崔巧玉沈雯娟孫小璐王梓嫣毛振宇王春麗

（華東理工大學藥學院，制藥工程與過程化學教育部工程研究中心，上海市新藥設計重點實驗室，上海200237）

郁金香Tulipa gesnerianaL.為百合科郁金香屬球根花卉，全世界約有130種，以荷蘭種植的最多［1］，國內(nèi)主要分布在新疆，占全國的70%［2］，其鱗莖具有清熱解毒、散結(jié)化瘀功效，可治療咽喉腫痛等癥狀［3］。目前，對郁金香中化學成分和藥理活性的研究較少［4］，有較大的挖掘空間。

植物多酚是植物體生命活動過程中的次生代謝而產(chǎn)生的多元酚，可從多種植物體中通過各種提取方式得到，提取產(chǎn)物分為黃酮類和非黃酮類，兩者主要存在結(jié)構(gòu)差異，具有抗腫瘤、抗氧化、抗菌等活性，一方面，多酚能直接與體內(nèi)自由基反應，使后者喪失活性；另一方面，該成分能調(diào)節(jié)有機生物體內(nèi)各種氧化酶活性和金屬離子含量，從而調(diào)控生物體內(nèi)自由基濃度［5］。因此，本實驗優(yōu)化郁金香總多酚提取工藝，并考察其抗氧化活性，以期為該藥用植物資源的進一步開發(fā)利用提供參考。

1 材料

1.1 試劑與藥物 福林-酚試劑、十水合碳酸鈉（上海麥克林生化科技有限公司）；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（上海源葉生物科技有限公司）；2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（美國Sigma-Aldrich 公司）；過硫酸鉀（上海安耐吉化學有限公司）；沒食子酸、無水乙醇（國藥集團化學試劑有限公司）。郁金香購于上海雷允上藥店，經(jīng)華東理工大學馬磊教授鑒定為正品。

1.2 儀器 JY5002 電子天平（上海復平儀器儀表有限公司）；UV-1900PC 紫外分光光度計（上海奧譜勒儀器有限公司）；SK331OHP 超聲波清洗儀（上?？茖С晝x器有限公司）；101-0 恒溫干燥箱（滬南電爐烘箱廠）；SHZ-3 循環(huán)水多用真空泵（上海予華分析儀器有限公司）、HH-WO電子恒溫水浴鍋（上海予華分析儀器有限公司）；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海振捷實驗設備有限公司）；WK-400B 高速藥物粉碎機（山東精誠機械有限公司）。

2 方法

2.1 提取工藝優(yōu)化

2.1.1 總多酚提取 精密稱取5.0 g 粉碎后的郁金香，過30 目篩，置于錐形瓶中，以100 mL 50% 乙醇為溶劑，在60 ℃、180 W 下超聲提取30 min，抽濾，得到粗提物，在60 ℃下減壓蒸餾除去乙醇，去離子水配制成質(zhì)量濃度為50 mg／mL的提取液。

2.1.2 總多酚含量測定 采用福林-酚測定法［6］。精密稱取10 mg 沒食子酸對照品，去離子水溶解并定容至100 mL，得0.1 mg／mL 溶液，分別取1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mL 至25 mL 量瓶中，加入1 mL 福林酚試劑、2 mL 10% Na2CO3試劑，搖晃均勻并定容至4、6、8、10、12、14、16 μg／mL，在25 ℃下反 應1 h后，測定其在765 nm波長處的吸光度（A765）。以沒食子酸質(zhì)量濃度為橫坐標（X），吸光度為縱坐標（A）進行回歸［7］，得方程為A＝0.121X-0.004 5（R2＝0.999 3），在0～16 μg／mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

將“2.1.1”項下提取液在60 ℃下減壓蒸餾除去乙醇，去離子水定容至10 mL 量瓶中，再量取0.5 mL 至25 mL量瓶中，依次加入1 mL 福林-酚試劑、2 mL 10% Na2CO3試劑，混勻后定容，在25 ℃下反應1 h 后測定吸光度。結(jié)果，總多酚含量［8］為130.25 mg／g，藥液終質(zhì)量濃度為10 μg／mL。

2.1.3 單因素試驗 以總多酚含量為評價指標，料液比、乙醇體積分數(shù)、提取時間、提取溫度、超聲功率為影響因素［9］進行單因素試驗，因素水平見表1。

表1 單因素試驗因素水平

2.1.4 Plackett-Burman 設計結(jié)合Box-Behnken 響應面試驗 在單因素試驗基礎上，采用Plackett-Burman 設計（表2）、Box-Behnken 響應面試驗優(yōu)化提取工藝，選取2 個水平（-1、1），設置6 個空白因素進行12 批試驗，測定總多酚含量，重復3次，取平均值，再通過minitab5.2.0 軟件進行方差分析。

