袁桃花，黃雨霄，殷智鑫，石 雪，胡 盼，孫見(jiàn)飛，劉 華，徐 紅，吳 寧*

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.貴州醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025；3.貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025)

慢性支氣管炎是一種常見(jiàn)的慢性呼吸系統(tǒng)疾病，臨床多以反復(fù)的咳嗽、咳痰或伴喘息的慢性病程為特征[1-2]，常用抗生素、氣管舒張藥物等西藥進(jìn)行治療，起效快且療效明顯，但慢性支氣管炎病程長(zhǎng)且易復(fù)發(fā)，長(zhǎng)期服用，副作用較大[3]。中草藥有整體調(diào)節(jié)、多途徑、多環(huán)節(jié)的特點(diǎn)，療效持久，短期內(nèi)病癥復(fù)發(fā)現(xiàn)象少，毒副作用小，可長(zhǎng)期堅(jiān)持服用，使其在治療慢性支氣管炎方面顯示出明顯優(yōu)勢(shì)[4]。桿努盡煙(苗藥名Cherh nex jenl vieeb)是貴州凱里苗族地區(qū)治療慢性支氣管炎的特色藥方，藥源豐富、應(yīng)用范圍廣、歷史長(zhǎng)、療效顯著，但其作用機(jī)制尚不明確，仍處于經(jīng)驗(yàn)用藥階段[5-6]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的整體性和系統(tǒng)性與中草藥特征不謀而合，為中藥方劑潛在活性成分與作用靶點(diǎn)的深入研究開(kāi)辟新手段[7-8]。因此，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，獲得桿努盡煙治療慢性支氣管炎的主要活性成分、關(guān)鍵靶標(biāo)及信號(hào)通路，并構(gòu)建慢性支氣管炎大鼠模型，對(duì)篩選出的關(guān)鍵通路中重要靶點(diǎn)進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，探究苗藥桿努盡煙治療慢性支氣管炎的分子機(jī)制，為深入研究桿努盡煙治療慢性支氣管炎的作用機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)SD大鼠30只，雄性，體質(zhì)量(200±20)g，購(gòu)自重慶騰鑫生物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXF(黔)2018-0001。

1.2 試劑與藥物 貴煙黃果樹(shù)藍(lán)佳品(焦油量10 mg，煙氣煙堿量0.9 mg，一氧化碳量12 mg，貴陽(yáng)卷煙廠)；桿努盡煙全草采自貴州省凱里市爐山鎮(zhèn)，經(jīng)貴陽(yáng)中醫(yī)藥大學(xué)潘爐臺(tái)教授鑒定為吊石苣苔屬植物吊石苣苔LysionotuspauciflorusMaxim.。桂龍咳喘寧膠囊(大連天山藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z20050149)。TNF-α酶聯(lián)免疫試劑盒(批號(hào)A38281155)、NF-κB p65兔抗大鼠一抗(批號(hào)3560144117)、qPCR反應(yīng)試劑盒(批號(hào)Q311-02，南京諾唯贊生物科技股份有限公司)。

1.3 儀器 SynGeneTM凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Synoptics公司)；ABI StepOnePlusTM實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)Thermo公司)。

2 方法

2.1 桿努盡煙潛在活性成分篩選 通過(guò)TCMSP(http://tcmspw.com/tcmsp.php)及化學(xué)專業(yè)數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.organchem.csdb.cn/scdb/default.htm?nCount=13303008)發(fā)掘桿努盡煙的化學(xué)成分，文獻(xiàn)資料進(jìn)行補(bǔ)充，根據(jù)成分的吸收(Absorption)、分布(Distribution)、代謝(Metabolism)及排泄(Excretion)，即ADME參數(shù)篩選有效成分[7]，篩選條件為藥物口服生物利用度(OB)≥30%，藥物相似性(DL)≥0.18，結(jié)合文獻(xiàn)資料保留對(duì)慢性支氣管炎有效、活性大的成分[5]，利用PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/#query=Nevadensia)對(duì)篩選出的藥物活性成分的SMILES化學(xué)式進(jìn)行補(bǔ)充。

2.2 活性成分潛在靶點(diǎn)預(yù)測(cè)與篩選 采用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)篩選桿努盡煙有效成分作用靶點(diǎn)，通過(guò)SwissTargetPredicition數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.swisstargetprediction.ch/)補(bǔ)充空缺成分靶點(diǎn)，并輸入U(xiǎn)niProt數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.uniprot.org/)，限定物種為人，將名稱校正，獲取UniProt號(hào)。

