婁依婷，陶 然，李勇正，翁笑燕，應彬彬，王慧明*

(1.浙江大學附屬寧波醫(yī)院，寧波市第一醫(yī)院，浙江 寧波 315000；2.浙江大學醫(yī)學院附屬口腔醫(yī)院，浙江省口腔生物醫(yī)學研究重點實驗室，浙江 杭州 310006；3.福建醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院人體解剖學系，福建醫(yī)科大學臨床應用解剖學研究室，福建 福州 350122)

口腔扁平苔蘚是常見的口腔黏膜慢性炎癥疾病，人群患病率為0.1%～4%[1]，惡變率約為 0～5.3%[2-3]，被世界衛(wèi)生組織(WHO)列為癌前狀態(tài)[4]，可以同時發(fā)生在口腔黏膜的多個位置，最多見于頰黏膜，表現(xiàn)為網(wǎng)狀、條紋狀、萎縮、糜爛充血等改變[5]。目前針對該病尚無根治方法，主要使用如腎上腺皮質(zhì)激素類藥物、免疫抑制劑等減輕炎癥、促進愈合，盡管取得了一定的療效，但是病情容易反復，且激素長期治療有明顯的副作用。因此，選擇既有效，又不出現(xiàn)嚴重不良反應的藥物對于治療口腔扁平苔癬具有重要意義。近年來，中藥注重對整體的調(diào)節(jié)，毒副作用較小，其合理開發(fā)應用對治療該病具有重要臨床意義。

白芍總苷提取自芍藥干燥根，是包括芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、苯甲酰芍藥苷、羥基芍藥苷、芍藥花苷在內(nèi)的一組糖苷類物質(zhì)的統(tǒng)稱。它具有抗炎、止痛、免疫調(diào)節(jié)等功效，主要用于治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風濕性關節(jié)炎等免疫系統(tǒng)疾病[6-7]，臨床研究證明白芍總苷可以作為免疫調(diào)節(jié)劑治療口腔扁平苔癬，單獨或與西藥聯(lián)合使用提高臨床療效，減少不良反應。如白芍總苷可以緩解口腔扁平苔蘚的癥狀，控制其炎癥的發(fā)生、發(fā)展[8]；聯(lián)合復方倍他米松治療糜爛性口腔扁平苔癬，降低復發(fā)率[9]；聯(lián)合曲安奈德能降低口腔扁平苔癬患者血清中的腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor，TNF-α)和白介素6(IL6)水平[10]。雖然白芍總苷干預口腔扁平苔癬的療效比較明確，但具體作用分子機制仍不明確，需要進一步研究。

中藥具有多成分特點，并非通過單一靶點、通路來發(fā)揮作用，傳統(tǒng)藥理學的單一性思維難以總結(jié)藥物作用于機體的機制。2007年英國藥理學家Hopkins提出網(wǎng)絡藥理學概念[11]，通過結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)學和生物信息學，利用生物學數(shù)據(jù)庫來構(gòu)建“疾病-基因-靶點-藥物”網(wǎng)絡觀察藥物對疾病的作用機制，這與中藥多靶點、多通道作用的特點相契合。同時，運用分子對接技術預測模擬成分與相應受體的結(jié)合方式，以闡明作用靶點。本研究基于以上2種方法對白芍總苷治療口腔扁平苔癬的作用機制進行研究，預測白芍總苷的主要活性成分，為口腔扁平苔癬的臨床干預治療提供幫助。

1 材料和方法

1.1 一般資料和評價標準 選擇2019年4月至2020年10月于浙江大學醫(yī)學院附屬口腔醫(yī)院黏膜科就診的扁平苔癬患者103例，其中男33例，女70例；年齡平均(50.07±13.49)歲。根據(jù)用藥分為白芍總苷治療(觀察組，53例)和常規(guī)用藥(對照組，50例)2大類，依據(jù)中華口腔醫(yī)學會口腔黏膜病專委會制定的口腔扁平苔癬療效評價標準及指南比較2組治療有效率，即病損完全消退，黏膜恢復正常，自覺癥狀消失記為“治愈”；充血和糜爛完全消失，白色條紋無或輕微，疼痛完全消失記為“顯效”；充血和糜爛面積縮小，白色條紋減少，疼痛減輕記為“有效”；充血和糜爛無變化或增加，白色條紋無變化或增加，疼痛無減輕或加重記為“無效”?？傆行?(治愈例數(shù)+顯效例數(shù)+有效例數(shù))/總例數(shù)×100%。

