王 超，張 咪，趙麗萍，范春雷

(浙江中醫(yī)藥大學生命科學學院，浙江 杭州 310053)

動脈粥樣硬化是由多種因素引起的慢性炎癥性疾病，同時也是冠心病、腦卒中、外周血管病等疾病的主要病理基礎[1]。動脈粥樣硬化的中醫(yī)臨床表現(xiàn)包含“中風”“眩暈”“健忘”“胸痹”等，從整體觀進行辨證論治認為是本虛標實之癥，本虛指氣血陰陽的虧虛，標實指瘀、痰、熱、毒等[2]。以本虛標實為病機，中醫(yī)多采用祛瘀化痰、清熱解毒、益氣固本等治療方法，安全性較高。

黃芪為豆科植物蒙古黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bge.var.mongholicus (Bge.) Hsiao或膜莢黃芪A.membranaceus(Fisch.) Bge.的干燥根，具有益氣升陽、利水消腫、固表止汗等功效，主要活性成分包括黃芪多糖、黃酮類、皂苷類以及生物堿類等，臨床上常用于冠狀動脈粥樣硬化、病毒性心肌炎、肝炎、糖尿病等疾病的治療[3]。研究表明,黃芪具有擴張血管、抗炎、抗腫瘤、增強機體免疫的作用，也常用于動脈粥樣硬化患者的治療[4]。

由于中藥具有多成分、多靶點及多途徑的特點，黃芪的活性成分抗動脈粥樣硬化的作用機制尚不明確，而網(wǎng)絡藥理學能從構(gòu)建“藥物-靶點-疾病”關(guān)系網(wǎng)絡的角度為中藥分子作用機制的研究提供科學的方法。本研究利用網(wǎng)絡藥理學的方法，篩選出黃芪治療動脈粥樣硬化的潛在藥效成分與作用靶點，并通過體外實驗進行初步驗證，以期為黃芪治療動脈粥樣硬化的基礎研究與臨床應用提供理論基礎。

1 材料

1.1 細胞株 人臍靜脈內(nèi)皮細胞系(HUVECs)，購于中國科學院上海生科院細胞資源中心。

1.2 試劑與藥物 黃芪提取物(中藥黃芪購自浙江中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院并經(jīng)鑒定為正品，取200 g黃芪加水浸泡2 h，加熱煮沸，過濾收集藥液，再將殘余藥渣重新提取，合并2次濾液，通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮藥液至含生藥量1 g/L)。DMEM高糖培養(yǎng)基(美國Gibco公司，批號8117033)；胎牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所，批號19110503)；胰蛋白酶(浙江吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司，批號2019092902)；四甲基偶氮唑藍(MTT)(美國Ameresco公司，批號3068B512)；二甲基亞砜(上海源葉生物科技有限公司，批號20170204)；過氧化氫(美國Sigma公司，批號MKBN5879V)；細胞凋亡檢測試劑盒(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，批號20170409)；活性氧(ROS)、超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號20180402、20180403)；高靈敏度化學檢測試劑盒、Trizon Reagen、UltraSYBR Mixture(High ROX)、RIPA裂解液(強)、去基因組cDNA第一鏈合成試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒(江蘇康為世紀生物科技有限公司，批號30338、03878、40327、20152、01410、30334)；引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；Bax、Bcl-2、IL-1β、TNF-ɑ、p38 MAPK、p-p38 MAPK單克隆抗體(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，批號201709、201710、201803、201805、201802、201804)；β-actin抗體、羊抗兔二抗、羊抗鼠二抗(杭州達文生物有限公司，批號Q17892，J805472713、SG081018A)。

1.3 儀器 二氧化碳細胞培養(yǎng)箱(美國Thermo Fisher Scientific公司)；Guava EasyCyte 8型微流式細胞分析儀(美國EMD Millipore公司)；Q5000超微量紫外可見分光光度計(美國Quawell公司)；Nikon研究級倒置生物顯微鏡Ti-S(日本Nikon公司)；ABI實時熒光定量PCR儀(美國Applied Biosystems公司)；低溫高速離心機(德國Eppendorf公司)；酶標儀(美國Molecular Devices公司)；凝膠發(fā)光化學成像系統(tǒng)(上海勤翔科學儀器有限公司)。

