何 源，王露露，張 晶.*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學中藥材學院，吉林 長春 130118；2.長春科技學院醫(yī)藥學院，吉林 長春 130600)

鹿茸為鹿科動物梅花鹿CervusnipportTemminck、馬鹿CervuselaphusLinnaeus雄鹿頭上的未骨化密生茸毛的幼角，是具有悠久歷史的名貴傳統(tǒng)中藥。具有壯腎陽、益精血、強筋骨等功效，用于腎陽不足、精血虧虛、陽痿滑精、宮冷不孕等[1]。馴鹿CervusrangiferTarandus的雌雄鹿頭上均有角，其主要分布于北半球的環(huán)北極地區(qū)，在中國多生長于大興安嶺地區(qū)，馴鹿鹿茸與梅花花鹿鹿茸、馬鹿鹿茸一樣，均具有較高且相似的藥用價值[2]。鹿茸中活性成分包括脂類、多糖類、氨基酸類等，這些成分具有抗炎、抗?jié)?、抗衰老等多種藥理作用[3]。

傅立葉變換紅外光譜法是分析中藥中有效成分結構和官能團的常用方法[4]，其原理是來自連續(xù)非相干光源的紅外輻射穿過邁克爾遜干涉儀，同時記錄干涉圖隨光程差的變化，并通過使用傅立葉變換過程從干涉圖中解碼頻譜信息[5]。紅外二階導數(shù)光譜可很好的分辨出紅外譜圖中肉眼觀察不到的重疊吸收峰，增強譜圖的特征性，提高分標率，能有效的辨別出相同種類不同來源的藥材[6]。

鹿茸多糖是鹿茸中主要的活性成分，近年來不斷有學者對鹿茸多糖的提取工藝做出優(yōu)化，崔長生等[7]利用熱水提取法提取鹿茸多糖。宋佳等[8]利用超聲輔助提取馬鹿茸多糖。鹿茸多糖具有多種藥理活性，其中鹿茸多糖的抗氧化活性一直是研究的重點，趙玉紅等[9]用陰離子交換和葡聚糖凝膠層析對鹿茸多糖進行分離純化，結果表明鹿茸多糖及其各組分對DPPH自由基、羥基自由基、超氧陰離子自由基均有清除效果，且具有一定的還原能力。盡管鹿茸多糖的體外抗氧化活性已有研究，但對3種鹿源鹿茸多糖體外抗氧化活性的比較研究較少，因此本文對3種鹿源鹿茸多糖的體外抗氧化活性進行分析比較，為篩選出效果最佳的天然抗氧化劑提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥材 梅花鹿鹿茸、馬鹿鹿茸、馴鹿鹿茸于2019年采購于吉林雙陽鹿場，將其進行割絨去皮處理，鋸成片狀，高速萬能粉碎機粉碎，過80目篩，在-80 ℃下保存。

1.2 試劑與儀器 乙醚、乙醇、氯仿、苯酚、濃硫酸、無水葡萄糖、K2S2O8、FeSO4、H2O2、K3Fe(CN)6、三氯乙酸、三氯化鐵等(北京化工廠)；DPPH、ABTS標準品(德國Aldrich公司)。傅里葉變換紅外光譜儀L1600400，掃描范圍4 000～400 cm-1，分辨率4 cm-1(美國Perkin Elmer公司)；T6新世紀紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)；FLB-250型萬能高速粉碎機(上海菲力博食品機械有限公司)；XB120A電子天平(普利賽斯國際貿(mào)易上海有限公司)；LYOQUEST-55西班牙泰事達凍干機(北京昊諾斯科技有限公司)；SPECTROstar Nano高通量紫外酶標儀(伯齊科技有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 多糖提取 取過篩干燥后的鹿茸粉末各10 g，乙醚回流提取3 h脫脂過濾，殘渣揮凈乙醚后加水煎煮(料液比為1∶10)3次，1 h/次，煎煮濾液，4 500 r/min離心5 min，取上清液，加乙醇至80%以上，4 ℃靜置過夜，8 000 r/min離心，沉淀加水溶解，采用Sevage法[10]除去溶液中雜質(zhì)蛋白，30% H2O2脫色，透析，濃縮，真空冷凍干燥24 h。