1.2 數(shù)據(jù)庫及軟件 有機小分子生物活性數(shù)據(jù)庫PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)；中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺TCMSP(https:// tcmspw.com/tcmsp.php)；中醫(yī)藥研究綜合數(shù)據(jù)庫TCMID(http://www.megabionet.org/tcmid/)；化合物蛋白質(zhì)互作STITCH數(shù)據(jù)庫(http://stitch.embl.de)；生物活性小分子靶向預測平臺SwissTargetPrediction(https://www.swisstargetprediction.ch)；通用蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫Uniprot(https://www.uniprot.org)；疾病基因與突變位點DisGeNET數(shù)據(jù)庫(www.disgenet.org/)；治療靶點TTD數(shù)據(jù)庫(http://bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/)；人類基因綜合數(shù)據(jù)庫Genecards(https://www.genecards.org)；在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫OMIM(https://omim.org)；功能富集分析數(shù)據(jù)庫DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)；蛋白互作平臺String version 11.0(https://string-db.org)；蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫PBD(http://www.rcsb.org/)。R語言VennDiagram 1.6.20包；網(wǎng)絡拓撲屬性分析軟件Cytoscape 3.6.1；R語言ggplot2包；三維分子模型軟件Pymol 2.5；分子對接軟件AutoDock 4.2。

1.3 白芍總苷化學成分與靶點信息收集 根據(jù)白芍總苷系統(tǒng)成分分析結(jié)果，利用PubChem數(shù)據(jù)庫獲取其SDF格式文件及對應的簡化分子線性輸入規(guī)范(simplified molecular input line entry specification，SMILES)結(jié)構(gòu)，對其分子結(jié)構(gòu)進一步確證。以化學成分芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、羥基芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、芍藥花苷為關鍵詞，分別輸入TCMSP、TCMID、STITCH數(shù)據(jù)庫獲得化合物預測靶點。同時，將上述化合物的SDF格式文件置入SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫，結(jié)合上述數(shù)據(jù)庫，綜合預測白芍總苷中化學成分的作用靶點。根據(jù)UniProt數(shù)據(jù)庫中UniProKBt檢索功能，輸入預測靶點信息，預測條件限定物種為“Homosapiens(Human)”，將所有靶點名稱校正為官方名稱(Official gene symbol)。

1.4 口腔扁平苔癬疾病靶點預測 通過DisGeNET、TTD、GeneCards、OMIM數(shù)據(jù)庫，輸入關鍵詞檢測“Oral lichen planus”，物種設置為“Homosapiens(Human)”，查找分析和口腔扁平苔癬相關的人類基因，將各數(shù)據(jù)庫檢索結(jié)果匯總后去除重復基因并查閱相關文獻進行驗證，最終獲得口腔扁平苔癬相關靶點。

1.5 構(gòu)建“白芍總苷-主要化合物-靶點-疾病”網(wǎng)絡 根據(jù)上述靶點信息，利用R語言VennDiagram包，繪制藥物和疾病的韋恩圖，獲得藥物和疾病共同分子靶點?；谑占@得的預測靶點，在Excel表中分別構(gòu)建“藥物-主要化合物”“主要化合物-靶點”“靶點-疾病”之間的相互關系，采用Cytoscape軟件進行拓撲結(jié)構(gòu)分析，繪制“白芍總苷-主要化合物-藥物靶點-疾病”網(wǎng)絡圖。其中不同的節(jié)點(Node)分別代表了白芍總苷、主要化合物、作用靶點、疾病，邊(Edge)代表了四者之間的關系。

1.6 作用靶點功能和通路的富集分析 基于收集獲得的白芍總苷治療口腔扁平苔蘚的預測靶點，采用DAVID數(shù)據(jù)庫，物種限定為“Homosapiens”，對預測靶點進行GO和KEGG分析，利用R語言ggplot2包將結(jié)果可視化。其中，GO分析分為分子功能(molecular function，MF)，生物過程(biological process，BP)和細胞組成(cellular component，CC)三個部分。

