吳志煥，曹丹丹，劉利敏

(1.河北工程技術(shù)學(xué)院，河北 石家莊 050091；2.河北醫(yī)科大學(xué)公衛(wèi)學(xué)院，河北 石家莊 050017；3.惠州市中心人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，廣東 惠州 516000)

高脂血癥是誘發(fā)心血管疾病的高危因素，尤其近來大型流行病學(xué)調(diào)查研究顯示低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)升高與動脈硬化性心血管疾病的發(fā)生密切相關(guān)[1]，2018美國心臟協(xié)會與2019年歐洲動脈粥樣硬化學(xué)會指南中均將控制LDL-C作為I級推薦證據(jù)。臨床上多采用化學(xué)藥物控制血脂，雖然具有較好的療效，但是會對肝臟和腎臟造成損害，長期服用依從性差。天然來源的藥物因其毒副作用較少而成為降脂研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)[2-3]。三七丹參片主要成分包括三七和丹參，是治療心血管疾病中常用的中藥口服片劑，在預(yù)防心血管疾病具有良好價(jià)值[4]。既往研究多認(rèn)為三七丹參片主要作用為活血化瘀，理氣止痛[5-6]，目前尚未有研究系統(tǒng)性闡述三七丹參片能否調(diào)節(jié)載脂蛋白及其生物學(xué)機(jī)制，本文從脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、吸收水平探討三七丹參片調(diào)節(jié)血脂的生物學(xué)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物 40只SPF級C57BL/6小鼠，雌雄各半，體質(zhì)量18～20 g，由河北中醫(yī)學(xué)院提供，動物使用許可證號SYXK(冀)2017-005。

1.2 試劑與藥物 三七丹參片(湖南守護(hù)神制藥有限公司，批號20190117)。三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體(ATP binding cassette transporter A1,ABCA1)兔單克隆抗體、ABCG1兔單克隆抗體，GAPDH鼠單克隆抗體均購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；辣根過氧化物酶HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體購自生工生物工程(上海)股份有限公司；載脂蛋白A1(ApoA1)、ApoB均購自南京建成生物工程研究所；蛋白質(zhì)裂解液購自美國Cell Signaling Technology公司；DNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.3 儀器 CobasC501型全自動生化分析儀(瑞士羅氏公司)，QuantStudio 3型實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)(美國賽默飛世爾公司)。

1.4 動物分組、造模與給藥 將C57BL/6小鼠隨機(jī)分為正常組、模型組及三七丹參片高、低劑量組，每組10只。正常組采用基礎(chǔ)飼料進(jìn)行飼養(yǎng)；模型組和三七丹參片組喂養(yǎng)高脂飼料，飼料組成為基礎(chǔ)飼料52.2%、膽酸鈉0.2%、預(yù)飼料0.4%、碳酸氫鈣0.6%、膽固醇1.2%、豬油15%、蔗糖20%、酪蛋白10%、石粉0.4%。飼養(yǎng)期間可自由飲水，連續(xù)飼養(yǎng)6周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)開始后各組每日均給予普通飼料，自由飲水。給藥組均灌胃給予相應(yīng)藥物，連續(xù)給藥1周；三七丹參片高劑量組給藥劑量為1.35 g/kg(約15倍臨床成人劑量)，低劑量組給藥劑量為0.45 g/kg(約5倍臨床成人劑量)。

1.5 取材 小鼠最后1次給藥后禁食12 h，可自由飲水。麻醉后眼眶取血，離心后取上清，于-80 ℃保存?zhèn)溆?；取血完成后，開胸腔取出小鼠肝臟，擦干血跡后，一半采用4%甲醛固定進(jìn)行檢測分析，另一半于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 血脂水平和肝酶活性的檢測 采用全自動生化分析儀對小鼠血清中血脂水平進(jìn)行檢測，包括低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)；采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測小鼠血清中ApoA1及ApoB水平。

