汪小玉，李 婷，稅丕先，張家偉，沈驊睿

(1.西南醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，四川 瀘州 646000；2.西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院，四川 瀘州 646000)

仙茅為石蒜科植物仙茅CurculigoorchioidesGaertn.的干燥根莖，具有補(bǔ)腎陽(yáng)、強(qiáng)筋骨、祛寒濕等功效[1]，可用于增強(qiáng)肌腱和骨骼[2]，為歷版《中國(guó)藥典》收載，始載于《雷公炮炙論》[3]，《圣濟(jì)總錄》中記載古方“仙茅丸”可壯筋骨、宜精神[4]。成分研究顯示，仙茅成分主要包括酚及酚苷類[5]、三萜皂苷類[6]、木質(zhì)素類[7]、黃酮類[8]等；藥理研究顯示，仙茅具有抗癌[9]、清除氧自由基[10]、免疫調(diào)節(jié)[11]、抗骨質(zhì)疏松[12]、改善尿毒和腎毒[13]、保肝[14]等作用。

近年來(lái)，黃酮已成為研究熱點(diǎn)，其提取、純化方法也比較成熟，前者主要有酶輔助法、溶劑法、微波輔助法、超臨界CO2萃取法等方法，后者主要有大孔吸附樹(shù)脂/聚酰胺樹(shù)脂吸附法、機(jī)溶劑萃取法、制備型高效液相色譜法、高速逆流色譜法等[15]，并且該類成分具有清除自由基、抗氧化、抑菌作用[16]。目前，對(duì)仙茅的研究大多針對(duì)其酚苷類成分，如仙茅苷，而對(duì)黃酮的涉及較少，文獻(xiàn)報(bào)道有5,7-dimethoxmyricetin-3-O-α-L-xylopyranosyl-(4→1)-β-D-glucopyranoside、3′,4′,5′-三甲氧基-6,7-亞甲二氧基黃酮、2,3,4,7-四甲氧基黃酮[8]。前期報(bào)道，仙茅具有抗胃癌[17]、促進(jìn)成骨細(xì)胞分化[18]等作用，故本實(shí)驗(yàn)采用溶劑提取法、大孔吸附樹(shù)脂吸附法對(duì)該藥材總黃酮提取純化工藝進(jìn)行優(yōu)化，并初步評(píng)價(jià)其抗氧化、抗腫瘤活性，以期為其進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 試劑與藥物 仙茅購(gòu)自成都荷花池中藥材市場(chǎng)，經(jīng)西南醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院莊元春副教授鑒定為石蒜科植物仙茅CurculigoorchioidesGaertn.的根莖。蘆丁對(duì)照品(純度99.47%)，購(gòu)自成都曼斯特生物科技有限公司。D101、X-5、DM-130、AB-8、ADS-17、NKA-9大孔吸附樹(shù)脂，購(gòu)自滄州寶恩有限公司；CCK-8試劑盒，購(gòu)自武漢博士德生物技術(shù)公司；DPPH(C18H12N5O6)，購(gòu)自成都潤(rùn)澤本土化工有限公司；ABTS，購(gòu)自阿拉丁試劑(上海)有限公司；Hoechst33258染色液，購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、青鏈雙抗、PBS、0.25%胰酶消化液，購(gòu)自以色列BI公司；抗壞血酸(Vc)、過(guò)二硫酸鉀、鐵氰化鉀[K3Fe(CN)6]、三氯乙酸、三氯化鐵、無(wú)水甲醇、無(wú)水乙醇，購(gòu)自成都金山化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器 Synergy 2型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀，購(gòu)自美國(guó)BioTek公司；TS2R-LS型倒置熒光顯微鏡，購(gòu)自日本Nikon公司；ML204型電子天平，購(gòu)自梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；BPN-150CRH型CO2培養(yǎng)箱，購(gòu)自上海一恒科學(xué)儀器有限公司；UV-1700PC紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，購(gòu)自上海鳳凰光學(xué)科儀有限公司。