1.7 構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡并篩選關鍵(hub)基因 將白芍總苷治療口腔扁平苔蘚的預測靶點導入String數(shù)據(jù)庫，物種限定為“Homosapiens”，獲取蛋白質(zhì)相互作用信息。篩選具有高置信度(≥0.75)的網(wǎng)絡關系，將其導入Cytoscape軟件，繪制PPI網(wǎng)絡圖。利用Cytoscape中CytoHubba插件，按MCC(maximal clique centrality)計算方法，篩選排名前十的hub基因。利用Cytoscape中MCODE插件，進一步提取了其中的核心子網(wǎng)絡。

1.8 主成分-主靶點分子對接 在TCMSP數(shù)據(jù)庫中獲取主成分的三維(3D)結(jié)構(gòu)，利用PyMOL軟件將其轉(zhuǎn)換為PDB格式，并使用AutoDock軟件進行加氫、加電子等操作，觀察可扭轉(zhuǎn)的化學鍵個數(shù)，保存為Pdbqt格式。從PDB數(shù)據(jù)庫下載疾病靶點蛋白3D結(jié)構(gòu)的PDB格式文件，并運用PyMOL軟件對蛋白質(zhì)分子進行去水去化合物，利用AutoDock軟件將蛋白質(zhì)加氫、加電子，轉(zhuǎn)化成備用對接文件格式(Pdbqt)格式，用AutoGrid進行計算。對接時構(gòu)象計算算法為基因遺傳算法(Genetic Algorithm)，參數(shù)默認，結(jié)果輸出方式為Genetic Algorithm。通過結(jié)合能(binding energy，BE)對成分與靶點之間的結(jié)合活性進行評價，利用PyMOL軟件使對接文件可視化。

2 結(jié)果

2.1 2組治療有效率比較 治療后觀察組有效率為86.79%，對照組有效率為62.00%，兩者差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 2組臨床治療有效率比較(例)

2.2 白芍總苷的主要成分靶點 根據(jù)白芍總苷系統(tǒng)成分分析結(jié)果(圖1)，得到5個有效成分分別為芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、羥基芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、芍藥花苷。將5個化學成分輸入TCMSP、TCMID、STITCH和SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫，搜索結(jié)果經(jīng)篩選后共得到438個藥物潛在靶點，去除重復的預測靶點后結(jié)果為199個。

圖1 白芍總苷有效成分

2.3 疾病靶點的篩選及其與藥物共有靶點預測 通過DisGeNET、TTD、GeneCards、OMIM數(shù)據(jù)庫分別以疾病名稱“Oral lichen planu”進行檢索，其中DisGeNET數(shù)據(jù)庫獲得治療口腔扁平苔癬的疾病靶點454個，TTD數(shù)據(jù)庫篩選得到疾病靶點4個，GeneCards數(shù)據(jù)庫篩選后得到疾病靶點402個，OMIM數(shù)據(jù)庫得到疾病靶點2個，4個數(shù)據(jù)庫結(jié)果匯總?cè)ブ貜晚棧玫郊膊“悬c共534個。將白芍總苷藥物靶點與口腔扁平苔癬疾病靶點進行映射匹配，得到白芍總苷治療口腔扁平苔癬的靶點共39個，繪制韋恩圖(圖2)。

圖2 疾病靶點-藥物靶點韋恩圖

圖3 白芍總苷活性成分治療口腔扁平苔癬的潛在靶點GO分析

2.4 GO功能和KEGG信號通路富集分析 將白芍總苷主要成分預測得出的39個作用靶點，通過DAVID數(shù)據(jù)庫進行GO分析和KEGG分析。GO功能富集分析顯示(圖3)，在生物過程(BP)中，白芍總苷治療靶基因主要參與RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控(positive regulation of transcription from RNA polymeraseⅡ promoter)、對NF-κB轉(zhuǎn)錄因子活性的正調(diào)控(positive regulation of NF-κB transcription factor activity)、炎癥反應(inflammatory response)、凋亡過程的負調(diào)控(negative regulation of apoptotic process)等過程；在分子功能(MF)中，白芍總苷治療靶基因主要參與金屬內(nèi)肽酶活性(metalloendopeptidase activity)、脂多糖結(jié)合(lipopolysaccharide binding)、鋅離子結(jié)合(zinc ion binding)；在細胞組成(CC)中，白芍總苷治療靶基因主要作用于核(nucleus)、胞外間隙(extracellular space)、質(zhì)膜(plasma membrane)。