2.3 “桿努盡煙活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將活性成分與靶點(diǎn)整理后導(dǎo)入Cytoscape 3.6.1軟件，構(gòu)建“桿努盡煙活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖。

2.4 慢性支氣管炎靶點(diǎn)檢索 以“Chronic bronchitis”為關(guān)鍵詞，通過(guò)TTD數(shù)據(jù)庫(kù)(http://db.idrblab.net/ttd/)、Durgbank數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.drugbank.ca/)、DisGeNT數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.disgenet.org/)檢索慢性支氣管炎靶點(diǎn)，取交集并去重，獲得UniProt號(hào)。

2.5 桿努盡煙活性成分治療慢性支氣管炎作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 利用藥物靶點(diǎn)和慢性支氣管炎靶點(diǎn)，通過(guò)VENNY 2.1軟件繪制Venn圖，將圖中交集靶點(diǎn)輸入String Version 10.5數(shù)據(jù)庫(kù)(https://string-db.org/)，限定物種為人，并隱藏出現(xiàn)的游離蛋白，獲得桿努盡煙-慢性支氣管炎蛋白互作(PPI)網(wǎng)絡(luò)圖，并利用Cytoscape Version 3.6.1軟件進(jìn)行可視化分析。

2.6 分子對(duì)接 利用sybyl-x 2.0進(jìn)行配體分子的前處理，小分子加Gasteiger-Huckel電荷，設(shè)置最大優(yōu)化步數(shù)10 000，初始優(yōu)化的能量梯度收斂條件0.005 kcal/(mol*A)，能量?jī)?yōu)化算法為Powell，其他值為系統(tǒng)默認(rèn)。靶標(biāo)蛋白前處理在sybyl-x2.0中進(jìn)行：蛋白質(zhì)分子全部除去晶體水、加氫并除去占據(jù)結(jié)合位點(diǎn)的共結(jié)晶配體分子，補(bǔ)上缺失氨基酸殘基及末端殘基，設(shè)定氨基酸質(zhì)子化狀態(tài)，賦予力場(chǎng)為AMBER7 FF99，Kollman電荷。利用AutoDockTools(ADT)生成對(duì)接所需的pdbqt文件，最后用AutoDock-vina軟件計(jì)算得到九個(gè)優(yōu)勢(shì)結(jié)合構(gòu)象，以打分最高(結(jié)合能力最強(qiáng)的構(gòu)象)記錄各配體分子與靶標(biāo)間的結(jié)合能大小[9]。

2.7 關(guān)鍵靶點(diǎn)的富集分析 用DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//www.david.niaid.nih.gov)對(duì)上述關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集和KEGG通路分析，其中GO注釋包括生物學(xué)過(guò)程(BP)、細(xì)胞組成(CC)和分子功能(MF) 模塊，KEGG通路篩選以P<0.05作為顯著性強(qiáng)的臨界篩選，以Count值降序排列，列出桿努盡煙活性成分治療慢性支氣管炎的前15位關(guān)鍵通路。

2.8 分組與造模 SD大鼠分為正常對(duì)照組，模型組，桿努盡煙高、低劑量組，陽(yáng)性藥物組(桂龍咳喘寧)，每組6只。將正常對(duì)照組置于無(wú)煙環(huán)境中飼養(yǎng)，其余各組均采用煙熏聯(lián)合脂多糖氣管注射法復(fù)制慢性支氣管炎大鼠模型[10]。制備被動(dòng)吸煙箱(55 cm×45 cm×35 cm，上壁留有通氣孔)。第1天和第14天以8%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射麻醉大鼠后，氣道內(nèi)注射200 mg/mL脂多糖溶液0.2 mL，手術(shù)當(dāng)天不作煙熏，其余時(shí)間各組大鼠每次用4只香煙煙熏，每天2次，每次30 min。造模28 d后，每組隨機(jī)取1只大鼠，用4%多聚甲醛灌注處理，取左肺上葉制作HE切片，鏡下觀察大鼠肺組織病理改變，驗(yàn)證造模成功。