1.3 細(xì)胞 人膽管細(xì)胞型肝癌細(xì)胞HCCC、人宮頸癌細(xì)胞Hela、人乳腺癌細(xì)胞M231均由西南醫(yī)科大學(xué)分子生藥學(xué)實(shí)驗(yàn)室張春教授課題組惠贈(zèng)，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；人骨肉瘤MG-63細(xì)胞(MP-0046)，購(gòu)自河南多沃生物科技有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 總黃酮含量測(cè)定 精密稱取蘆丁對(duì)照品2.50 mg至25 mL量瓶中，60%乙醇溶解定容，分別吸取0.4、0.8、1.6、2.4、3.2、4 mL至10 mL量瓶中，參考文獻(xiàn)[19]報(bào)道的NaNO2-Al(NO3)3-NaOH 法進(jìn)行顯色反應(yīng)，在100～900 nm波長(zhǎng)處進(jìn)行掃描，發(fā)現(xiàn)在500 nm處有最大吸收，故選擇其作為檢測(cè)波長(zhǎng)。以蘆丁質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，吸光度為縱坐標(biāo)(A)進(jìn)行回歸，得方程為A=11.665X+0.039 4(R2=0.999 5)，在4～48 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。仙茅烘干(60 ℃)后粉碎，過(guò)40目篩，稱取10 g，加入20倍量(200 mL)70%乙醇，在85 ℃下回流提取2 h，過(guò)濾后定容至200 mL，取0.8 mL測(cè)定吸光度，計(jì)算含量，公式為含量=C×V/M(C為總黃酮質(zhì)量濃度，V為提取液體積，M為藥材質(zhì)量)。

2.2 提取工藝優(yōu)化

2.2.1 單因素試驗(yàn) 精密稱取仙茅粉末(過(guò)4號(hào)篩)2 g，以料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40)、提取時(shí)間(0.5、1、1.5、2、2.5 h)、提取溫度(60、70、80、90、95 ℃)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(50、60、70、80、90%)為影響因素，考察它們對(duì)總黃酮得率的影響。

2.2.2 正交試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以總黃酮得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)料液比(A)、提取時(shí)間(B)、提取溫度(C)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(D)進(jìn)行考察，因素水平見(jiàn)表1，結(jié)果見(jiàn)表2，方差分析見(jiàn)表3。由此可知，各因素影響程度依次為D>B>A>C，其中B、D有顯著影響(P<0.05)，而A、C無(wú)顯著影響(P>0.05)。綜合考慮成本，最終確定最佳提取工藝條件為A1B3C1D3，即料液比1∶25，提取時(shí)間2.5 h，提取溫度85 ℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)80%。

表1 因素水平

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表3 方差分析

2.2.3 驗(yàn)證試驗(yàn) 取藥材2.0 g，按“2.2.2”項(xiàng)下優(yōu)化工藝進(jìn)行3批驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表4，可知該方法重復(fù)性良好，工藝合理、穩(wěn)定、可行。

2.3 純化工藝優(yōu)化

2.3.1 樣品溶液制備 精密稱取藥材粉末(過(guò)4號(hào)篩)100.0 g，按“2.2.2”項(xiàng)下優(yōu)化工藝提取，減壓濃縮干燥，稱取適量浸膏粉末，加水溶解至3 mg/mL，即得。

表4 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果(n=3)

2.3.2 樹(shù)脂型號(hào)篩選 取預(yù)處理好的6種樹(shù)脂各2.0 g，加入樣品溶液40 mL，室溫下振蕩吸附(90 r/min)12 h，上層液過(guò)濾，作為吸附液；載樣樹(shù)脂中加入70%乙醇40 mL，室溫下振蕩解吸(90 r/min)12 h，濾過(guò)，作為解吸液，測(cè)定吸附液、解吸液中總黃酮得率，計(jì)算靜態(tài)吸附率、解吸率、回收率，結(jié)果見(jiàn)表5。綜合比較后，最終選擇AB-8型樹(shù)脂進(jìn)行純化。

表5 樹(shù)脂對(duì)總黃酮靜態(tài)吸附、解吸性能的影響

2.3.3 樹(shù)脂靜態(tài)吸附/解吸動(dòng)力學(xué)特征 精密稱取預(yù)處理好的AB-8型樹(shù)脂1.0 g，加入20 mL樣品溶液，按“2.3.2”項(xiàng)下方法吸附與解吸，每0.5 h吸取上清液測(cè)定吸光度，計(jì)算吸附率、解吸率，繪制靜態(tài)吸附與解吸曲線，見(jiàn)圖1。由此可知，2 h內(nèi)總黃酮吸附率升高最快，2 h后基本達(dá)到平衡，吸附率為70.31%；1.5 h內(nèi)解吸率升高最快，1.5 h后達(dá)到解吸平衡，解吸率為86%。因此，選擇吸附時(shí)間為2 h，解吸時(shí)間為1.5 h。