KEGG信號通路富集結(jié)果顯示，白芍總苷治療口腔扁平苔癬主要涉及的通路主要有TLR信號通路(Toll-like receptor signaling pathway)、腫瘤壞死因子信號通路(TNF signaling pathway)、癌癥中的蛋白多糖(proteoglycans in cancer)、PI3K-Akt信號通路(PI3K-Akt signaling pathway)、癌癥的途徑(pathways in cancer)、NOD樣受體信號通路(NOD-like receptor signaling pathway)，提示白芍總苷治療口腔扁平苔癬可能通過以上多條信號通路協(xié)同作用。圖4是排名前20的信號通路富集數(shù)據(jù)，圓圈大小代表基因數(shù)目，參與該信號通路靶基因的數(shù)目越多，圓圈直徑越大；圓圈的顏色從藍色到綠色再變紅代表P值逐漸變小，P值越小，說明參與該信號通路的靶基因富集程度越高。

2.5 PPI網(wǎng)絡分析 將白芍總苷預測治療靶點導入String數(shù)據(jù)庫，得到PPI網(wǎng)絡圖，網(wǎng)絡圖包括了39個節(jié)點，304條邊，平均節(jié)點度為15.6，平均局部聚類系數(shù)為0.767，導入Cytoscape軟件，繪制PPI網(wǎng)絡圖(圖5A)。利用Cytoscape中cytoHubba插件，挖掘hub基因。IL6、CASP3、TNF、TP53、STAT3、EGFA、MMP9、EGFR、MMP2、PTGS2為排名前十的基因，這些靶基因可能是PPI網(wǎng)絡中的樞紐節(jié)點，也很可能是白芍總苷治療口腔扁平苔癬的核心靶點(圖5B)。利用Cytoscape中MCODE插件，發(fā)現(xiàn)了其中的核心子網(wǎng)絡(圖5C)。

圖4 通路分析氣泡圖

圖5 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡分析圖

2.6 分子對接 芍藥苷是白芍總苷的主要有效成分，其含量占總苷的90%以上，將該活性成分與Cytoscape軟件中cytoHubba得出的IL6、CASP3、TP53、STAT3關鍵靶點進行分子對接，并利用PyMOL程序?qū)ζ溥M行可視化分析。每種活性成分產(chǎn)生50種對接結(jié)果，結(jié)合能越小說明受體與配體之間的親和力越大，按結(jié)合能從低到高將對接結(jié)果進行排序，選取結(jié)合能最低且構(gòu)象較好的結(jié)果作為分子對接結(jié)果。圖6依次為芍藥苷和CASP3、IL6、STAT3、TP53分子對接結(jié)果，圖中標注了主要結(jié)合位點和結(jié)合氫鍵長度。

圖6 芍藥苷與CASP3(A)、IL6(B)、STAT3(C)、TP53(D)的分子對接

2.7 白芍總苷-成分-作用靶點-通路-口腔扁平苔癬疾病網(wǎng)絡構(gòu)建 采用Cytoscape軟件構(gòu)建白芍總苷-成分-作用靶點-口腔扁平苔癬疾病的網(wǎng)絡模型，該網(wǎng)絡有697個節(jié)點和863條邊(圖7)，其中下標符代表藥物，正方形節(jié)點代表疾病，菱形節(jié)點代表成分，圓形節(jié)點代表靶點，其中黃色圓形靶點代表共同作用靶點，邊代表相互作用關系。度值在網(wǎng)絡分析中越大說明與之相連的節(jié)點數(shù)越多。芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、羥基芍藥苷、苯甲酰芍藥苷能與50個以上靶點相連接，推測這4個成分是白芍總苷中多靶點治療口腔扁平苔癬的主要活性成分。ADRA2B、ADRA2C、FGF2、MMP2、STAT3、TP53、GABRA3、HSPA5、IL6這些靶點可能在口腔扁平苔癬治療中發(fā)揮重要的作用。以上結(jié)果可以得出白芍總苷的各個成分通過多靶點、多信號通路來治療口腔扁平苔癬。