1.7 小鼠肝臟組織形態(tài)學(xué)評估 取各組小鼠石蠟包埋切片，制備HE染色后，顯微鏡下觀察病理學(xué)改變。

1.8 RT-qPCR檢測ABCA1、ABCG1 mRNA表達(dá) 取小鼠肝臟50 mg組織加入500 μL TRIzol后置于勻漿機(jī)低速離心90 s，離心完成后于冰上，加入350 μL氯仿混勻后于室溫下靜置15 min，隨后低溫12 000 r/min離心20 min，轉(zhuǎn)移上清液至EP管中，加入異丙醇500 μL再次低溫高速離心10 min，棄上清液后加入75%乙醇1 000 μL，低溫8 000 r/min離心5 min，重復(fù)2次后，室溫放至乙醇揮發(fā)凈后加入30 μL DEPC水，升溫至65 ℃溶解RNA，靜置5 min后取上清。取2 μL總RNA，加入RNA模板、primer、dNTP混合液、雙蒸水，20 μL反應(yīng)體系下逆轉(zhuǎn)錄cDNA。使用LightCycler@480進(jìn)行qPCR，ABCA1及ABCG1基因引物序列見表1，反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性15 s;隨后95 ℃ 5 s，58 ℃30 s變性；72 ℃延申15 s；重復(fù)42個(gè)循環(huán)；最后95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s溶解。以GAPDH為內(nèi)參，以2-ΔΔCT法計(jì)算相對表達(dá)度，ΔΔCT=(CT實(shí)驗(yàn)組目的基因-CT實(shí)驗(yàn)組GAPDH)-(CT對照組目的基因-CT對照組GAPDH)。

表1 引物序列

1.9 Western blot檢測ABCA1、ABCG1蛋白表達(dá) 取50 mg小鼠肝臟，加入100 μL含有蛋白酶抑制劑的裂解液，勻漿機(jī)中低速勻漿1 min，隨后勻漿液置于冰上繼續(xù)裂解20 min，4 ℃下高速離心20 min，轉(zhuǎn)移上清液至EP管中備用。使用SDS-PAGE凝膠電泳，10%脫脂奶粉常溫封閉2 h后，加入兔抗ABCA1、ABCG1 (1∶1 000)和GAPDH(1∶4 000)置于冰箱中孵育24 h，室溫恢復(fù)后使用PBST洗滌3次，每次5 min，加入二抗 (1∶2 000) 室溫共孵育3 h，PBST洗滌，采用化學(xué)發(fā)光法顯影，結(jié)果用Quantity one軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 三七丹參片對小鼠血脂水平的影響 與正常組比較，模型組小鼠血清中LDL-C、TG、TC水平均升高(P<0.05)，HDL-C水平降低(P<0.05)；與模型組比較，三七丹參片各劑量組小鼠血清中LDL-C、TG、TC水平均降低(P<0.05)，HDL-C水平均升高(P<0.05)，見表2。

表2 各組小鼠血脂水平

2.2 三七丹參片對小鼠載脂蛋白水平的影響 與正常組比較，模型組小鼠血清中ApoB水平升高(P<0.05)，ApoA1水平降低(P<0.05)；與模型組比較，三七丹參片各劑量組小鼠血清中ApoB水平均降低(P<0.05)，ApoA1水平均升高(P<0.05)，見表3。

表3 各組小鼠外周血載脂蛋白水平

2.3 三七丹參片對小鼠肝臟組織中ABCA1、ABCG1 mRNA表達(dá)的影響 與正常組比較，模型組小鼠肝臟組織中ABCA1、ABCG1 mRNA表達(dá)降低(P<0.05)；與模型組比較，三七丹參片各劑量組小鼠肝臟組織中ABCA1、ABCG1 mRNA表達(dá)升高(P<0.05)，見表4。

表4 各組小鼠肝臟組織中ABCA1、ABCG1 mRNA表達(dá)

2.4 三七丹參片對小鼠肝臟組織中ABCA1、ABCG1蛋白表達(dá)的影響 與正常組比較，模型組小鼠ABCA1、ABCG1蛋白表達(dá)均降低(P<0.05)；與模型組比較，三七丹參片各劑量組ABCA1、ABCG1 蛋白表達(dá)均升高(P<0.05)，見表5、圖1。

