭麗麗，康文芹，牛莎

（焦作市人民醫(yī)院兒科一區(qū)，河南 焦作 454000）

肺炎鏈球菌是一種寄居于人體上呼吸道的球狀革蘭陽(yáng)性菌，是引起兒童呼吸道感染致肺炎的常見(jiàn)病原菌[1]。目前，對(duì)肺炎鏈球菌肺炎的臨床治療以抗生素為主，但是，隨著抗生素的廣泛應(yīng)用，肺炎鏈球的耐藥性逐年升高，導(dǎo)致治療效果不理想，死亡率升高[2-3]。因此，研究新型治療肺炎鏈球菌肺炎的藥物具有重要意義。中藥在防治肺炎上具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，丹參為唇形科植物丹參的干燥根和根莖，具有活血化瘀、抗炎和清熱解毒等藥理作用[4]，據(jù)報(bào)道，丹參對(duì)肺炎患兒的肺功能具有一定的改善作用[5]。丹酚酸B在丹參中含量豐富，是丹參藥理活性最強(qiáng)的成分。本研究擬通過(guò)建立肺炎鏈球菌肺炎幼鼠模型，研究丹酚酸B對(duì)肺炎鏈球菌肺炎幼鼠的保護(hù)作用及其機(jī)制，為臨床治療肺炎鏈球菌肺炎提供實(shí)驗(yàn)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 90只3周齡SPF級(jí)雄性SD大鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)公司，體質(zhì)量50～60 g，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0011。適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥品和儀器 丹酚酸B（質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%，批號(hào)：200719D）購(gòu)自南京道斯夫生物科技有限公司；肺炎鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（批號(hào)：ATCC49619）購(gòu)自上海碩欣生物科技有限公司；蘇木素伊紅染色劑（批號(hào)：G1120）購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司；腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）ELISA試劑盒、兔抗大鼠髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor 88,MyD88）、核因子κB p65（nuclear factorκB p65,NF-κB p65)、p-NF-κB p65、Nod樣受體蛋白 3（Nod-like receptor pyrin domain containing 3,NLRP3）、GAPDH抗體和羊抗兔IgG二抗購(gòu)自英國(guó)ABCam公司（批號(hào)：ab236712；ab234570；ab219413；ab239882；ab183559；ab270449；ab8245；ab150077）；BCA試劑盒（批號(hào)：P001S）購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；flexiVent型動(dòng)物肺功能儀購(gòu)自加拿大SCIREQ公司；HD-310型生物組織自動(dòng)脫水機(jī)、HistoCore_Arcadia型包埋機(jī)、RM2016型石蠟切片機(jī)均購(gòu)自德國(guó)徠卡公司；Biotek Synergy 2 H1 HT型酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)BioTek公司。

1.2 方法

1.2.1 建模與給藥 幼鼠分為對(duì)照組、模型組、丹酚酸B低、中、高劑量組，每組18只。經(jīng)鼻腔滴入肺炎鏈球菌菌液100 μL（菌量3×107CFU/mL）建立肺炎鏈球菌肺炎幼鼠模型[6]（對(duì)照組幼鼠經(jīng)鼻腔滴入等量生理鹽水）。給予菌液后，丹酚酸B低劑量組死亡2只幼鼠，模型組和丹酚酸B中、高劑量組各死亡1只幼鼠。造模后1 d，丹酚酸B低、中、高劑量組幼鼠分別灌胃10、20、40 mg/kg的丹酚酸B[7]，每日1次，連續(xù)7 d，對(duì)照組和模型組灌胃等量生理鹽水。至干預(yù)結(jié)束時(shí)，模型組共死亡3只幼鼠，干預(yù)期間丹酚酸B各劑量組無(wú)幼鼠死亡。觀察幼鼠一般情況。