2.3.4 各因素對(duì)吸附率與解吸率的影響 取樣品溶液，以上樣液質(zhì)量濃度(0.5、1、2、3、4、5 mg/mL)、上樣液pH值(3、4、5、6、7、8)、上樣體積流量(0.5、1、2 mL/min)、洗脫液(乙醇)體積分?jǐn)?shù)(40%、50%、60%、70%、80%、90%)、洗脫體積流量(0.5、1、2 mL/min)為影響因素，考察各因素對(duì)吸附率、解吸率、總黃酮濃度的影響。由圖2A可知，總黃酮吸附率隨著上樣液質(zhì)量濃度增大先升后降，在3mg/mL達(dá)到最大值，為72.99%，故選擇3mg/mL作為最佳上樣濃度。由圖2B可知，上樣液pH值大于7時(shí)，吸附率迅速下降；為4時(shí)有最大吸附率，為74.18%；但藥材原液pH值為5，吸附率為73.70%，接近最大吸附率，為減少實(shí)驗(yàn)過(guò)程中繁瑣的操作步驟，最終選用pH值為5的原液上樣，同時(shí)流出液中黃酮濃度達(dá)到上樣液中其濃度的10%時(shí)，即為泄漏點(diǎn)[20]，由圖2C可知，上樣體積流量為0.5mL/min時(shí)樹(shù)脂達(dá)到泄漏點(diǎn)的上樣量最大，但綜合考慮吸附效率和吸附時(shí)間，最終確定為1mL/min，上樣體積為40mL，即4BV。由圖2D可知，以50%乙醇解吸時(shí)，解吸率為95.05%，達(dá)到最大值，之后隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增大而逐漸降低，最終選用50%乙醇進(jìn)行洗脫。由圖2E可知，隨著洗脫體積流量的增加，峰型逐漸變寬，洗脫率逐漸降低，但體積流量過(guò)小時(shí)洗脫時(shí)間會(huì)延長(zhǎng)，考慮到工作效率及洗脫效果，選擇1mL/min作為最佳洗脫體積流量，洗脫體積為70mL(即7BV)時(shí)可洗脫完全。

圖1 樹(shù)脂靜態(tài)吸附、解吸曲線

圖2 各因素對(duì)AB-8樹(shù)脂吸附與解吸的影響

2.3.5驗(yàn)證試驗(yàn) 根據(jù)“2.3.4”項(xiàng)下最優(yōu)純化工藝進(jìn)行3批驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)得總黃酮平均純度為40.72%，RSD為0.96%，表明該工藝穩(wěn)定可靠，并且較純化前提高了4.39倍。

2.4 抗氧化活性研究

2.4.1 清除DPPH自由基 參考文獻(xiàn)[21]報(bào)道的方法，將純化前后總黃酮及維生素C用乙醇配制成質(zhì)量濃度為400、200、100、50、25、12.5、6.25、3.125 μg/mL的溶液，分別吸取100 μL于96孔板中，每個(gè)質(zhì)量濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，分別加入等量0.04 mg/mL DPPH溶液，混勻，室溫避光孵育30 min，517 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)每孔吸光度(A)。以維生素C為陽(yáng)性對(duì)照，樣品溶液+無(wú)水乙醇為空白對(duì)照(A0)，無(wú)水乙醇+DPPH為對(duì)照組(A1)，計(jì)算DPPH自由基清除率，利用SPSS軟件計(jì)算總黃酮、維生素C對(duì)DPPH清除率達(dá)到50%時(shí)所需的質(zhì)量濃度，分別用IC50(樣品)、IC50(維生素C)表示，并計(jì)算其抗壞血酸當(dāng)量，用AEAC表示，即100 g仙茅總黃酮的抗氧化能力相當(dāng)于多少毫克抗壞血酸，計(jì)算公式為自由基清除率={1-[(A-A0)/A1]}×100%、AEAC=IC50(維生素C)/IC50(樣品)×105，結(jié)果見(jiàn)圖3、表6。由此可知，純化前后總黃酮對(duì)DPPH自由基的清除能力均呈濃度依賴趨勢(shì)，在相同質(zhì)量濃度下其強(qiáng)弱依次為維生素C>總黃酮純化后>總黃酮純化前，而且純化后的清除能力較純化前提高了2.83倍。