2.9 桿努盡煙水提液制備 取2 kg桿努盡煙，蒸餾水浸泡，于90 ℃電熱恒溫水箱中連續(xù)浸提12 h，收集并過(guò)濾浸提液；合并浸提液，濃縮至生藥量為2.5 kg/L，分裝滅菌，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.10 給藥 造模結(jié)束后第2天開(kāi)始給藥，桿努盡煙高、低劑量組大鼠分別灌胃給予桿努盡煙水提液8、2 g/kg(按生藥量計(jì))，陽(yáng)性藥物組灌胃給予桂龍咳喘寧1 g/kg，正常對(duì)照組及模型組灌胃給予等量生理鹽水，每天1次，連續(xù)給藥28 d。

2.11 肺組織采集 麻醉大鼠，心臟取血，打開(kāi)胸腔，取下肺組織，將左肺上葉固定于4%多聚甲醛中，用于制作HE切片；另取右肺經(jīng)RNA保存液處理后置于-80 ℃冰箱保存，用于后續(xù)指標(biāo)的檢測(cè)。

2.12 病理組織切片制作 操作流程為常規(guī)脫蠟→染色→水洗→分化→漂洗→脫水Ⅰ→復(fù)染→脫水Ⅱ→烤片→中性樹(shù)膠封片→顯微鏡下觀察支氣管及肺組織病理形態(tài)學(xué)變化。

2.13 ELISA法檢測(cè)肺組織中TNF-α水平 取50 mg肺組織，置于研缽中，用眼科剪快速剪碎組織塊，加入PBS，充分研磨，4 ℃、5 000 r/min離心10 min，取上清液，根據(jù)ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，檢測(cè)細(xì)胞因子TNF-α水平。

2.14 RT-qPCR檢測(cè)肺組織NF-κBmRNA表達(dá) Trizol法提取大鼠肺組織勻漿總RNA，取1 μg RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，按說(shuō)明書(shū)合成cDNA。內(nèi)參照GADPH、NF-κB引物序列見(jiàn)表1。按qPCR反應(yīng)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為預(yù)變性95 ℃ 5min；循環(huán)反應(yīng)為95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；熔解曲線為95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s，采用2-△△CT法進(jìn)行相對(duì)定量分析，以GAPDH為內(nèi)參。

表1 引物序列

2.15 Western blot檢測(cè)NF-κB蛋白表達(dá) 實(shí)驗(yàn)操作步驟依次為提取蛋白→BCA法進(jìn)行蛋白濃度定量→蛋白變性→SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)膜→5%脫脂奶粉封閉→加入一抗，4 ℃過(guò)夜→TBST洗膜3次→加入二抗，室溫下振蕩2 h→洗滌后將PVDF膜置于ECL混合液中→應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)對(duì)掃描圖像的目的條帶→進(jìn)行灰度分析。

3 結(jié)果

3.1 桿努盡煙潛在活性成分篩選結(jié)果 去除重復(fù)成分后，共得到8種，同時(shí)滿足OB≥30%和DL≥0.18或結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道對(duì)慢性支氣管炎有效且滿足其中1個(gè)條件的桿努盡煙活性成分共5種，見(jiàn)表2。

表2 桿努盡煙潛在化學(xué)成分

3.2 繪制“桿努盡煙活性成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖 共獲得5種活性成分靶點(diǎn)514個(gè)，刪除重復(fù)并去除假陽(yáng)性項(xiàng)，整合得到苗藥桿努盡煙作用靶點(diǎn)共340個(gè)?！皸U努盡煙活性成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖(圖1)顯示，5種關(guān)鍵成分共同作用的靶點(diǎn)有8個(gè)，包括11號(hào)染色體的基因(BACE1)、誘導(dǎo)型—氧化氮合酶(NOS2)、蛋白酪氨酸磷酸酶—非受體1型(PTPN1)、花生四烯5-脂氧合酶基因(ALOX5)、雌激素受體2(ESR2)等，其中ALOX5、PTPN1等能介導(dǎo)慢性支氣管炎炎癥反應(yīng)，提示這些靶點(diǎn)可能是桿努盡煙的作用于慢性支氣管炎的靶點(diǎn)。

注：LPM-1～LPM-5分別為1-(4-羥基-3-甲氧苯基)乙酮、3-(4-羥基-3-甲氧苯基)敗脂酸、β-谷甾醇、石吊蘭素、熊果酸。菱形代表?xiàng)U努盡煙成分，橢圓形代表靶點(diǎn)；自由度越大，顏色越深。圖1 “桿努盡煙活性成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖

3.3 桿努盡煙活性成分治療慢性支氣管炎作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 檢索整合得到的慢性支氣管炎靶點(diǎn)共103個(gè)，將其與桿努盡煙活性成分作用靶點(diǎn)進(jìn)行基因映射，共得潛在作用靶點(diǎn)23個(gè)，見(jiàn)圖2。

圖2 “桿努盡煙-慢性支氣管炎”基因映Venn圖

3.4 桿努盡煙-慢性支氣管炎蛋白互作(PPI)網(wǎng)絡(luò)分析 桿努盡煙-慢性支氣管炎蛋白互作(PPI)網(wǎng)絡(luò)圖中(圖3A)，去除2個(gè)游離蛋白，該圖包括23個(gè)節(jié)點(diǎn)，55條邊，平均自由度為4.78，其中互作蛋白評(píng)分≥0.9的包括NR3C2-NR3C1、CYP1B1-ADORA1、NR3C2-PGR、CHRM2-ADORA3等。利用Cytoscape Version 3.6.1軟件對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行可視化，得到桿努盡煙-慢性支氣管炎蛋白互作(PPI)網(wǎng)絡(luò)圖(圖3B)，該圖包括21個(gè)節(jié)點(diǎn)，平均自由度為5.24，得到自由度大于平均自由度的的靶點(diǎn)共7個(gè)，按自由度從高到低排序依次為ALB、CYP1A1、CYP1B1、ADORA1、PGR、NR3C1、GSTP1、CYP1A2，見(jiàn)表3。

圖3 桿努盡煙-慢性支氣管炎蛋白互作(PPI)網(wǎng)絡(luò)圖

表3 PPI網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)及其拓?fù)鋮?shù)

3.5 桿努盡煙-慢性支氣管炎靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖 桿努盡煙-慢性支氣管炎靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖(圖4)中包含節(jié)點(diǎn)74個(gè)，靶標(biāo)37個(gè)，其中ALOX5、多藥耐藥性蛋白(ABCB1)靶點(diǎn)的介數(shù)較大，被預(yù)測(cè)為桿努盡煙治療慢性支氣管炎的靶點(diǎn)，其次是腺苷受體A3(ADORA3)、核受體亞家族3C組成員1/2(NR3C1/2)、膽堿能受體毒蕈堿2(CHRM2)、絲氨酸蛋白酶抑制劑家族成員6(SERPINA6)、聚腺苷二磷酸核糖聚合酶1(PARP1)、細(xì)胞色素P450家族1亞家族B成員1(CYP1B1)等發(fā)揮治療慢性支氣管炎的可能性較大。

圖4 桿努盡煙-慢性支氣管炎靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

3.6 分子對(duì)接分析 利用AutoDock-vina軟件對(duì)桿努盡煙的5種主要活性成分與篩選出的關(guān)鍵靶點(diǎn)(ALOX5、CYP1A1、CYP1B1、TNF-α、NF-κB、ADORA1)進(jìn)行分子對(duì)接，對(duì)接模式見(jiàn)圖5，對(duì)接親合能量值見(jiàn)表4。桿努盡煙的成分中熊果酸、β谷甾醇、石吊蘭素分別與TNF-α和NF-κB親和能量值低，其中熊果酸親和力最強(qiáng)。3-(4-羥基-3-甲氧苯基)敗脂酸、1-(4-羥基-3-甲氧苯基)乙酮與ALOX5親合力較強(qiáng)，3-(4-羥基-3-甲氧苯基)敗脂酸親和力較強(qiáng)。石吊蘭素、3-(4-羥基-3-甲氧苯基)敗脂酸、1-(4-羥基-3-甲氧苯基)乙酮與CYP1A1和CYP1B1的親和能低，其中石吊蘭素親和力最強(qiáng)。β谷甾醇、熊果酸、石吊蘭素與ADORA1親合能低，β谷甾醇親和力最強(qiáng)。從以上結(jié)果可知，CYP1A1、CYP1B1、ADORA1、TNF-α、NF-κB可能為桿努盡煙治療慢性支氣管炎的主要靶點(diǎn)。