1.2.2 幼鼠肺功能指標(biāo)檢測(cè) 末次干預(yù)后2 h，腹腔麻醉，頸部備皮，暴露氣管，進(jìn)行氣管插管，采用肺功能儀檢測(cè)用力肺活量（forced vital capacity,FVC）和呼氣峰流速（peak expiratory flow,PEF）。

1.2.3 樣本取材 肺功能檢測(cè)完成后，開(kāi)胸取肺組織，各組隨機(jī)取5只幼鼠肺組織固定于4%（φ）多聚甲醛溶液中，再?gòu)母鹘M取5只幼鼠肺組織加生理鹽水制成勻漿，4℃離心（3 000 r/min，10 min，r=8 cm），取上清液保存于-20℃；取各組剩余幼鼠肺組織液氮保存，待進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè)和Western blot檢測(cè)。

1.2.4 HE染色觀察肺組織病理學(xué)變化 肺組織在4%多聚甲醛溶液中固定24 h，脫水后石蠟包埋切片，厚度5 μm，蘇木素染色5 min，流水沖洗，1%鹽酸酒精分化10 s，1%氨水返藍(lán)后流水沖洗，伊紅染液染色3 min，流水沖洗，脫水，透明，封片，光學(xué)顯微鏡觀察各組幼鼠肺組織病理學(xué)變化。

1.2.5 ELISA法檢測(cè)肺組織TNF-α和IL-6水平 取肺組織勻漿上清液，酶標(biāo)板標(biāo)準(zhǔn)品孔加梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品，樣品孔加上清液及其稀釋液，37℃孵育30 min，加酶標(biāo)試劑（空白孔除外），37℃孵育1 h后加顯色液顯色20 min，標(biāo)準(zhǔn)品孔出現(xiàn)顏色變化時(shí)加終止液，以空白孔調(diào)零，450 nm波長(zhǎng)測(cè)吸光度值（A），使用CurveExpert軟件根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度與吸光度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算TNF-α和IL-6含量。

1.2.6 RT-qPCR檢測(cè)肺組織MyD88、NF-κB p65和NLRP3 mRNA表達(dá)水平 取部分液氮保存肺組織，Trizol法提取總RNA，檢測(cè)RNA濃度及純度。利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。反應(yīng)條件為預(yù)變性95℃ 5 min，變性95℃ 10 s，56℃ 10 s循環(huán)40次。引物序列GAPDH：上游（5′-TGACCTCAACTACATGGTCTACA-3′），下游（5′-CTTCCCATTCTCGGCCTTG-3′）；MyD88：上游（5′-AAGGTGTCGTCGCATGGTG-3′），下游（5′-TTGGTGCAAGGGTTGGTATAGT-3′）；NF-κB p65：上游（5′-ACGATCTGTTTCCCCTCATC-3′），下游（5′-TGCTTCTCTCCCCAGGAATA-3′）；NLRP3：上游（5′-GTGTTGTCAGGATCTCGCATTG-3′），下游（5′-AGCAGCACAGTGAAGTAAGGCC-3′）。以GAPDH為內(nèi)參，2-△△Ct法計(jì)算目的基因表達(dá)水平。

1.2.7 Western blot檢測(cè)肺組織 MyD88、p-NF-κB p65、NF-κB p65和NLRP3蛋白表達(dá)水平 取200 mg液氮保存肺組織，加入裂解液裂解30 min，4℃12 000 r/min，r=8 cm離心10 min，收集上清，調(diào)整蛋白上樣量40 μL，10%SDS-PAGE凝膠電泳（80 V恒壓電泳20 min，100 V恒壓電泳90 min），轉(zhuǎn)至PVDF膜（300 mA恒流轉(zhuǎn)膜1 h），加5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，加入一抗（1∶1 000），4℃孵育過(guò)夜，洗膜后加入二抗（1∶3 000），再次洗膜，滴加ECL顯色劑顯影，以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算目標(biāo)蛋白表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組幼鼠一般情況