圖7 白芍總苷-成分-靶點-疾病網(wǎng)絡

3 討論

口腔扁平苔蘚的發(fā)病機制尚未完全明確，國內(nèi)外研究認為該病可能與自身免疫因素、精神因素相關[12-14]。近年來中藥白芍總苷在調(diào)節(jié)免疫等方面表現(xiàn)出較好療效[15]，可以緩解癥狀，控制炎癥的發(fā)生發(fā)展[8]，但其藥效物質(zhì)基礎和作用機制較難明確。

本研究借助網(wǎng)絡藥理學的方法，探討白芍總苷治療口腔扁平苔癬的物質(zhì)基礎及其分子機制，分析獲得藥物和疾病共同分子靶點39個，主要靶點包括IL6、TNF、TP53、STAT3、MMP2、MMP9、EGFR等。IL6是近年來研究最熱門的炎癥細胞因子之一，國內(nèi)外研究表明口腔扁平苔癬患者的血清和唾液中IL6表達較健康人升高，可以作為口腔扁平苔癬的診斷和治療靶標[16-18]。TNF是一種能夠直接殺傷腫瘤細胞而對正常細胞無明顯毒性的內(nèi)細胞因子，分為TNF-α，TNF-β兩種[19]。實驗證明TNF-α參與口腔扁平苔癬的發(fā)病及病變發(fā)展過程，且兩者之間有相關性[20-22]。臨床研究表明TNF-α同IL6在口腔扁平苔癬患者外周血清中高表達，而白芍總苷的使用可以降低兩者的水平[10]。

口腔扁平苔癬被WHO歸類為癌變前疾病，腫瘤抑制基因(TP53)參與誘導細胞周期停滯或DNA損傷細胞的凋亡[23-24]，有研究發(fā)現(xiàn)在口腔扁平苔癬中TP53家族成員P63和其相關蛋白表皮生長因子受體(EGFR)表達下降，后者被認為在上皮角化增殖中起重要作用[25]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)MMP2和MMP9的表達與口腔扁平苔癬的發(fā)生、發(fā)展乃至癌變潛能有關，可以作為口腔潛在惡性疾病的早期診斷標志物[26-27]。信號轉(zhuǎn)導子和轉(zhuǎn)錄激活子3(STAT3)是一種在多種組織(包括口腔黏膜)中表達的信號分子，可能是口腔扁平苔癬疾病發(fā)生發(fā)展過程中與臨床分型密切相關的關鍵轉(zhuǎn)錄信號蛋白，在正常對照組、網(wǎng)狀口腔扁平苔癬、糜爛性口腔扁平苔癬組中STAT3的表達逐漸升高[28-29]。白芍總苷可以下調(diào)STAT3表達，從而改善間充質(zhì)干細胞的免疫調(diào)節(jié)功能[30]。

本研究分析結(jié)果表明白芍總苷治療口腔扁平苔癬主要涉及TLR信號通路、TNF信號通路、PI3K-Akt信號通路等，它們在炎癥和免疫反應的調(diào)節(jié)中起關鍵作用。TNF信號通路不僅與炎癥、凋亡密切相關，而且與PI3K-Akt信號通路間的交叉作用參與細胞周期調(diào)節(jié)[31-32]。此外，口腔扁平苔癬的發(fā)生涉及角質(zhì)形成細胞的變性，而角質(zhì)形成細胞中的TLRs在皮膚自身免疫疾病中起重要作用[33-37]。白芍總苷顯示出的抗炎和免疫調(diào)節(jié)活性，已經(jīng)被證明可以通過選擇性地調(diào)節(jié)PI3K/Akt/mTOR途徑[38]、抑制TNF-α的產(chǎn)生[39]、阻斷體內(nèi)TLRs的活化[40]等對免疫相關疾病起到保護作用。

本研究通過網(wǎng)絡藥理學方法分析了白芍總苷治療口腔扁平苔癬的活性成分、關鍵基因和作用機制，構(gòu)建了“藥物-靶點-疾病”網(wǎng)絡，并驗證了主要活性成分與重要靶點之間存在較好的結(jié)合活性，說明白芍總苷通過多成分-多靶點-多通路治療口腔扁平苔癬，為研究白芍分子作用機制和口腔扁平苔癬發(fā)病機制提供了方向。