圖3 不同質(zhì)量濃度總黃酮對(duì)DPPH自由基的清除率

表6 總黃酮對(duì)DPPH自由基的

2.4.2 清除ABTS自由基 制備ABTS工作液，方法為用1 mL純水溶解3.84 mg ABTS、0.67 mg過(guò)硫酸鉀，2種溶液按1∶1比例混合，室溫避光反應(yīng)16 h，100 mmol/L pH7.4的PBS緩沖液稀釋21倍，使其在734 nm波長(zhǎng)處吸光度為0.07±0.05。將純化前后總黃酮及維生素C加水制成質(zhì)量濃度為400、200、100、50、25、12.5、6.25、3.125 μg/mL的溶液。按照文獻(xiàn)[22]報(bào)道的方法，吸取樣品、維生素C溶液各20 μL，置于96孔板中，每個(gè)質(zhì)量濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，每孔加入ABTS工作液200 μL，混勻，靜置10 min，在734 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以維生素C為陽(yáng)性對(duì)照，按“2.4.1”項(xiàng)下方法設(shè)置對(duì)照組，計(jì)算ABTS自由基清除率、AEAC，結(jié)果見(jiàn)圖4、表7。由此可知，總黃酮、維生素C對(duì)ABTS自由基的清除能力均與其質(zhì)量濃度呈正相關(guān)，其程度依次為維生素C>總黃酮純化后>總黃酮純化前，而且純化后清除能力較純化前提高了4.12倍。

表7 總黃酮對(duì)ABTS自由基的

2.5 抗腫瘤活性研究

2.5.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將人乳腺癌細(xì)胞M231、人骨肉瘤MG-63細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中，人膽管細(xì)胞型肝癌細(xì)胞HCCC、人宮頸癌細(xì)胞Hela培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，均于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05。圖5 總黃酮對(duì)細(xì)胞存活率的影響

2.5.3 Hoechst 33258法細(xì)胞凋亡染色 參考文獻(xiàn)[22]報(bào)道的方法，設(shè)置對(duì)照組及總黃酮低、中、高劑量組(Hela、HCCC細(xì)胞，35、70、140 mg/L；MG-63細(xì)胞，50、100、200 mg/L；M231細(xì)胞，100、200、400 mg/L)，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的4種細(xì)胞按照5×104/孔密度接種于24孔板中，每個(gè)細(xì)胞每種質(zhì)量濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)貼壁后分組給藥，24 h后加入0.5 mL無(wú)水甲醇，在4 ℃下固定細(xì)胞過(guò)夜，PBS緩沖液洗滌細(xì)胞3次，每孔加入Hoechst 33258染色液0.1 mL避光染色10 min，棄除染色液，加PBS緩沖液洗滌3次，于熒光顯微鏡下觀察拍照，見(jiàn)圖6。由此可知，對(duì)照組中4種細(xì)胞均表現(xiàn)為完整的細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞核大小均勻，呈均一的藍(lán)色淡染；總黃酮組中4種細(xì)胞隨著劑量升高逐漸固縮、碎裂，細(xì)胞核表現(xiàn)出高亮的藍(lán)色濃染，表明該成分對(duì)其均有誘導(dǎo)凋亡作用。

注：A、B、C、D分別為Hela、HCCC、M231、MG-63細(xì)胞圖6 不同劑量下各組細(xì)胞形態(tài)(×200)

3 討論與結(jié)論

DPPH是氮族自由基，比較穩(wěn)定，其溶液呈紫色，在樣品加入時(shí)能捕捉1個(gè)電子與其游離電子配對(duì)，反應(yīng)后溶液變?yōu)辄S色或無(wú)色，可以初步判斷樣品對(duì)DPPH自由基的清除能力；ABTS可與K2S2O8發(fā)生氧化反應(yīng)，生成藍(lán)綠色的ABTS+，加入樣品溶液后又可被氧化為ABTS，變?yōu)闊o(wú)色溶液，吸光度也下降[24]?？寡趸瘜?shí)驗(yàn)結(jié)果表明，仙茅總黃酮的抗氧化能力與其純度和濃度呈正相關(guān)，清除DPPH自由基的能力較清除ABTS+強(qiáng)，但其機(jī)理尚不明確，仍需進(jìn)一步探究。

CCK-8可與細(xì)胞線粒體中的脫氫酶反應(yīng)生成甲臜，后者呈橙黃色，活細(xì)胞數(shù)量越多，其產(chǎn)物的生成量越多，溶液顏色就越深[25]。Hoechst熒光染料能夠穿過(guò)細(xì)胞膜對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色，正常、凋亡細(xì)胞分別呈淺藍(lán)色、高亮藍(lán)色，常用于細(xì)胞凋亡檢測(cè)[26]。仙茅黃酮對(duì)4種腫瘤細(xì)胞株均有不同程度的增殖抑制、凋亡誘導(dǎo)作用，并表現(xiàn)出濃度依賴趨勢(shì)，其能力依次為Hela>HCCC>MG-63>M231，表明該成分是抗腫瘤活性的有效部位，對(duì)該藥材資源的進(jìn)一步利用具有重要意義。后期，課題組將繼續(xù)探究仙茅黃酮抗腫瘤的機(jī)制，以期為相關(guān)新藥開(kāi)發(fā)提供方向。