干預(yù)1周后，對(duì)照組幼鼠精神狀態(tài)良好，皮毛有光澤，進(jìn)食、飲水和活動(dòng)正常；與模型組比較，丹酚酸B各劑量組幼鼠體型消瘦，精神倦怠，活動(dòng)減少。

2.2 各組幼鼠肺功能指標(biāo)

與對(duì)照組比較，模型組幼鼠FVC和PEF降低（P＜0.05）；與模型組比較，丹酚酸B各劑量組幼鼠FVC和PEF升高（P＜0.05）；與丹酚酸B低劑量組比較，丹酚酸B中、高劑量組幼鼠FVC和PEF升高（P＜0.05）；與丹酚酸B中劑量組比較，丹酚酸B高劑量組幼鼠FVC和PEF升高（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 各組幼鼠肺功能指標(biāo)Table 1 Pulmonary function indexes of young mice in each group(±s)

表1 各組幼鼠肺功能指標(biāo)Table 1 Pulmonary function indexes of young mice in each group(±s)

與對(duì)照組比較：*P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05；與丹酚酸B低劑量組比較：@P＜0.05；與丹酚酸B中劑量組比較：&P＜0.05。

組別對(duì)照組模型組丹酚酸B低劑量組中劑量組高劑量組n 18 15 16 17 17 FVC/mL 7.52±0.72 3.89±0.33*4.77±0.51*#5.59±0.48*#@6.39±0.66*#@&PEF/（mL·s-1）9.81±1.22 4.43±0.49*5.48±0.52*#6.27±0.62*#@7.63±0.94*#@&

2.3 各組幼鼠肺組織病理變化

對(duì)照組幼鼠肺組織結(jié)構(gòu)完整，無(wú)明顯病理改變；模型組幼鼠肺組織結(jié)構(gòu)模糊，有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；丹酚酸B各劑量組幼鼠炎性浸潤(rùn)得到不同程度減輕，其中以丹酚酸B高劑量組減輕效果最明顯。見(jiàn)圖1。

圖1 各組幼鼠肺組織HE染色結(jié)果（200×）Figure 1 HE staining results of lung tissue of young mice in each group(200×)

2.4 各組幼鼠肺組織TNF-α和IL-6水平

與對(duì)照組比較，模型組幼鼠肺組織TNF-α和IL-6水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，丹酚酸B各劑量組幼鼠肺組織TNF-α和IL-6水平降低（P＜0.05）；與丹酚酸B低劑量組比較，丹酚酸B中、高劑量組幼鼠肺組織TNF-α和IL-6水平降低（P＜0.05）；與丹酚酸B中劑量組比較，丹酚酸B高劑量組幼鼠肺組織TNF-α和IL-6水平降低（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 各組幼鼠肺組織TNF-α和IL-6水平Table 2 Levels of TNF-α and IL-6 in lung tissue of young mice in each group(±s,n=5)ρ/（pg·mL-1）

表2 各組幼鼠肺組織TNF-α和IL-6水平Table 2 Levels of TNF-α and IL-6 in lung tissue of young mice in each group(±s,n=5)ρ/（pg·mL-1）

與對(duì)照組比較：*P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05；與丹酚酸B低劑量組比較：@P＜0.05；與丹酚酸B中劑量組比較：&P＜0.05。

組別對(duì)照組模型組丹酚酸B低劑量組中劑量組高劑量組TNF-α 31.76±2.65 91.36±10.27*76.03±7.30*#69.52±6.59*#@52.51±4.55*#@&IL-6 53.56±6.37 158.15±14.09*110.30±10.97*#91.15±9.78*#@80.30±8.06*#@&