2 資料與方法

2.1 黃芪有效成分的篩選 使用中藥系統(tǒng)藥理學平臺(TCMSP，http://ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php)，以“huangqi”為關(guān)鍵詞進行檢索，篩選出黃芪化合物中符合口服生物利用度(OB)≥30%和生物活性分子的類藥性(DL)≥0.18的化合物作為活性成分，并且根據(jù)相關(guān)文獻報道進行補充。之后再檢索出黃芪各個活性成分所相關(guān)的靶點，通過Uniprot數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)查找其靶點對應的基因信息，并將其導出歸納整理。

2.2 疾病靶點篩選 通過OMIM數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim)和GeneCards數(shù)據(jù)庫(http://www.genecards.org/)以“atherosclerosis”作為關(guān)鍵詞進行檢索并去除假陽性與重復基因后導出結(jié)果。再將獲得的基因與黃芪潛在活性成分作用的基因通過Venny 2.1(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)進行比對取交集，并將相關(guān)結(jié)果導出。

2.3 藥物-疾病網(wǎng)絡模型的構(gòu)建與分析 將黃芪的活性成分和動脈粥樣硬化交集靶點等相關(guān)信息導入Cytoscape 3.7.1軟件，構(gòu)建黃芪-活性成分-動脈粥樣硬化-作用靶點網(wǎng)絡。通過String數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)分析動脈粥樣硬化和黃芪活性成分之間的相互作用關(guān)系，設置最高置信度，標準為confidence>0.9，物種設置為“Homosapiens”，以網(wǎng)絡中的各靶基因的“節(jié)點連接度(Degree)”為指標，通過 Degree的測算篩選出網(wǎng)絡中的核心蛋白質(zhì)靶標，從而獲得蛋白質(zhì)相互作用的關(guān)系。

2.4 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析 通過DAVID數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)對篩選出的核心靶點進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。將之前篩選出來的黃芪治療動脈粥樣硬化的靶點導入DAVID數(shù)據(jù)庫之中，設定物種為“HomoSapiens”，將基因的名稱核對為官方的名稱，閾值設置為P<0.05后，進行GO生物學過程富集分析和KEGG代謝通路富集分析，并將前20個富集結(jié)果進行可視化。

2.5 細胞培養(yǎng)與增殖能力的檢測 將復蘇后的HUVECs細胞置于含10%胎牛血清的DEME培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待細胞狀態(tài)穩(wěn)定后進行分組，設置正常組、模型組、加藥組。將對數(shù)生長期的細胞以1×106/mL的密度接種于96孔板中，用不同濃度H2O2(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mmol/L)進行處理。通過MTT檢測H2O2對HUVECs細胞增殖的影響；并且用不同劑量黃芪提取物(5、10、15、20、25、30、35、40、45、50 mg/L)對H2O2損傷后的HUVECs細胞進行處理，再通過MTT法檢測黃芪提取物對受氧化應激損傷的HUVECs細胞增殖的影響。

2.6 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 取1×106個對數(shù)生長期的HUVECs細胞接種于6孔板中，分為空白組(不作處理)、模型組(0.9 mmol/L H2O2處理)、加藥組(0.9 mmol/L H2O2處理后，再用30 mg/L黃芪提取物處理)。培養(yǎng)48 h后收集細胞，經(jīng)PBS重懸后加入5 μL AnnexinⅤ-FITC和5 μL PI，室溫避光孵育20 min，通過流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

2.7 細胞中ROS水平及SOD活性的檢測 從6孔板中收集各組正常培養(yǎng)的細胞，棄去原培養(yǎng)液，用無血清培養(yǎng)基洗滌3次后，各孔加入2 mL無血清培養(yǎng)基和20 μmol/L DCFH-DA，37 ℃避光孵育30 min后 PBS洗3遍，通過酶標儀檢測各組細胞熒光的強弱，激發(fā)波長為488 nm，發(fā)射波長為525 nm，并在熒光共聚焦顯微鏡上，實時檢測熒光強弱并拍照。根據(jù)試劑盒說明書操作步驟檢測細胞中SOD活性。

2.8 RT-qPCR法檢測相關(guān)基因表達 取處于對數(shù)生長期的各組細胞，消化細胞并收集，用Trizol法提取細胞的總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，進行熒光定量PCR檢測。以β-actin作為內(nèi)參基因，引物序列見表1。

表1 引物序列

2.9 Western blot檢測相關(guān)蛋白表達 離心收集各組細胞后加入細胞裂解液提取蛋白，并通過BCA法對蛋白進行定量，制備樣品。將樣品進行聚丙烯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，使用相關(guān)抗體進行Western blot檢測，通過凝膠成像儀進行顯影觀察。