1.3.2 多糖含量測定 采用苯酚-濃硫酸法[11]。精密稱取10 mg葡萄糖粉末，加水定容至100 mL量瓶中，得到100 μg/mL溶液，分別精密吸取0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL至試管中，加水使其終體積為1 mL，再加入5%苯酚1.0 mL，混勻，沿管壁緩慢加入濃硫酸5 mL，搖勻，沸水浴20 min后冷卻靜置10 min，在490 nm波長處測定吸光度，以吸光度為縱坐標(A)、多糖質(zhì)量濃度為橫坐標(X)進行回歸，得方程為A=0.005 9X+0.000 7(R2=0.999 6)，在10～100 μg范圍內(nèi)線性關系良好。精密稱取多糖粉末10 mg，制成100 μg/mL溶液，測定含量，公式為含量=(多糖質(zhì)量濃度/100)×(粗多糖產(chǎn)量/鹿茸粉末質(zhì)量)。

1.3.3 紅外光譜分析 將多糖粉末在40 ℃下烘干后過80目篩，取一定量平鋪于FT-IR光譜的ATR測定窗口，調(diào)整旋鈕使模具壓平待測樣品，待測力計數(shù)值穩(wěn)定后觀察紅外光譜[12]，設定光譜掃描范圍4 000～400 cm-1，累計掃描4次，分辨率5 cm-1，得到的紅外原始譜圖通過Spectrum軟件進行平滑及基線校正進行優(yōu)化處理，再作紅外二階導數(shù)分析。

1.3.4 抗氧化活性測定 將多糖配制成1、2、4、6、8、10 mg/mL溶液，同法處理維生素C(陽性對照)。

1.3.4.1 DPPH自由基清除能力 稱取DPPH粉末8.00 mg至100 mL量瓶中，無水乙醇定容至刻度，避光保存。取多糖溶液40 μL，加入160 μLDPPH溶液后置于96孔板中，混勻，避光反應1 h，在517 nm波長處測定吸光度，平行3次，取平均值，同法測定維生素C吸光度，計算DPPH自由基清除率，公式為清除率=[1-(A-C)/B]×100%，其中A為多糖溶液+DPPH吸光度，B為水+DPPH吸光度，C為多糖溶液+無水乙醇吸光度。

1.3.4.2 ABTS自由基清除能力 稱取20.40 mg ABTS粉末至10 mL量瓶中，依次加入5 mL蒸餾水、5 mL 2.6 mmol/mL K2S2O8溶液，室溫避光反應16 h，無水乙醇稀釋，使其在734 nm處的吸光度為0.7±0.05。取多糖溶液80 μL，加入ABTS溶液140 μL后置于96孔板中，室溫避光反應30 min，在734 nm波長處測吸定光度，計算ABTS自由基清除率，公式為清除率=(1-A/B)×100%，其中A為多糖溶液+ABTS吸光度，B為ABTS吸光度。

1.3.4.3 羥基自由基清除能力 準確吸取10 mmol/L水楊酸乙醇溶液10 μL、蒸餾水70 μL、多糖溶液10 μL、10 mmol/L FeSO4溶液10 μL、100 mmol/L H2O2100 μL，置于96孔板中混勻，在510 nm波長處測得吸光度A；準確吸取10 mmol/L水楊酸乙醇溶液10 μL、蒸餾水80 μL、多糖溶液10 μL、100 mmol/L H2O2100 μL，置于96孔板中混勻，在510 nm波長處測定吸光度B；準確吸取10 mmol/L水楊酸乙醇溶液10 μL、蒸餾水80 μL、10 mmol/LFeSO4溶液10 μL、100 mmol/L H2O2100 μL，置于96孔板中混勻，在510 nm波長處測定吸光度C，計算羥基自由基清除率，公式為清除率=[1-(A-B)/C]×100%。