2.5 各組幼鼠肺組織MyD88、NF-κB p65和NLRP3 mRNA表達(dá)水平

與對(duì)照組比較，模型組幼鼠MyD88和NLRP3 mRNA表達(dá)升高（P＜0.05）；與模型組比較，丹酚酸B各劑量組幼鼠肺組織MyD88和NLRP3 mRNA表達(dá)水平降低（P＜0.05）；與丹酚酸B低劑量組比較，丹酚酸B中、高劑量組幼鼠肺組織MyD88和NLRP3 mRNA表達(dá)水平降低（P＜0.05）；與丹酚酸B中劑量組比較，丹酚酸B高劑量組幼鼠MyD88和NLRP3 mRNA表達(dá)水平降低（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 各組幼鼠肺組織MyD88、NF-κB p65和NLRP3 mRNA表達(dá)水平Table 3 The expression levels of MyD88，NF-κB p65 and NLRP3 mRNA in the lung tissue of young mice in each group(±s)

表3 各組幼鼠肺組織MyD88、NF-κB p65和NLRP3 mRNA表達(dá)水平Table 3 The expression levels of MyD88，NF-κB p65 and NLRP3 mRNA in the lung tissue of young mice in each group(±s)

與對(duì)照組比較：*P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05；與丹酚酸B低劑量組比較：@P＜0.05；與丹酚酸B中劑量組比較：&P＜0.05。

組別對(duì)照組模型組丹酚酸B低劑量組中劑量組高劑量組MyD88 0.96±0.11 6.23±0.43*NF-κB p65 1.04±0.10 1.27±0.74 NLRP3 0.97±0.10 8.71±1.21*5.99±0.47*#4.04±0.38*#@2.51±0.30*#@&n 8 5 6 7 7 4.74±0.45*#3.83±0.38*#@2.73±0.21*#@&1.79±0.56 1.52±0.68 1.39±0.43

2.6 各組幼鼠肺組織MyD88、p-NF-κB p65、NF-κB p65和NLRP3蛋白表達(dá)水平

與對(duì)照組比較，模型組幼鼠肺組織MyD88、p-NF-κB p65和 NLRP3蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，丹酚酸B各劑量組幼鼠肺組織MyD88、p-NF-κB p65和NLRP3蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）；與丹酚酸B低劑量組比較，丹酚酸B中、高劑量組幼鼠肺組織 MyD88、p-NF-κB p65 和NLRP3蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）；與丹酚酸B中劑量組比較，丹酚酸B高劑量組幼鼠MyD88、p-NF-κB p65和 NLRP3蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）。見(jiàn)表4、圖2。

圖2 各組幼鼠肺組織 MyD88、p-NF-κB p65、NF-κB p65 和NLRP3蛋白表達(dá)圖Figure 2 The protein expression of MyD88，p-NF-κB p65，NF-κB p65 and NLRP3 in the lung tissue of young mice in each group

表4 各組幼鼠肺組織MyD88、p-NF-κB p65、NF-κB p65和NLRP3蛋白表達(dá)水平Table 4 The protein expression levels of MyD88，p-NF-κB p65，NF-κB p65 and NLRP3 in the lung tissue of young mice in each group(±s)

表4 各組幼鼠肺組織MyD88、p-NF-κB p65、NF-κB p65和NLRP3蛋白表達(dá)水平Table 4 The protein expression levels of MyD88，p-NF-κB p65，NF-κB p65 and NLRP3 in the lung tissue of young mice in each group(±s)

與對(duì)照組比較：*P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05；與丹酚酸B低劑量組比較：@P＜0.05；與丹酚酸B中劑量組比較：&P＜0.05。

組別對(duì)照組模型組丹酚酸B低劑量組中劑量組高劑量組n 8 5 6 7 7 MyD88 0.19±0.02 0.79±0.05*0.58±0.06*#0.42±0.04*#@0.29±0.02*#@&NF-κB p65 1.01±0.07 1.04±0.09 1.02±0.09 1.01±0.07 1.04±0.06 p-NF-κB p65 0.21±0.02 0.82±0.06*0.63±0.05*#0.49±0.05*#@0.36±0.03*#@&NLRP3 0.26±0.03 0.88±0.07*0.68±0.05*#0.49±0.06*#@0.41±0.04*#@&