3 結(jié)果

3.1 黃芪活性成分及作用靶點的篩選 以“huangqi”為檢索詞通過TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索總共檢索到87種化合物。以OB≥30%、DL≥0.18作為化合物篩選條件，共篩選得到20種化合物，之后通過文獻補充黃芪皂苷類成分2種，所得數(shù)量占所有總化合物的25.29%，見表2。

表2 黃芪潛在有效成分的基本信息

3.2 疾病相關(guān)靶點及黃芪治療動脈粥樣硬化潛在靶點篩選結(jié)果 動脈粥樣硬化的相關(guān)靶點基因在GeneCards數(shù)據(jù)庫與OMIM數(shù)據(jù)庫中進行檢索，共得到3 736個靶點基因，將上述篩選出來的黃芪中具有潛在作用的靶點基因和動脈粥樣硬化靶點基因進行匹配并在線繪制韋恩圖(圖1)，獲得共同靶點基因76個，見表3。

圖1 黃芪潛在活性成分與動脈粥樣硬化相關(guān)靶點韋恩圖

3.3 黃芪-活性成分-靶點-疾病網(wǎng)絡與PPI的構(gòu)建與分析 通過Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建黃芪-活性成分-動脈粥樣硬化-靶點網(wǎng)絡，結(jié)果顯示，該網(wǎng)絡由94個節(jié)點組成，其中活性成分節(jié)點16個，基因節(jié)點76個，疾病節(jié)點1個，藥物節(jié)點1個，具有138條邊(圖2)。其中紅色節(jié)點代表疾?。凰{色節(jié)點代表藥物；紫色節(jié)點代表藥物成分；綠色節(jié)點代表關(guān)鍵作用靶點。將黃芪-動脈粥樣硬化共有的76個靶點基因?qū)隨tring數(shù)據(jù)庫平臺，獲得蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系網(wǎng)絡圖(圖3)，其中關(guān)聯(lián)度值最高的前5個節(jié)點依次為IL6、CASP3、VEGFA、MAPK8、EGFR(圖4)，表明了這些基因可能是黃芪治療動脈粥樣硬化的潛在靶點。

3.3.1 GO功能富集分析 將黃芪-動脈粥樣硬化共同靶點導入DAVID數(shù)據(jù)庫中進行GO富集分析共得到96個條目，其中DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活因子活性、RNA聚合酶Ⅱ特異性涉及15個靶標；近端啟動子序列特異性DNA結(jié)合涉及15個靶標；RNA聚合酶Ⅱ近端啟動子序列特異性DNA結(jié)合涉及14個靶標，此外還與蛋白質(zhì)異二聚化活性、染色質(zhì)結(jié)合、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合、核受體活性等功能相關(guān)，見圖5(展示了前20位的GO分析結(jié)果)。

表3 黃芪抗動脈粥樣硬化的潛在靶點

圖2 黃芩“活性成分-靶點”網(wǎng)絡圖

圖3 黃芪與動脈粥樣硬化蛋白質(zhì)相互作用核心網(wǎng)絡圖

圖4 黃芪治療動脈粥樣硬化的核心靶點

3.3.2 KEGG通路富集分析 黃芪抗動脈粥樣硬化的KEGG富集分析結(jié)果顯示靶點被富集在62條通路上，其中包括MAPK通路、PI3K/Akt通路、細胞凋亡通路、AGE-RAGE通路等，見圖6(展示了前20位的KEGG分析結(jié)果)。參與MAPK信號通路的核心靶點有RELA、IKBKB、CASP3、MAPK8、EGFR、VEGFA、FOS、ELK1、RAF1、PRKCA、ERBB2、MYC、HSPB1、IGF2、RASA1，是含有核心靶點最多的信號通路，見圖7。

3.4 黃芪提取物對H2O2誘導的HUVECs細胞增殖的影響 如圖8A所示，當細胞經(jīng)0～1 mmol/L濃度的H2O2處理后，細胞存活率隨著H2O2濃度升高而逐漸下降，當H2O2濃度為0.9 mmol/L，細胞存活率為62.5%；H2O2濃度為1 mmol/L時，細胞存活率低于40%，不利于后續(xù)的實驗，所以選擇濃度為0.9 mmol/L的H2O2處理做為造模條件。如圖8B所示，黃芪提取物在0～30 mg/L的劑量范圍內(nèi)，隨著黃芪提取物劑量的升高細胞增殖率也升高，在30 mg/L時細胞增殖率最高；但當劑量超過30 mg/L時，增殖能力開始逐漸下降，當劑量達到50 mg/L時，細胞的增殖已無明顯變化，故選用30 mg/L的黃芪提取物進行后續(xù)的研究。