注：A～E分別為TNF-α與熊果酸、NF-κB與熊果酸、ALOX5與3-(4-羥基-3-甲氧苯基)敗脂酸、CYP1A1與石吊蘭素、CYP1B1與石吊蘭素、ADORA1與β谷甾醇。圖5 主要化合物與靶點(diǎn)最優(yōu)結(jié)合模式圖

3.7 關(guān)鍵靶點(diǎn)的富集分析 采用DAVID軟件篩選“桿努盡煙”治療慢性支氣管炎的潛在生物效應(yīng)，根據(jù)設(shè)置閾值P<0.05篩選GO生物過(guò)程和KEGG通路。GO富集分析中，主要生物過(guò)程包括腺苷受體信號(hào)通路、嘌呤核苷酸分解過(guò)程等；細(xì)胞成分主要涉及細(xì)胞液，細(xì)胞連接，細(xì)胞內(nèi)膜上細(xì)胞器等；分子功能主要涉及G蛋白偶聯(lián)腺苷受體活性、嘌呤核苷酸分解過(guò)程。KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，靶點(diǎn)通路主要包括核受體轉(zhuǎn)錄途徑、色氨酸代謝、細(xì)胞色素P450對(duì)異生物質(zhì)的代謝、花生四烯酸代謝、cAMP信號(hào)通路等(圖6～7)，這些通路直接或間接介導(dǎo)參與慢性支氣管炎的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。結(jié)果表明，桿努盡煙主要化學(xué)成分的作用靶點(diǎn)涉及多樣化的生物學(xué)過(guò)程，并分布于不同的代謝通路，體現(xiàn)了其多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的治療特點(diǎn)。為此，本研究結(jié)合富集分析結(jié)果及慢性支氣管炎發(fā)病機(jī)制，繪制桿努盡煙治療慢性支氣管炎分子作用機(jī)制的信號(hào)通路圖，主要包括NF-κB、TNF-α、cAMP、IL信號(hào)通路等，并選取了NF-κB、TNF-α通路關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，見(jiàn)圖8。

圖6 關(guān)鍵靶點(diǎn)的GO富集

圖7 KEGG富集排名前15位的信號(hào)通路

圖8 桿努盡煙治療慢性支氣管炎分子作用機(jī)制圖

3.8 大鼠一般情況 正常對(duì)照組大鼠未見(jiàn)明顯癥狀；模型組大鼠毛發(fā)光澤度下降，體質(zhì)量減輕，并伴有咳嗽、喘息等癥狀；與模型組大鼠比較，陽(yáng)性藥物組、桿努盡煙各劑量組大鼠的一般情況均有改善，其中桿努盡煙高劑量組癥狀改善最為明顯。

3.9 大鼠肺組織病理學(xué)改變 正常對(duì)照組大鼠肺泡壁完整均一，細(xì)支氣管上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，排列整齊，未見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組大鼠肺泡壁結(jié)構(gòu)完整性受到破壞，肺泡間和氣管旁有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，細(xì)支氣管上皮細(xì)胞排列不整齊，管腔內(nèi)可見(jiàn)明顯分泌物，提示炎性損傷發(fā)生，造模成功；與模型組比較，陽(yáng)性藥物組大鼠肺泡壁及細(xì)支氣管周圍炎細(xì)胞浸潤(rùn)程度減輕，桿努盡煙低劑量組大鼠炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度較低，細(xì)支氣管上皮細(xì)胞有所改善，桿努盡煙高劑量組大鼠肺組織肺泡壁增厚情況得到改善，炎細(xì)胞浸潤(rùn)程度減輕，管腔內(nèi)分泌物減少，細(xì)支氣管上皮細(xì)胞排列整齊，見(jiàn)圖9。

3.10 桿努盡煙對(duì)大鼠肺組織中TNF-α水平的影響 與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠肺組織中TNF-α水平升高(P<0.05)；與模型組比較，陽(yáng)性藥物組和桿努盡煙各劑量組大鼠組織中TNF-α水平均降低(P<0.05)，見(jiàn)表5。

表5 桿努盡煙對(duì)大鼠肺組織中TNF-α水平的影響

3.11 桿努盡煙對(duì)大鼠肺組織中NF-κB蛋白和mRNA表達(dá)的影響 與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠肺組織中NF-κB蛋白和mRNA表達(dá)升高(P<0.05)；與模型組比較，陽(yáng)性藥物組和桿努盡煙各劑量組大鼠肺組織中NF-κB蛋白和mRNA表達(dá)均降低(P<0.05)，見(jiàn)圖10。