表2 Plackett-Burman 設計因素水平

2.2 抗氧化活性研究 參考文獻［10］報道。

2.2.1 DPPH 自由基清除作用 精密稱取DPPH 2 mg，無水乙醇溶解并定容至100 mL，取3 支試管，1 支加入1 mL提取液（1 mol／L）＋4 mL DPPH 溶液，測定吸光度Ai；1支加入1 mL 提取液＋4 mL 無水乙醇，測定吸光度Aj；1 支加入1 mL 50%乙醇＋4 mL DPPH 溶液，測定吸光度Ac，混合均勻，三者均靜置30 min 后在517 nm 波長處進行，平行3次，取平均值，計算DPPH 清除率，公式為清除率＝［1-（Ai-Aj）／Ac］×100%。

2.2.2 ABTS 自由基清除作用 將7 mmol／L ABTS、140 mmol／L過硫酸鉀等體積混合［11］，得到ABTS 溶液，無水乙醇稀釋，在734 nm 波長處測定其吸光度為0.700±0.005，作為ABTS 工作液。取3 支試管，1 支加入4 mL ABTS 溶液＋1 mL 多酚溶液，測定吸光度Ai；1 支加入4 mL無水乙醇＋1 mL 多酚溶液，測定吸光度Aj；1 支加入4 mL ABTS 溶液＋1 mL 去離子水，測定吸光度Ac，混合均勻，三者均靜置6 min 后在734 nm 波長處進行（無水乙醇調(diào)零），平行3次，取平均值，計算ABTS 清除率，公式為清除率＝［1-（Ai-Aj）／Ac］×100%。

3 結(jié)果

3.1 單因素試驗

3.1.1 乙醇體積分數(shù) 選擇乙醇體積分數(shù)為40%、50%、60%、70%、80%，固定其他提取條件不變，按“2.1.2”項下方法測定總多酚含量，結(jié)果見圖1。由此可知，隨著乙醇體積分數(shù)增加，總多酚含量先升后降，在60%時最高，推測可能是其體積分數(shù)過高時大量醇溶性雜質(zhì)開始溶出，溶劑與多酚之間極性差距明顯，兩者親和力下降，導致含量銳減。因此，最優(yōu)乙醇體積分數(shù)為60%。

圖1 乙醇體積分數(shù)對總多酚含量的影響

3.1.2 料液比 選擇料液比為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30，固定其他提取條件不變，按“2.1.2”項下方法測定總多酚含量，結(jié)果見圖2。由此可知，隨著料液比增加總多酚含量先升后降，在1∶25 時最高，推測可能是上述2 種因素相互制約的結(jié)果。因此，最優(yōu)料液比為1∶25。

圖2 料液比對總多酚含量的影響

3.1.3 提取溫度 選擇超聲溫度為30、40、50、60、70 ℃，固定其他提取條件不變，按“2.1.2”項下方法測定總多酚含量，結(jié)果見圖3。由此可知，隨著提取溫度增加，總多酚含量先升后降，在60 ℃時最高，推測可能是溫度過高會引起該成分熱穩(wěn)定性發(fā)生變化，同時乙醇也會揮發(fā)而使其無法穩(wěn)定溶出。因此，最優(yōu)提取溫度為60 ℃。

圖3 提取溫度對總多酚含量的影響

3.1.4 提取時間 選擇提取時間為15、30、45、60、75 min，固定其他提取條件不變，按“2.1.2”項下方法測定總多酚含量，結(jié)果見圖4。由此可知，隨著提取時間延長，總多酚含量先升后降，在45 min 時最高，推測可能是時間過長而導致該成分不穩(wěn)定。因此，最優(yōu)提取時間為45 min。

圖4 提取時間對總多酚含量的影響

3.1.5 超聲功率 設置超聲功率為60、90、120、150、180 W，固定其他提取條件不變，按“2.1.2”項下方法測定總多酚含量，結(jié)果見圖5。由此可知，超聲功率增加能加劇郁金香細胞破壁程度，有利于總多酚的溶出，在180 W時最高。因此，最優(yōu)超聲功率為180 W。

圖5 超聲功率對總多酚含量的影響

3.2 Plackett-Burman 設計 按表2 因素水平進行Plackett-Burman 設計，結(jié)果見表3，方差分析見表4，標準化帕累托圖見圖6。由此可知，模型具有顯著性（P＜0.05），料液比、乙醇體積分數(shù)、提取時間影響程度較大（P＜0.05），依次為料液比＞乙醇體積分數(shù)＞提取時間，而超聲功率、乙醇體積分數(shù)影響程度不明顯（P＞0.05）。