圖5 黃芪-動脈粥樣硬化關(guān)鍵靶點的GO生物學過程富集分析

圖6 黃芪-動脈粥樣硬化關(guān)鍵靶點的KEGG代謝通路富集分析

圖7 MAPK信號通路

圖8 黃芪提取物對HUVECs細胞的影響

3.5 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率 如圖9所示，與空白組比較，模型組HUVECs細胞的凋亡率升高(P<0.01)；與模型組比較，加藥組細胞凋亡率降低(P<0.01)。

注：與空白組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01。圖9 各組細胞凋亡率

注：與空白組比較，*P<0.05，與模型組比較，#P<0.05。圖10 各組細胞中ROS水平

3.6 黃芪提取物對H2O2誘導的HUVECs細胞中ROS水平及SOD活性的影響 如圖10所示，與空白組比較，模型組細胞熒光強度增強，表明細胞中ROS水平升高(P<0.05)；與模型組比較，加藥組細胞熒光強度減弱，表明加藥組ROS水平受到抑制(P<0.05)。如圖11所示，與空白組比較，模型組細胞中SOD活性降低(P<0.05)；與模型組比較，加藥組細胞SOD活性升高(P<0.05)。

注：與空白組比較，*P<0.05，與模型組比較，#P<0.05。圖11 各組細胞中SOD活性

3.7 黃芪提取物對H2O2誘導的HUVECs細胞中p38MAPK、IL-1β、TNF-αmRNA表達的影響 與空白組比較，模型組細胞p38MAPK、IL-1β、TNF-αmRNA表達均升高(P<0.05)；與模型組比較，加藥組細胞p38MAPK、IL-1β、TNF-αmRNA表達均降低(P<0.01)，見圖12。

注：與空白組比較，*P<0.05,與模型組比較，##P<0.01。圖12 各組細胞中p38 MAPK、IL-1β、TNF-ɑ mRNA表達

3.8 黃芪提取物對H2O2誘導的HUVECs細胞中p38-MAPK、IL-1β、TNF-ɑ蛋白表達的影響 如圖13所示，與空白組比較，模型組細胞中Bcl-2蛋白表達降低(P<0.05)，而Bax、IL-1β、TNF-ɑ、p38 MAPK和p-p38 MAPK蛋白表達均升高(P<0.05)；與模型組比較較，加藥組細胞中Bcl-2蛋白表達升高(P<0.01)，IL-1β、Bax、TNF-ɑ、p38 MAPK和p-p38 MAPK蛋白表達均降低(P<0.01)。

注：與空白組比較，*P<0.05，與模型組比較，##P<0.01。圖13 各組細胞中p38-MAPK、IL-1β和TNF-ɑ蛋白表達

4 討論

動脈粥樣硬化作為心腦血管疾病的重要病理基礎，其發(fā)生發(fā)展過程始終是基礎和臨床研究的重點，目前的研究認為動脈粥樣硬化與內(nèi)皮細胞損傷、脂質(zhì)紊亂、免疫應答和與其相關(guān)的慢性炎癥有緊密的聯(lián)系[5]。中醫(yī)對動脈粥樣硬化的認識多為本虛標實之癥，提出的血瘀、熱毒和痰濁等病理因素與血栓形成、炎癥以及脂質(zhì)浸潤等學說一一對應，因此通過活血化瘀、化痰以及清熱解毒等方法來抑制血栓形成、調(diào)節(jié)血脂以及抗炎[6]。黃芪的藥效甚多，常用于不同的疾病治療中，但其根本還是“益氣”的功效，因此黃芪常被用于治療動脈粥樣硬化性疾病。由于中藥的活性成分眾多、作用靶點與機制尚不完全明確，缺乏系統(tǒng)性和嚴謹性的研究，隨著系統(tǒng)生物學的發(fā)展，基于大數(shù)據(jù)的網(wǎng)絡藥理學已成為分析中藥復雜成分作用機制的重要方法[7]。