4 討論

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法挖掘苗藥桿努盡煙活性成分，獲得桿努盡煙活性成分5種，分別為3-(4-羥基-3-甲氧苯基)敗脂酸、1-(4-羥基-3-甲氧苯基)乙酮、石吊蘭素、熊果酸、β-谷甾醇，其中熊果酸、石吊蘭素、β-谷甾醇為“桿努盡煙-慢性支氣管炎靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖的核心節(jié)點(diǎn)，具有良好的抗炎、止咳等作用。

PPI網(wǎng)絡(luò)圖篩選出的關(guān)鍵靶點(diǎn)包括ALB、CYP1A1、CYP1B1等，“桿努盡煙-慢性支氣管炎靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖中ALOX5、ABCB1被預(yù)測(cè)為桿努盡煙治療慢性支氣管炎的靶點(diǎn)，其中ALOX5、CYP1B1、CYP1A2等靶點(diǎn)與炎癥密切相關(guān)，而炎癥反應(yīng)作為慢性支氣管炎發(fā)展的核心機(jī)制，提示其可能參與桿努盡煙發(fā)揮治療慢性支氣管炎的作用過(guò)程。

圖9 各組大鼠肺組織切片

注：與正常對(duì)照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。圖10 桿努盡煙對(duì)大鼠肺組織中NF-κB蛋白和mRNA表達(dá)的的影響

為進(jìn)一步探究桿努盡煙治療慢性支氣管炎的作用機(jī)制，進(jìn)行GO富集與KEGG分析，結(jié)果主要包括核受體轉(zhuǎn)錄途徑、色氨酸代謝、花生四烯酸代謝、細(xì)胞色素P450對(duì)異生物質(zhì)的代謝等途徑。核受體超家族包括很多的轉(zhuǎn)錄因子，其中NF-κB是細(xì)胞內(nèi)重要的核轉(zhuǎn)錄因子，能誘導(dǎo)腫瘤壞死因子受體1/2/4，白介素1等表達(dá)，在炎癥和免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要[11-12]。色氨酸作為人體必需的氨基酸，而5-羥色胺(5-HT)代謝途徑是其重要降解途徑，研究表明，5-HT的主要代謝物5-羥基吲哚乙酸(5-HIAA)與炎癥、氧化應(yīng)激等多種免疫反應(yīng)密切相關(guān)[13-14]?；ㄉ南┧?AA)代謝途徑活化會(huì)產(chǎn)生ALOX5、CYP1A1和CYP1B15等因子，進(jìn)而激活TNF-α、IL-1等炎癥因子，刺激花生四烯酸分泌，促使炎癥反復(fù)發(fā)生[15-16]。由此可知，TNF-α、NF-κB參與色氨酸代謝、核受體轉(zhuǎn)錄途徑、花生四烯酸代謝等眾多生物過(guò)程，二者激活，可導(dǎo)致炎癥反應(yīng)，進(jìn)而加重慢性支氣管炎病情，提示桿努盡煙可通過(guò)調(diào)控TNF-α、NF-κB表達(dá)抑制炎癥反應(yīng)，達(dá)到治療慢性支氣管炎的目的。

基于TNF-α、NF-κB靶點(diǎn)初步探究桿努盡煙治療慢性支氣管炎的作用機(jī)制，驗(yàn)證網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果。采用煙熏加脂多糖氣管注射法成功建立慢性支氣管炎大鼠模型，給藥物28 d后，病理切片顯示桿努盡煙能減輕慢性支氣管炎大鼠肺組織炎癥；ELISA、RT-qPCR、Western blot結(jié)果提示桿努盡煙能降低大鼠肺組織勻漿中TNF-α、NF-κB表達(dá)，減緩炎癥反應(yīng)。

綜上所述，本研究體現(xiàn)了桿努盡煙治療慢性支氣管炎多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的作用特點(diǎn)，其可能通過(guò)抑制TNF-α、NF-κB表達(dá)，降低慢性支氣管炎肺部炎癥，進(jìn)而發(fā)揮治療慢性支氣管炎的作用，為深入探究桿努盡煙治療慢性支氣管炎作用機(jī)制及其臨床運(yùn)用提供理論依據(jù)。