圖6 各影響因素的標準化效果帕累托圖

表3 Plackett-Burman 設計結(jié)果（， n＝3）

表3 Plackett-Burman 設計結(jié)果（， n＝3）

表4 Plackett-Burman 設計方差分析

3.3 Box-Behnken 響應面試驗 根據(jù)Plackett-Burman 設計［12］結(jié)果，固定超聲功率為180 W，提取溫度為60 ℃不變，以總多酚含量（Y）為評價指標，料液比（A）、乙醇體積分數(shù)（B）、提取時間（C）為影響因素，采用Box-Behnken 響應面試驗［13］進行優(yōu)化，因素水平見表5，結(jié)果見表6。

表5 Box-Behnken 響應面試驗因素水平

表6 Box-Behnken 響應面試驗設計與結(jié)果（， n＝3）

表6 Box-Behnken 響應面試驗設計與結(jié)果（， n＝3）

通過Design Expert 軟件對上述結(jié)果進行多元回歸擬合，得方程為Y＝147.32 ＋1.03A＋2.18B＋0.83C＋4.20AB-3.38AC＋1.28BC-7.98A2-8.85B2-5.52C2，方差分析見表7。由此可知，模型極顯著（P＜0.01），失擬項不顯著（P＞0.05），表明其擬合程度較高［14］，誤差較??；R2＝0.961 2，表明相關(guān)性很強；AdjR2與PredR2在合理范圍內(nèi)一致，差異小于0.4，表明模型可很好地解釋大部分因素變化引起的響應值變化；精密值為12.242 5，表明試驗設計合理，滿足檢驗原則，置信度高，適應性好［15］；因素B、AB、AC、A2、B2、C2有顯著影響（P＜0.05），而A、C、BC無顯著影響（P＞0.05）。

表7 Box-Behnken 響應面試驗方差分析

響應面分析［16］見圖7。由此可知，隨著料液比增加，響應值（總多酚含量）先升后降，極值點前的爬升速度大于極值點后的，即料液比在1∶20 一側(cè)的變化速度大于在1∶30 一側(cè)，同時乙醇體積分數(shù)在極值點后的變化使響應值變化更劇烈；隨著料液比增加、提取時間延長，響應值先升后降，曲面圖上有最大點，料液比方向的等高線密度高于提取時間，說明前者影響更顯著；乙醇體積分數(shù)與提取時間存在一個響應指數(shù)的最大點，等高線為圓形，這表明兩者之間有一定的互相作用。

圖7 各因素響應面圖

3.4 驗證試驗 通過Design-expert 軟件，得到最優(yōu)工藝為料液比1∶25.31，乙醇體積分數(shù)58.30%，提取時間43.50 min，超聲功率180 W，提取溫度60 ℃，總多酚含量為145.83 mg／g，考慮到實驗操作可行性，將其修正為料液比1∶25，乙醇體積分數(shù)60%，提取時間45 min，超聲功率180 W，提取溫度60 ℃。按照上述優(yōu)化工藝進行3 批驗證試驗，測得總多酚平均含量為145.16 mg／g，與預測值145.83 mg／g接近（相對誤差為0.46%），表明模型穩(wěn)定可靠。

3.5 抗氧化活性 總多酚對DPPH 自由基的抑制率為96.28%，對ABTS 自由基的清除率為89.90%，表明該成分對上述2 種自由基具有較強的清除作用，能達到較好的抗氧化效果。

4 討論

Plackett-Burman 設計可用最少次數(shù)的試驗來篩選得到影響結(jié)果的顯著變量；Box-Behnken 響應面試驗不僅能通過數(shù)據(jù)擬合來建立各因素與響應值之間的模型方程，還可篩選出最佳工藝，精確度高，預測性好。因此，本實驗將上述2 種方法相結(jié)合來優(yōu)化郁金香總多酚提取工藝，得到最優(yōu)工藝為料液比1∶25，提取溶劑60% 乙醇，提取溫度60 ℃，提取時間45 min，超聲功率180 W，總多酚含量為145.16 mg／g。

多酚是植物中最常見的活性物質(zhì)，具有很強的抗氧化、抗衰老、抗菌、抗炎、降膽固醇、預防心血管疾病等作用［17］。Ibrahim等［18］從郁金香提取液中測定了3 種具有抗氧化和自由基清除活性的化合物含量；本實驗發(fā)現(xiàn)，該藥材含有大量多酚，可能是潛在的抗氧化成分，可為后續(xù)研究提供基礎。