1.3.4.4 鐵離子總還原能力 取多糖溶液、1%鐵氰化鉀、磷酸鹽緩沖液(pH=6.6)各0.25 mL，置于1.5 mL小離心管中，混合均勻后50 ℃水浴加熱20 min后迅速取出，冷卻至室溫，加0.25 mL 10%三氯乙酸溶液，混勻，3 000 r/min離心10 min。取上清液100 μL，加入1%FeCl3溶液20 μL、蒸餾水100 μL至96孔板中，混勻靜置20 min后在700 nm波長處測定吸光度A。取上清液100 μL，加入120 μL 蒸餾水后置于96孔板中，混勻靜置20 min，在700 nm波長處測定吸光度B，計算鐵離子總還原能力，公式為總還原能力=A-B。

2 結果

2.1 多糖含量 由表1可知，梅花鹿、馬鹿鹿茸多糖含量高于馴鹿鹿茸多糖含量(P<0.05)。

表1 3種鹿源鹿茸多糖含量測定結果

2.2 紅外光譜 圖1、表2顯示，在3 500～3 000 cm-1處是O-H、N-H伸縮振動的吸收帶，馴鹿鹿茸多糖在3 287 cm-1處的吸收峰略窄與其他兩種鹿茸多糖；2 930 cm-1附近的C-H的拉伸和彎曲振動吸收峰是多糖的特征吸收峰，次峰出現(xiàn)在2 854 cm-1處，表明存在亞甲基；3種鹿茸多糖在1 634 cm-1處的相對較強的吸收峰是由C=O伸縮振動引起的；1 547 cm-1附近是N-H的面內(nèi)彎曲振動[13]；1 455、1 402 cm-1處是C-H的彎曲振動；1 337 cm-1附近是C-N的伸縮振動吸收峰，表明存在酰胺基團；1 240 cm-1附近是硫酸根中的S=O吸收峰[14]，表明3種鹿茸多糖均存在硫酸根基團；1 200～1 000 cm-1處吸收峰表示C-O伸縮的吡喃環(huán)振動[15]。另外，梅花鹿鹿茸多糖的強度最大，峰型較寬，其次是馴鹿鹿茸多糖，峰型較尖銳，新西蘭馬鹿鹿茸多糖在此處的強度較小。綜上所述，3種鹿茸多糖均具有典型的多糖結構，并含有酰胺和硫酸根基團。

圖1 3種鹿源鹿茸多糖紅外光譜

表3顯示，吸收峰強度依次為梅花鹿鹿茸多糖>馬鹿鹿茸多糖>馴鹿鹿茸多糖，含量排序亦然。

表2 共有峰官能團及振動方式

2.3 紅外二階導數(shù)分析 在鹿茸多糖紅外光譜圖上出現(xiàn)多個吸收峰，但譜峰重疊現(xiàn)象嚴重，給譜圖解析帶來困難，故本實驗在1 800～800 cm-1的光譜區(qū)間對其紅外光譜進行了二階導數(shù)處理。圖2顯示，鹿茸多糖在1 694、1 683、1 667、1 652、1 575、1 564、1 557、1 498、1 463、1 455、1 336 cm-1等位置有明顯的共有吸收峰，表明存在芳環(huán)骨架振動；馬鹿、馴鹿鹿茸多糖在1 634 cm-1處有1個較強的吸收峰，而梅花鹿鹿茸多糖在1 618 cm-1處有1個特征吸收峰，馴鹿鹿茸多糖在1 498 cm-1處的吸收帶無肩峰，峰型較寬，由此可將3種鹿茸多糖區(qū)分開來。