本研究利用網(wǎng)絡藥理學方法篩選出了黃芪的22種潛在活性成分，并與動脈粥樣硬化相關(guān)靶點進行比對，得到了76個共有的靶點基因，結(jié)果表明IL-6、CASP3、VEGFA、MAPK8、EGFR等基因可能是黃芪抗動脈粥樣硬化的主要作用靶點。已有相關(guān)文獻表明，IL-6作為炎癥細胞因子參與機體的炎癥反應，其水平升高可促進血管內(nèi)皮細胞及平滑肌細胞發(fā)生變性、壞死進而導致動脈粥樣硬化形成、粥樣斑塊破裂甚至血栓形成[8]；CASP3在細胞凋亡過程中起重要作用，當細胞的線粒體膜受到損傷，細胞色素會釋放到細胞外進而激活CASP3誘導細胞凋亡[9]；VEGFA與EGFR對于血管中內(nèi)皮細胞的增殖、遷移及分化等具有重要作用[10]；MAPK8參與細胞增殖、凋亡、應激以及炎癥反應等過程[11]。由此推測，黃芪抗動脈粥樣硬化的作用機制與細胞凋亡過程相關(guān)。GO功能富集分析結(jié)果顯示黃芪與動脈粥樣硬化的作用機制涉及多種代謝過程和細胞進程，多種生物分子參與其中共同調(diào)控復雜的代謝網(wǎng)絡，體現(xiàn)出中藥多種成分通過多種途徑作用于多靶點的特點。通過KEGG通路富集結(jié)果可知，MAPK、PI3K/Akt、細胞凋亡等通路是黃芪抗動脈粥樣硬化的重要途徑，特別是MAPK通路與黃芪擁有最多的共同靶點，它能將細胞外的信號與細胞及細胞核之間的反應信息進行傳遞，從而參與到細胞的增殖、分化、凋亡以及自噬等生物過程，同時也參與了炎癥、腫瘤等疾病的發(fā)生[12]，因此本研究以MAPK通路作為目標驗證其與黃芪提取物的相互作用，從而分析網(wǎng)絡藥理學結(jié)果的可行性。

研究表明，內(nèi)皮細胞的損傷和功能失調(diào)常為動脈粥樣硬化發(fā)生的最初環(huán)節(jié)，之后損傷組織會釋放炎癥介質(zhì)和凝血酶因子等作用于炎癥細胞產(chǎn)生炎癥反應并激活纖維蛋白原與血小板，進而產(chǎn)生血栓炎癥反應[13]。p38 MAPK作為MAPK家族中極為重要的一部分，主要參與炎癥調(diào)控的過程[14]，并且與氧化損傷過程具有緊密聯(lián)系。本實驗以0.9 mmol/L濃度的H2O2處理細胞來建立氧化損傷模型從而模擬動脈粥樣硬化的最初發(fā)生進程，并使用黃芪提取物進行干預。結(jié)果顯示黃芪提取物處理后的細胞ROS水平降低，SOD活性升高，細胞凋亡率也降低，說明黃芪提取物具有抗氧化的作用，同時能夠抑制氧化損傷細胞的凋亡水平。RT-qPCR和Western blot實驗結(jié)果表明，與模型組比較，黃芪提取物處理后的細胞中p38 MAPK、p-p38 MAPK、IL-1β、TNF-α mRNA和蛋白表達均降低，說明黃芪提取物能夠作用p38 MAPK途徑并且調(diào)控相關(guān)基因的表達，明確黃芪提取物參與了炎癥的進程，有利于后續(xù)更加深入的研究。Bao等[15]研究結(jié)果表明p38 MAPK被激活后能夠通過磷酸化或促進炎癥因子(如TNF-α、IL-1)活化NF-κB，而NF-κB被激活后也可以通過其產(chǎn)物反過來激活自身和p38 MAPK表達，形成復雜的相互激活網(wǎng)絡，從而參與動脈粥樣硬化的進程。這與本研究結(jié)果一致，說明黃芪提取物可能通過抑制p38 MAPK/ TNF-α/IL-1途徑相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄與蛋白表達來調(diào)控炎癥反應過程，進而影響動脈粥樣硬化的發(fā)生與發(fā)展。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡藥理學對黃芪治療動脈粥樣硬化的藥效成分、作用靶點及通路進行了分析，預測了黃芪抗動脈粥樣硬化的基因靶點與作用通路，并通過細胞實驗初步證實了黃芪提取物通過MAPK通路抑制受氧化應激損傷細胞的凋亡、降低細胞中的ROS水平以及下調(diào)炎癥因子的表達，進而影響動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。實驗結(jié)果顯示了黃芪可以通過多成分、多靶點、多通路抗動脈粥樣硬化的特點，初步驗證的結(jié)果則表明了網(wǎng)絡藥理預測的可行性，為黃芪抗動脈粥樣硬化的深入研究提供依據(jù)。