3 討論

肺炎可分為細(xì)菌性肺炎和病毒性肺炎，肺炎鏈球菌是細(xì)菌性肺炎的常見(jiàn)致病菌[8]，當(dāng)機(jī)體免疫力低下時(shí)，肺炎鏈球菌侵入人體，引起肺泡壁水腫、肺泡炎、甚至累及全肺[9]，兒童的自身免疫功能尚不成熟，因此，肺炎患者中兒童較多[10]。本研究采用鼻腔滴入肺炎鏈球菌菌液的方式建立肺炎鏈球菌肺炎幼鼠模型，HE染色結(jié)果顯示，對(duì)照組幼鼠肺組織結(jié)構(gòu)完整，無(wú)明顯病理改變，而模型組幼鼠肺組織結(jié)構(gòu)模糊，有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，提示模型制備成功。

FVC和PEF是判斷肺功能的重要指標(biāo)，指標(biāo)低于正常值表示肺功能低下[11]，通過(guò)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，模型組幼鼠FVC和PEF較對(duì)照組降低，與模型組比較，丹酚酸B各劑量組幼鼠FVC和PEF升高，提示丹酚酸B可改善肺炎鏈球菌肺炎幼鼠肺功能，且改善作用存在劑量依賴性。機(jī)體感染肺炎鏈球菌后，巨噬細(xì)胞活化，產(chǎn)生大量TNF-α、IL-6和IL-1β等促炎因子，促進(jìn)炎癥反應(yīng)[12]，因此，減輕炎癥反應(yīng)是延緩肺炎鏈球菌肺炎發(fā)展的關(guān)鍵。李建成等[13]研究表明，丹酚酸B能夠減輕金黃色葡萄球菌肺炎小鼠體內(nèi)炎癥，促進(jìn)肺組織修復(fù)。本研究結(jié)果顯示，模型組幼鼠肺組織中TNF-α和IL-6水平較對(duì)照組顯著升高，經(jīng)丹酚酸B治療后，TNF-α和IL-6水平顯著下降，提示丹酚酸B可減輕肺炎鏈球菌肺炎幼鼠炎癥反應(yīng)。

MyD88/NF-κB/NLRP3是機(jī)體內(nèi)經(jīng)典的促炎信號(hào)傳導(dǎo)途徑[14]。MyD88是Toll樣受體（TLR）信號(hào)通路中的關(guān)鍵接頭分子，NF-κB家族由p50、p52、p65、c-Rel和Rel B 5個(gè)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子組成[15]，其中，NF-κB p65是細(xì)胞內(nèi)最常見(jiàn)的作用形式，NF-κB p65蛋白在磷酸化后發(fā)揮作用[16]。NLRP3炎癥小體是NF-κB介導(dǎo)的炎性途徑中重要的下游因子，當(dāng)機(jī)體受到刺激時(shí)，MyD88可激活NF-κB，誘導(dǎo)NLRP3炎癥小體表達(dá)[17]。通過(guò)抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路，可抑制NLRP3炎癥小體激活，從而減輕炎癥反應(yīng)[18]。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組幼鼠肺組織MyD88、NLRP3 mRNA和蛋白表達(dá)水平以及p-NF-κB p65蛋白表達(dá)水平均顯著升高，與模型組比較，丹酚酸B各劑量組幼鼠肺組織中以上mRNA和蛋白表達(dá)水平均下降，提示丹酚酸B可能通過(guò)抑制MyD88/NF-κB/NLRP3通路相關(guān)蛋白及基因表達(dá)，減輕肺炎鏈球菌小鼠炎癥反應(yīng)。

綜上所述，丹酚酸B對(duì)肺炎鏈球菌肺炎幼鼠具有治療作用，其機(jī)制可能與抑制MyD88/NF-κB/NLRP3通路，減輕炎癥反應(yīng)有關(guān)。