表3 共有峰吸收強度

圖2 鹿茸多糖紅外二階導數(shù)譜圖

2.4 抗氧化活性

2.4.1 DPPH自由基清除能力 DPPH自由基是一種穩(wěn)定的自由基，其單電子對可與抗氧化劑相互配對，使其吸光度減小，顏色從紫色變?yōu)榈S色，被廣泛用于評估食品、藥品抗氧化能力[16]。圖3顯示，DPPH自由基清除能力依次為梅花鹿鹿茸多糖>馴鹿鹿茸多糖>馬鹿鹿茸多糖，并呈現(xiàn)劑量依賴性，但弱于維生素C。

圖3 鹿茸多糖對DPPH自由基的清除作用

2.4.2 ABTS自由基清除能力 ABTS可與過硫酸鉀發(fā)生氧化反應，生成穩(wěn)定的藍綠色陽離子自由基，被廣泛應用于親水性物質(zhì)的抗氧化能力的測定[17]。圖4顯示，ABTS自由基清除能力依次為梅花鹿鹿茸多糖>馴鹿鹿茸多糖>馬鹿鹿茸多糖，并呈現(xiàn)劑量依賴性，但弱于維生素C。

圖4 鹿茸多糖對ABTS自由基的清除作用

2.4.3 羥基自由基清除能力 羥基自由基被證明是一種最活潑的氧自由基，具有很高的反應速率常數(shù)，可使DNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)發(fā)生氧化損傷，被廣泛應用于反映抗氧化能力強弱[18]。圖5顯示，羥基自由基清除能力依次為梅花鹿鹿茸多糖>馴鹿鹿茸多糖>馬鹿鹿茸多糖，并呈現(xiàn)劑量依賴性，但弱于維生素C。

圖5 鹿茸多糖對羥基自由基的清除作用

2.4.4 鐵離子總還原能力 多糖的總還原力是測量其抗氧化活性的潛在指標，它通過給出電子發(fā)揮總還原力，進而達到清除自由基的目的，總還原力越強，抗氧化能力就越強[19]。圖6顯示，總還原力依次為梅花鹿鹿茸多糖>馴鹿鹿茸多糖>馬鹿鹿茸多糖，并呈現(xiàn)劑量依賴性，但弱于維生素C。

圖6 鹿茸多糖對鐵離子的總還原力

2.4.5 IC50將鹿茸多糖對DPPH自由基、ABTS自由基、羥基自由基的抗氧化曲線進行擬合，得到IC50，結果見表4。由此可知，梅花鹿鹿茸多糖IC50最低，馬鹿鹿茸多糖IC50最高，即梅花鹿茸多糖抗氧化活性最強，馬鹿鹿茸多糖抗氧化活性最弱。

表4 鹿茸多糖IC50測定結果

3 結論

本實驗從3種鹿源鹿茸中提取鹿茸多糖，其優(yōu)勢在于可大量提取。結果，梅花鹿鹿茸多糖的含量要高于馴鹿鹿茸多糖和馬鹿鹿茸多糖；從紅外光譜中看出，它們均具有典型的多糖結構，且含有酰胺和硫酸根基團，峰型與峰位置大致相似，但峰強度有所差異，說明3種鹿源中多糖類型相似但含量有所差異。紅外的二階導數(shù)譜圖結果表明，3種鹿茸多糖在峰型上大致相似，但也存在差異。梅花鹿鹿茸多糖在1 618 cm-1處有1個特征吸收峰，馬鹿鹿茸多糖、馴鹿鹿茸多糖在1 634 cm-1處有較強的吸收峰，而梅花鹿鹿茸多糖則無此峰，馴鹿鹿茸多糖在1 498 cm-1處的吸收帶無肩峰且峰型較寬，以此可進行辨別。另外，3種鹿源鹿茸多糖均具有體外抗氧化活性，梅花鹿鹿茸多糖清除DPPH自由基、ABTS自由基、羥基自由基的效果及鐵離子還原力要高于馴鹿和馬鹿鹿茸多糖。

綜上所述，本實驗比較3種鹿源鹿茸多糖的抗氧化能力，為該成分在天然抗氧化劑篩選方面提供了較強的理論依據(jù)，并且其差異可能與多糖的含量、結構等因素有關，后續(xù)還有待進一步研究。