2.5 三七丹參片對小鼠肝臟組織病理形態(tài)的影響 正常組小鼠肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，形態(tài)光滑，無脂肪堆積或侵蝕病變；模型組小鼠肝細(xì)胞堆疊不致密，包漿疏松化，可見空泡及炎癥性細(xì)胞侵蝕；三七丹參片組可一定程度減少小鼠肝臟組織脂肪病變，且高劑量組保護(hù)效果優(yōu)于低劑量組，見圖2。

表5 各組小鼠肝臟組織中ABCA1、ABCG1蛋白表達(dá)

圖1 各組小鼠肝臟組織中ABCA1、ABCG1蛋白電泳圖

圖2 各組小鼠肝臟病理形態(tài)(HE，×100)

3 討論

高脂血癥典型特點(diǎn)為脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)能力下降[7]，肝臟是體內(nèi)脂質(zhì)代謝的中樞，HDL-C負(fù)責(zé)將攝入脂質(zhì)轉(zhuǎn)移至肝內(nèi)代謝分解為膽汁酸排出體外，而LDL-C參與肝內(nèi)TC轉(zhuǎn)運(yùn)至肝外[8]。本研究顯示，模型組小鼠血清中LDL-C、HDL-C的異常改變，造成TG、TC水平升高；在三七丹參片干預(yù)后，小鼠血脂水平有所改善，且呈現(xiàn)一定劑量依賴性，提示三七丹參片能夠改善高脂血癥小鼠的血脂水平，且機(jī)制可能與脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、分布相關(guān)。

ApoA1作為HDL-C的載體蛋白，能夠結(jié)合游離膽固醇增加其水溶性，從而促進(jìn)轉(zhuǎn)運(yùn)至肝臟而代謝分解[9]，同時(shí)ApoA1能夠激活卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶(LCAT)的活性，正反饋調(diào)節(jié)促進(jìn)TG運(yùn)輸至肝臟[10]。本研究顯示，三七丹參片能夠一定程度逆轉(zhuǎn)高脂血癥小鼠ApoA1水平下降趨勢，結(jié)合血液HDL-C表達(dá)增加情況，推測三七丹參片降低TG、TC水平與調(diào)節(jié)ApoA1表達(dá)相關(guān)。同時(shí)三七丹參片組小鼠ApoB表達(dá)降低，而ApoB作為LDL-C的載體蛋白，能夠促使血管平滑肌細(xì)胞增生，從而加速膽固醇在細(xì)胞內(nèi)的脂化過程，誘導(dǎo)沉淀，上調(diào)LDL-C水平[11]。

膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)初始限速步驟是游離膽固醇及磷脂與肝臟細(xì)胞內(nèi)ApoA1結(jié)合[12]，而位于細(xì)胞膜上的ABCA1就是這一過程關(guān)鍵分子[13]，哺乳動物模型中ABCA1表達(dá)缺失或者功能障礙時(shí)，細(xì)胞內(nèi)ApoA1因無法結(jié)合膽固醇而降解，從而導(dǎo)致血漿中HDL-C水平降低，膽固醇在血管壁沉積[14]。本研究中，模型組小鼠ABCA1 mRNA及蛋白表達(dá)均降低，這也解釋了血清中HDL-C水平下降的原因；而在三七丹參片組中，ABCA1表達(dá)增加，增加ApoA1與膽固醇結(jié)合，一方面抑制肝內(nèi)ApoA1降解，另一方面達(dá)到降低血脂的效果。

ABCG1作為維持細(xì)胞內(nèi)膽固醇和磷脂穩(wěn)態(tài)的重要膜蛋白，促進(jìn)HDL-2、HDL-3及HDL與載脂蛋白結(jié)合，同時(shí)與ABCA1協(xié)同作用，避免肝細(xì)胞內(nèi)膽固醇過量堆積而造成肝損傷[15]。本研究小鼠肝臟組織形態(tài)學(xué)結(jié)果顯示，高脂血癥小鼠肝臟呈明顯脂肪樣病變，細(xì)胞漿氣球狀松化；而三七丹參片組小鼠肝臟病變程度較輕，這可能與ABCG1蛋白的保護(hù)功能相關(guān)，提示三七丹參片可能通過血脂轉(zhuǎn)運(yùn)途徑，對肝臟細(xì)胞起到保護(hù)作用。